17 Ritmos Circadianos nas Plantas

Introdução

Desde o início da história da vida na Terra, um dos fatores ambientais mais constantes tem sido a sucessão de dias e noites em ciclos de 24 h. Praticamente todos os organismos (de cianobactérias a humanos) exibem um ou mais ritmos circadianos, ou seja, oscilações biológicas endógenas com um período de aproximadamente 24 h (circa = cerca, dies = dia). A persistência desses ritmos sob condições ambientais constantes demonstra controle por um relógio circadiano endógeno. Para a maioria dos organismos, o amanhecer significa alimento, seja por fixação de carbono, seja por disponibilidade de presas. Para os organismos predados, por sua vez, o mesmo evento indica a necessidade de preparar defesas contra agressores. O aparecimento do sol também é acompanhado de diversas alterações de variáveis geofísicas, como luz, temperatura, vento etc. Os organismos contam o tempo com o relógio endógeno sincronizado por sinais externos, como as variações ambientais, principalmente as de luz e temperatura.

Em razão da pressão evolutiva geral e antiga das sequências de dias e noites, é provável que relógios circadianos tenham evoluído cedo na história da vida na Terra, e, segundo várias evidências, elementos comuns ao mecanismo fundamental do relógio circadiano parecem ocorrer em organismos evolutivamente distantes, como fungos e mamíferos. A regulação de funções biológicas pelo relógio circadiano tem a finalidade de otimizar processos celulares e fisiológicos em antecipação a modificações periódicas no ambiente de um organismo. Essa regulação das funções biológicas no tempo e a capacidade de antecipação são especialmente importantes em plantas, pois, como organismos sésseis, as plantas precisam responder de modo eficaz às diversas pressões ambientais a que estão sujeitas; a troca de ambiente não é uma opção como no caso de animais.

De fato, as plantas são organismos essencialmente rítmicos. Entre os processos fisiológicos e metabólicos sujeitos a ritmos circadianos, pode-se citar: movimentos foliares e de pétalas (nictinastia e termonastia), fotossíntese, respiração, taxa de crescimento, movimento estomático, fixação de CO2, exsudação radicular, floração, atividade de diversas enzimas, fluxos iônicos, concentração de cálcio citosólico, expressão de genes controlados pelo relógio ou genes circadianos (incluindo diversos genes envolvidos ou não na fotossíntese ou respiração, genes de defesa e resposta a estresses, entre outros). Um exemplo de como a antecipação metabólica e fisiológica conferida pelo relógio circadiano é vantajosa corresponde ao fenômeno da abertura de estômatos e transcrição de diversos genes fotossintéticos (cuja expressão é promovida por luz) algumas horas antes do amanhecer, ainda no escuro. Essa resposta, causada pelo relógio circadiano, tem a vantagem de propiciar pronta assimilação de carbono quando da disponibilidade de luz. Dessa forma, as primeiras horas da manhã, nas quais a demanda transpiratória é menor, são aproveitadas de forma mais eficiente para a fotossíntese.

 

Terminologia e características de ritmos circadianos Ao se estudarem ritmos circadianos, é preciso familiarizar-se com os termos usados para descrever e caracterizar tais ritmos. Ritmos circadianos têm natureza endógena, ou seja, persistem por vários ciclos sob condições constantes (geralmente de luz ou escuro contínuos). A ritmicidade expressa sob essas condições é dita de curso livre e apresenta um período de aproximadamente, mas não exatamente, 24 h. O desvio do período de curso livre de exatamente 24 h é considerado uma evidência de que o ritmo biológico está sob o controle de um sistema endógeno de medição de tempo, que necessita ser ajustado por fatores ambientais para sincronizar-se com o tempo solar. Período é o tempo necessário para completar um ciclo e é geralmente descrito como o tempo de um pico (p. ex., de atividade enzimática) a outro, embora possa ser determinado com quaisquer dois pontos equivalentes em ciclos repetidos. O período define o tipo de ritmo que se estuda. Sua duração permite classificar o ritmo em circadiano, ultradiano (significativamente menor que 24 h ou com mais de um ciclo a cada 24 h), infradiano (significativamente maior que 24 h ou com menos de um ciclo a cada 24 h), sazonal, anual etc. Amplitude é a diferença entre o pico (ou a parte mais basal, também chamada de vale) e o valor médio da onda de oscilação. Em ondas simétricas, a amplitude corresponde à metade do valor da faixa de oscilação (i. e., metade da altura do pico). Em condições constantes, a amplitude do ritmo de curso livre geralmente diminui progressivamente até desaparecer. Esse fenômeno é conhecido como damping na literatura inglesa (amortecimento ou decaimento) e pode ser minimizado se, após alguns ciclos em condições constantes, o sinal externo que sincroniza o ritmo for dado por um ou dois ciclos, retornando-se, a seguir, às condições constantes. Fase corresponde a qualquer ponto no ciclo que pode ser identificado por sua relação com o resto do ciclo. Por exemplo, a posição dos picos é geralmente usada para relações de fase. Diz-se, então, que os ritmos estão em fase quando os picos se sobrepõem ou que tantas unidades de tempo estão fora de fase quando os picos não coincidem. Usam-se também os termos fase diurna e fase noturna. Avanços ou retardos de fase (desvios de fase em relação ao ritmo inicial ou controle) podem ser causados por estímulos ambientais, e a intensidade (número de horas de desvio da posição dos picos antes do estímulo) e direção (avanço ou retardo) de seu efeito dependerão do tempo circadiano de aplicação do estímulo.

Tempo circadiano refere-se ao ciclo de curso livre, ou seja, período de exposição a condições constantes. O tempo circadiano zero (TC 0) corresponde ao momento do último estímulo ambiental antes da entrada nas condições constantes, por exemplo, a última transição escuro–luz antes de entrar em luz constante. A partir de então, conta-se o tempo circadiano na unidade de tempo usual, geralmente horas, TC 12, TC 24, TC 48 etc. Os estímulos ambientais capazes de impor seu período ao ritmo endógeno (sincronizadores externos) são chamados Zeitgebers, do alemão “aquele que dá ou impõe o tempo”. Estes são geralmente transições de luz e, em alguns casos, de temperatura.

A fase do ciclo de curso livre (condições constantes) que corresponderia ao dia em um ambiente normal de luz–escuro é chamada de dia subjetivo, e a fase que corresponderia à noite de noite subjetiva. Normalmente, os ritmos circadianos, como os movimentos nictinásticos das folhas do feijoeiro, estão sincronizados ou acoplados ao ciclo solar de dias e noites. Essa sincronização dos ritmos circadianos aos fatores ambientais é chamada de entrainment ou ajuste e é dada por sinais Zeitgebers, conforme já

descrito. A Figura 17.1 ilustra alguns desses conceitos.

O fenômeno da compensação de temperatura representa outro aspecto importante no estudo de relógios circadianos. Esse termo refere-se ao fato de que o período dos ritmos circadianos geralmente não é afetado de modo significativo por reduções ou aumentos de temperatura na faixa fisiológica. A amplitude dos ritmos é mais afetada por temperatura, mas não o período.

 

Componentes e base molecular do relógio circadiano O relógio circadiano generalizado compõe-se de três partes:

Rotas de transdução de sinais ambientais (input ou entrada de sinais •

ambientais para o gerador de ritmo)

• Gerador de ritmo (oscilador ou mecanismo do relógio) • Rotas de transdução de sinais internos (output ou saída de sinais do

gerador de ritmo para processos circadianos da célula).

Os relógios circadianos mais bem conhecidos são os da mosca Drosophila melanogaster e do fungo Neurospora crassa, modelos mais antigos no estudo de relógios circadianos. Em plantas, a espécie mais conhecida em termos de funcionamento do relógio circadiano é Arabidopsis

thaliana (Figura 17.2).

As rotas de transdução de sinais ambientais ajustam a atividade do gerador de ritmo endógeno e determinam a fase do ritmo de curso livre. Os sinais ambientais são geralmente transições luz–escuro/escuro–luz e mudanças de temperatura. Em plantas, dois tipos de fotorreceptores estão envolvidos na mediação de sinais ambientais luminosos que ajustam o relógio circadiano: fitocromo e criptocromo (um dos receptores de luz azul)

(ver Capítulo 15).

Fitocromo é uma cromoproteína solúvel. O cromóforo (responsável pela absorção de luz) é um tetrapirrol aberto. Alterações causadas pela absorção de luz no cromóforo são transmitidas à apoproteína ligante.

A proteína do fitocromo é codificada por uma família gênica de cinco membros em Arabidopsis (PHYA, PHYB, PHYC, PHYD e PHYE). Diferentes eventos de fototransdução podem ser mediados por diferentes tipos de fitocromo, por exemplo, dependendo das características do ambiente (proporção vermelho/vermelho-extremo). As diferenças entre os fitocromos parecem residir na porção N-terminal, onde está localizado o cromóforo. O C-terminal é responsável pela ação do fitocromo. Todos os tipos de fitocromo existem em duas formas: Fv (absorve no vermelho, 660 nm) e Fve (absorve no vermelho-extremo, 730 nm). A forma sintetizada em plantas estioladas é Fv, mais estável. As formas são interconversíveis

(Figura 17.3), e a versão considerada ativa é o Fve.

 

Figura 17.1 Ritmo circadiano típico. Os picos representam máximos de atividade de um fenômeno circadiano (p. ex., atividade enzimática); e os vales, mínimos de atividade. Os primeiros dois ciclos de 24 h correspondem a condições de dia e noite. Os demais ciclos ocorrem em condições contínuas (curso livre). O período do primeiro ciclo em condições constantes é chamado período de transição. O período de curso livre é próximo, mas não exatamente de 24 h. Noites e dias subjetivos indicam a posição de dias e noites, caso as condições permaneçam em alternância de períodos de luz e escuro. A letra “a” corresponde a duas amplitudes (altura do pico de oscilação). Após alguns ciclos em condições constantes, é comum a redução de amplitude (damping ou amortecimento).

Figura 17.2 Componentes básicos do relógio circadiano: vias de entrada, mecanismo central e vias de saída. Os sinais sincronizadores principais são luz (percebida pelos fotorreceptores fitocromo e criptocromo) e temperatura. Os receptores sinalizam ao mecanismo central constituído por proteínas do tipo fatores de transcrição (capazes de se ligar ao DNA). Esse mecanismo central pode envolver uma ou mais proteínas, que podem interagir e sofrer diversas modificações. Os componentes do mecanismo central conseguem autorregular sua transcrição (barras nos círculos). O tempo bioquímico resultante do conjunto de autorregulações e interações entre componentes centrais do relógio corresponde a cerca de 24 h. Esse ritmo é transmitido a vários genes, que passam a ser expressos de forma circadiana mediante ação das proteínas centrais, que são principalmente fatores de transcrição. O período, a fase de maior atividade e a amplitude dos ritmos poderiam variar com o caminho seguido entre entrada, oscilador e saída, entre os vários possíveis esquematizados. Adaptada de McClung (2001).

 

O criptocromo é também uma cromoproteína, mas apresenta dois cromóforos derivados da flavina por molécula. É evolutivamente relacionado com as fotoliases (enzimas de fotorreparo de DNA em bactérias) e absorve na faixa do azul e UVA. Ocorre em animais, incluindo humanos. Em plantas, caracteriza-se por um longo C-terminal.

Por meio de rotas de transdução, os sinais ambientais afetam a transcrição dos genes que constituem o gerador de ritmo. No caso da percepção de luz pelo sistema fitocromo, diversos mensageiros secundários envolvidos na transdução da informação ambiental do fotorreceptor já foram identificados e incluem proteínas G, GMPc (guanosina monofosfato cíclico), canais de cálcio e Ca-calmodulina. Sabe-se também que alguns membros da família dos fitocromos, como o fitocromo B (PHYB) e o fitocromo A (PHYA), são capazes de entrar no núcleo da célula e ligar-se reversivelmente (dependendo da forma em que se encontram, vermelha – P660 ou vermelho-extrema – P730) aos fatores de transcrição PIF (fatores de interação com fitocromo, do inglês phytochrome interacting factors). Esses fatores (proteínas) estão posicionados nos promotores (sequências nucleotídicas regulatórias) de genes que mantêm a escotomorfogênese, ou seja, o fenótipo de plantas que se desenvolvem no escuro (p. ex., RGA e GAI, os quais impedem a germinação no escuro em algumas sementes fotoblásticas). Os PIF estimulam a transcrição dos genes escotomorfogênicos, contrapondo-se às respostas fotomorfogênicas (p. ex., enverdecimento). Na presença de luz vermelha, o fitocromo vermelho-extremo formado, possivelmente por fosforilação e acionamento de proteólise seletiva de PIF (via ciclo da ubiquitina-proteassomo), causa a inibição da transcrição dos RNA mensageiros (RNAm) de genes indutores de escotomorfogênese, favorecendo a expressão de genes ativados por luz (fotomorfogênicos). Portanto, a luz regula negativamente a função de PIF via fitocromos, ao menos na promoção da fotomorfogênese (Castillon et al., 2007; Su et al., 2017). Embora tenha sido usada anteriormente como exemplo de uma parte da via de sinalização da fotomorfogênese, mecanismos de transdução dessa natureza também parecem ocorrer na sinalização luminosa ao relógio circadiano. Em suas etapas finais, as rotas de transdução de sinais ambientais parecem afetar a transcrição de genes do

gerador de ritmo (ver Figura 17.3).

Figura 17.3 Um dos mecanismos propostos de ação do fitocromo B na ativação da expressão de genes regulados por luz, entre os quais se incluem alguns componentes do mecanismo central do relógio circadiano. Molécula extremamente versátil, o fitocromo pode, após assumir configuração ativa por irradiação com luz vermelha, entrar no núcleo da célula e interagir com fatores de transcrição do tipo PIF3 (ativadores de genes escotomorfogênicos, ou seja, que se contrapõem à fotomorfogênese), acionando sua degradação (proteólise) e, assim, permitindo a ativação de genes responsivos à luz. A interação com PIF3 é reversível por irradiação com vermelho-extremo. Desse modo, fitocromos poderiam atuar como componentes integrais de complexos reguladores de transcrição de genes regulados por luz, permitindo a percepção contínua e imediata de alterações em sinais luminosos, que seriam diretamente informadas e respondidas no núcleo. TATA box: elemento básico de promotores de genes eucarióticos; TF: fatores básicos de transcrição. Adaptada de Martínez-García et al. (2000); Su et al. (2017).

 

Assim como fitocromos, criptocromos (CRY1 e CRY2) podem localizar-se no núcleo celular e interagir com outras proteínas. Sabe-se que criptocromos ativados podem interagir com fator de repressão da fotomorfogênese (COP1, constitutively photomorphogenic ou constitutivamente fotomorfogênico, que, quando mutado, faz com que as plantas cresçam no escuro como se estivessem na luz) e sua proteína parceira (SPA, SPATULA, também um repressor de fotomorfogênese). Quando no escuro, COP1 em interação com SPA impedem a ação de fatores de transcrição (p. ex., HY5 e HFR1) que estimulam a transcrição de genes responsivos à luz, rotulando-os à degradação por ubiquitinação e proteólise. Sob luz azul, uma alteração conformacional, possivelmente envolvendo fosforilação, reduz a concentração de COP1 ativo no núcleo, em parte por desfazer sua interação com SPA, estabilizando HY5 e HFR1, que deixam de ser degradados, podendo, dessa forma, ativar genes de resposta à luz (Jiao et al., 2007; Su et al., 2017). Os fitocromos também participam de um mecanismo semelhante, atuando conjuntamente com os criptocromos, mas ativados pela luz vermelha.

O fitocromo B (phyB) parece ser crítico na determinação da fase circadiana (período do dia de maior atividade de um ritmo circadiano) mediada por luz branca. O mutante oop1 (out of phase ou fora de fase) de Arabidopsis, dotado de defeito no gene PHYB, apresenta um pico de maior atividade para vários ritmos circadianos mais cedo que o tipo selvagem, mas sem alteração significativa de período dos ritmos (tempo entre dois picos máximos de atividade) (Salomé et al., 2002).

O gerador de ritmo é o mecanismo central do relógio circadiano. O modelo mais simples para o mecanismo do relógio circadiano seria um sistema de retroalimentação (feedback) negativa de uma proteína capaz de autorregular sua produção. Em outras palavras, o mecanismo do relógio envolveria a transcrição no núcleo, o processamento do RNAm, a tradução no citosol, a modificação pós-tradução (p. ex., fosforilação) e o transporte para o núcleo da proteína do relógio que autorregularia negativamente sua própria produção. É necessário um tempo de execução dos eventos bioquímicos mencionados, de tal modo que seja promovida uma periodicidade autossustentada de cerca de 24 h. A proteína do relógio afetaria, por exemplo, a expressão de genes controlados pelo relógio circadiano ou proteínas envolvidas no transporte de íons, imprimindo a estes o ritmo gerado.

As rotas de transdução de sinais internos (output) ou saída de sinais do gerador de ritmo para processos circadianos da célula transferem o ritmo gerado pelo mecanismo central do relógio para vários processos biológicos circadianos, incluindo expressão de diversos genes, movimento de íons, movimentos nictinásticos, abertura estomática, atividade de enzimas etc. Nessas rotas de transdução da informação do gerador de ritmo para os processos circadianos, o cálcio parece desempenhar um papel central como mensageiro secundário. Diversos fenômenos circadianos em plantas são regulados por cálcio, incluindo a atividade de muitas cinases de proteínas (que podem alterar a atividade de fatores de transcrição responsáveis pela expressão de vários genes circadianos) e processos circadianos dependentes de canais de potássio ativados por cálcio, como movimentos foliares e abertura estomática. Estudos não invasivos in vivo com plantas transgênicas de Arabidopsis e tabaco, expressando a proteína luminescente sensível a cálcio, a apoaequorina, cujo grau de luminescência varia com a concentração de cálcio, revelaram oscilações circadianas na concentração de cálcio citosólico e cloroplástico (Johnson et al., 1995). Tais oscilações promovidas pelo mecanismo central do relógio parecem controlar diversas

enzimas e processos circadianos. A Figura 17.4 esquematiza um modelo geral muito simplificado de relógio circadiano. Na realidade, acredita-se que componentes do mecanismo central do relógio, frequentemente dotados das características de autorregulação esboçadas, poderiam interagir entre si (em nível de controle transcricional mútuo, splicing diferencial de RNA, fosforilação de proteínas, proteólise seletiva ou interação física proteína– proteína) para gerar o ritmo circadiano central e impô-lo a genes controlados de modo circadiano (ver esquema do mecanismo central de Arabidopsis thaliana descrito no final da seção).

A expressão de genes de plantas controlados pelo relógio circadiano está amplamente documentada. A regulação de genes controlados pelo relógio circadiano tem sido demonstrada em nível de transcrição, tradução e modificação pós-tradução. Para vários genes cuja expressão é circadiana, foram identificadas sequências regulatórias de DNA nos promotores responsáveis por mediar sinais do gerador de ritmo do relógio circadiano (sequências nucleotídicas específicas ou fatores cis). Além disso, foram identificados fatores de transcrição (proteínas ligadoras de DNA ou fatores trans) capazes de promover a transcrição de genes que respondem ao relógio circadiano (por ligação aos fatores cis nos promotores dos respectivos genes). Alguns desses fatores de transcrição fazem parte do mecanismo central do relógio circadiano em plantas (ver a seguir).

Diversos genes controlados pelo relógio circadiano (GCR) codificam proteínas envolvidas no processo fotossintético, como LHCB (proteínas ligadoras de clorofila a e b), subunidade pequena da rubisco, rubisco ativase e anidrase carbônica. Vários genes fotossintéticos comumente apresentam picos de expressão (em geral, medidos como acúmulo de RNAm) no início da manhã subjetiva e um mínimo de expressão no meio da noite subjetiva. Outros GCR não envolvidos no processo fotossintético apresentam picos de expressão em uma fase circadiana distinta da dos genes fotossintéticos. Por exemplo, o gene CATALASE 3 (CAT3) de Arabidopsis tem um pico de expressão no início da noite subjetiva. Estudos envolvendo análise global de expressão gênica mostraram que cerca de um terço dos genes de plantas é regulado de forma circadiana, incluindo as mais diversas categorias funcionais, como genes responsivos a fitormônios, os de resposta a estresse e os de diversas vias biossintéticas. Nesses estudos, também foram encontrados quatro elementos de promotores enriquecidos em sequências regulatórias de genes com quatro fases distintas de expressão (p. ex., elementos nucleotídicos de promotores típicos de genes com pico ao amanhecer e outros típicos de genes com pico ao anoitecer), o que pode contribuir para alterações específicas na abundância de transcritos desses genes em diferentes horários do dia e da noite (Covington et al., 2008).

Diferentes ritmos em um mesmo organismo podem apresentar períodos de curso livre distintos. Por exemplo, o movimento foliar do feijoeiro apresenta um período de cerca de 27 h em condições contínuas, enquanto o ritmo de abertura estomática sob as mesmas condições é de cerca de 24 h. Em mutantes da alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii, o ritmo em fototaxia (migração dos indivíduos em direção à luz da superfície) parece apresentar um período distinto do apresentado pelo RNAm de anidrase carbônica (CAH 1). Esses ritmos de curso livre com períodos distintos têm sido apontados como evidências da existência de mais de um gerador de ritmo nas células de um organismo, sendo grupos de ritmos controlados por diferentes geradores de ritmo. Outra interpretação é a de que existem vários geradores de ritmo interconectados (ou seja, vários sistemas de retroalimentação negativa de proteínas autorreguladas que interagem), sendo um deles dominante (determinaria a fase, ou seja, o tempo do dia ditado pelo relógio circadiano), enquanto os demais seriam dependentes ou “escravos”. Diferentes ritmos estariam acoplados ao gerador de ritmo dominante em maior ou menor grau. Mais recentemente, há evidências de que diferentes células, tecidos e órgãos podem ter diferentes relógios circadianos. Em geral, os tecidos em que mais se expressam genes do relógio são os vasculares. Nas folhas, células-guarda, células epidérmicas e de mesofilo apresentam diferentes relógios. Raízes também têm seu próprio relógio, o qual é bem mais simplificado que aqueles presentes nas partes aéreas. O relógio das raízes pode ser sincronizado pelo aporte de sacarose oriundo da parte aérea. Outros exemplos de acoplamento de relógios incluem tecido vascular e mesofilo. Já a base e a ponta de uma folha geralmente não apresentam relógios acoplados entre si. O acoplamento entre relógios circadianos de uma planta parece apresentar características de rede centralizada ou descentralizada de modo assimétrico (Endo, 2016).

Em Arabidopsis thaliana, foi isolado um mutante circadiano (toc 1-1, timing of cab, ou tempo de expressão do gene da proteína ligadora de clorofila a e b) alterado em um gene que integra o mecanismo central gerador de ritmo. O isolamento do mutante circadiano toc 1-1 envolveu um esquema de seleção altamente engenhoso, desenvolvido por Steve A. Kay et al. nos EUA. Plantas de Arabidopsis foram transformadas com um gene quimera composto do promotor do gene CAB (chlorophyll A/B binding protein, ou proteína ligadora de clorofila a e b, mais recentemente referida como LHCB), expresso de forma circadiana e fusionado à parte codificante do gene da luciferase, enzima capaz de quebrar luciferina gerando bioluminescência. Populações mutagenizadas de plantas carregando essa quimera foram analisadas para periodicidade de bioluminescência após aplicação de luciferina. Um luminômetro indicava a variação na produção de luz que passou a se dar de forma circadiana, pois o promotor da quimera gênica se originava de um gene controlado pelo relógio circadiano. O mutante toc 1-1 apresentava um período mais curto na expressão de CAB, medido como produção de luz, em relação ao tipo selvagem em condições de curso livre. Análises do mutante toc 1-1 mostraram que a mutação confere período curto a vários processos circadianos, incluindo expressão de diversos genes, movimento estomático e foliar, além de afetar a sensibilidade da floração ao comprimento do dia (fotoperiodismo, ver adiante). O efeito da mutação nos processos circadianos parece independer da entrada (input) de luz ao relógio circadiano, envolvendo uma possível alteração no gerador de ritmo propriamente dito ou em uma proteína que atua sobre ele. A clonagem e o sequenciamento do gene TOC 1 revelaram que ele é regulado de forma circadiana, participa de um processo de retroinibição da própria expressão e codifica para uma proteína de localização nuclear que atua como fator de transcrição.

 

Figura 17.4 Esquema muito simplificado de relógio circadiano fictício baseado em um gene, ilustrando o princípio básico de como operaria um marcador de tempo molecular e bioquímico. A luz percebida por fotorreceptores (rotas de transdução externas) sincronizaria o mecanismo gerador de ritmo (círculo) ao ambiente, ativando a transcrição do gene do relógio. Após a transcrição, o processamento e a tradução, a proteína do relógio seria produzida e regularia a expressão de genes controlados pelo relógio (GCR) e/ou a atividade de proteínas transportadoras de íons (p. ex., cálcio), controlando vários processos circadianos (rotas de transdução internas). A proteína do relógio, após acumular-se até certa concentração, pode ser modificada, entrar no núcleo e inibir a transcrição do próprio gene do relógio. O tempo de execução dessas alterações moleculares e bioquímicas é de cerca de 24 h, gerando uma periodicidade autossustentada. Dessa forma, com a autorregulação da proteína do relógio, fecha-se o ciclo circadiano, o qual encontra “um fim no seu início”.

 

Outros dois genes considerados parte do mecanismo do relógio circadiano em Arabidopsis são CCA1 (associado ao relógio circadiano, do inglês circadian clock associated) e LHY (hipocótilo de alongamento tardio, do inglês late elongated hypocotyl). Esses genes codificam fatores de transcrição do tipo MYB (membros de uma família de proteínas ligadoras de DNA) e, quando superexpressos, causam arritmia (abolem ritmos) em múltiplos processos circadianos, como movimentos foliares e abundância de RNA-mensageiro de todos os genes controlados pelo relógio testados até o momento, além de suprimir a própria expressão. Os genes CCA1 e LHY parecem ter funções parcialmente redundantes no mecanismo do relógio. A demonstração de interações de regulação recíprocas entre TOC 1 e os genes do tipo MYB CCA1/LHY indicou que essa regulação interativa faria parte do mecanismo central do relógio circadiano em Arabidopsis (Alabadí et al., 2001).

Genes PRR (pseudorresponse regulators) codificam proteínas com homologia ao domínio receptor de proteínas de transferência de fósforo do tipo histidina-aspartato de bactérias, porém sem apresentar o aspartato aceptor de fósforo. PRR são proteínas ligadoras de DNA. RVE (reveille) faz parte de uma família gênica de fatores de transcrição semelhantes às proteínas MYB. EC (evening complex) corresponde a um conjunto de proteínas codificadas pelos genes ELF3 (early flowering 3), ELF4, LUX (lux arhythmo) e BOA (brother of lux arhythmo, também conhecido como NOX).

Com base nessas informações moleculares e em uma vasta gama de dados da literatura, foi proposto um esquema simplificado do mecanismo central do relógio circadiano em plantas, envolvendo um conjunto de retroinibições interconectadas, constituído de um anel com quatro inibidores que atuam em duas interações diagonais, denominado quadripressilador (Millar, 2016). Segundo esse modelo, cada grupo de genes componentes seria regulado por duas ou três interações inibitórias entre os fatores de transcrição por eles codificados e as sequências promotoras gênicas que estes reconhecem, possibilitando controle separado das fases de aumento e diminuição de atividade. Os genes diurnos LHY/CCA1 e os genes noturnos PRR5 e TOC1 são inibidores mútuos ao longo de uma diagonal. O EC (também noturno) inibe os PRR diurnos (PRR9 e PRR7) ao longo da outra diagonal. A autoinibição dos genes noturnos (PRR5, TOC1 e EC) também contribuiria para a geração de tempo circadiano. Os quatro inibidores organizados em anel no esquema ou os motivos proteicos inibidores de dois membros teriam naturalmente um equilíbrio do tipo interruptor (liga/desliga), indicando que esses tipos de interação combinados, assim como as interações assimétricas entre os

inibidores, contribuem para promover as oscilações circadianas (Figura

17.5).

 

Interação entre relógio circadiano e fotoperiodismo O controle fotoperiódico da floração é mediado por um ritmo circadiano de

sensibilidade à luz (ver Capítulo 18). O controle fotoperiódico da floração (indução floral em resposta ao comprimento dos dias e noites) constitui um claro exemplo de valor adaptativo da antecipação a mudanças ambientais; taxas bem-sucedidas de reprodução serão máximas em condições favoráveis. A importância desses sinais fotoperiódicos não é restrita a plantas de clima temperado. Mesmo em florestas próximas do Equador, onde a variação no comprimento total dos dias e noites é mínima, a variação na hora de amanhecer e anoitecer ao longo do ano está fortemente correlacionada com os períodos de floração sincrônica e bimodal observada em várias espécies arbóreas (Borchert et al., 2005). O sincronismo de floração observado dentro dessas espécies é vital ao sucesso reprodutivo, particularmente considerando-se a grande distância física entre os indivíduos frequentemente observada.

 

Figura 17.5 Esquema de estrutura básica simplificada do mecanismo central do relógio circadiano de Arabidopsis envolvendo quatro inibidores (proteínas ligadoras de DNA do tipo fatores de transcrição); e suas interações (quadripressilador). Setas representam estímulo e barras, inibição. Siglas envoltas por círculos correspondem a proteínas codificadas por genes diurnos (alça diurna); e as envolvidas por retângulos, proteínas codificadas por genes noturnos (alça noturna). A maioria das interações envolve o controle de transcrição, embora outros mecanismos, como splicing alternativo de RNA, proteólise via ubiquitinação e fosforilação, também podem ocorrer. Pela manhã, as proteínas da alça diurna, cujos genes são ativados por fotorreceptores, reprimem os genes da alça noturna. Durante a tarde, as proteínas da alça diurna arrefecem a repressão sobre os genes da alça noturna e promovem sua progressiva ativação. Durante a noite, as proteínas da alça noturna reprimem os genes da alça diurna. Já no final da noite, as proteínas da alça noturna reprimem a transcrição dos próprios genes (autorrepressão), aliviando a inibição dos genes da alça diurna, reiniciando, dessa forma, o ciclo circadiano autossustentável. Adaptada de Millar (2016).

 

Em cevada (Hordeum vulgare cv. Wintex), uma planta de dia longo facultativa, demonstrou-se que, em condições de luz constante, houve uma resposta fotoperiódica à suplementação com luz vermelho-extrema que variou de forma circadiana. A sensibilidade da promoção de floração por suplementação com luz vermelho-extrema é mais e menos pronunciada se aplicada, respectivamente, aproximadamente 6 h antes e 6 h depois do amanhecer subjetivo. Resposta bastante similar foi observada em Arabidopsis thaliana, e, em ambos os casos, não se evidenciou efeito significativo da fotossíntese no processo. Esses e outros resultados com diversas espécies, tanto de dia longo quanto curto, sugerem que a mensuração do comprimento do dia é regulada, ao menos em parte, pelo relógio circadiano, o qual atua como um regulador permissivo da eficiência de elementos das rotas de fototransdução (p. ex., a forma vermelho-extrema do fitocromo). O relógio circadiano controla a eficiência de percepção de luz pelos fotorreceptores da planta, afetando, por conseguinte, a resposta fotoperiódica da floração.

A interação do relógio circadiano com o fotoperiodismo tem sido confirmada com várias evidências genéticas, pois mutantes circadianos como toc 1 a 1 e cca1 tendem a apresentar fenótipos fotoperiódicos (sensibilidade alterada do processo de floração em relação a comprimento de dias e noites). Análises de vários mutantes circadianos de Arabidopsis com fenótipos fotoperiódicos indicam que a integração da informação temporal fornecida pelo sistema circadiano, com discriminação de luz/escuro iniciada por fotorreceptores específicos, dá-se em nível da função da proteína CONSTANS (CO), um importante fator ativador de transcrição, de expressão regulada de forma circadiana, que acelera a floração sob fotoperíodos indutivos, promovendo a atividade de genes-alvo envolvidos no estímulo à floração, como FT – flowering locus t ou locus de floração T (cujo produto proteico é considerado um importante sinal bioquímico de longa distância da indução fotoperiódica nas folhas para o meristema apical; ver Corbesier et al., 2007) e SOC1 – supressor of overexpression of CO1 ou supressor da superexpressão de CONSTANS 1 (Suárez-Lopez et al., 2001).

Um mecanismo de coincidência com o ambiente exterior, baseado no controle circadiano endógeno dos níveis de RNA-mensageiro do gene CO acoplado ao comprimento do dia, parece constituir a base molecular da regulação do tempo de floração em Arabidopsis, uma planta de dia longo facultativa (prefere dias longos para florescer). Durante a maior parte do dia, a concentração de CO é mantida baixa, por causa da ação do fator de transcrição inibidor de CO, CDF1, que bloqueia o promotor de CO. Em dias longos, a proteína FKF1 (flavin binding kelch repeat ou proteína ligadora de flavina com motivo kelch repetido, um sensor de luz azul aparentado com

as fototropinas – ver Capítulo 16) se acumula ao longo do dia, o mesmo ocorrendo com a proteína GIGANTEA (GI, uma proteína nuclear específica de plantas), de modo que ambas atingem um pico de acúmulo ao final da tarde. FKF1 e GI formam o complexo (FKF1-GI), que causa a degradação de CDF1, inibidor de transcrição de CO. O gene CO é expresso ao fim do dia, e a proteína CO induz a expressão de FT, promovendo progressivamente o processo de floração. Em dias curtos, não há horas de luz suficientes para que o complexo FKF1-GI se acumule; assim, CDF1 permanece ativo, CO permanece reprimido, não ocorre indução de FT e a floração é inibida (Sawa et al., 2007; Imaizumi, 2010).

Nesse modelo, a luz não só faria o ajuste do relógio circadiano, mas também atuaria diretamente, promovendo a progressiva expressão de alguns genes de controle da floração. Para plantas de dia curto (p. ex., arroz, Oryza sativa), em que a fase mais crítica para floração é a noturna (número de horas de escuro), descreveu-se uma variação desse mecanismo. O controle circadiano da expressão do gene CONSTANS (ou de seu ortólogo HD1 em arroz) ocorreria tanto em plantas de dia longo quanto nas de dia curto. Porém, a atividade da proteína CONSTANS (ou sua ortóloga HD1 em arroz) sobre FT ou seu ortólogo HD3A em arroz seria no sentido de inibir a transcrição, e não de promovê-la, como é o caso nas plantas de dia longo. Portanto, em plantas de dia curto, somente em fotoperíodos pouco extensos (noites longas) HD3A poderia acumular em quantidade adequada para induzir a floração (Cremer e Coupland, 2003; Song et al., 2015).

 

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