20 Germinação

O que é germinação

Germinação é um conjunto de etapas e processos associados à fase inicial do desenvolvimento de uma estrutura reprodutiva, seja uma semente, um esporo, seja até mesmo uma gema. De maneira tradicional, o termo é aplicado ao crescimento do embrião – particularmente do eixo radicular – em sementes maduras de espermatófitas, embora possa ser estendido a outros eventos, como o crescimento do tubo polínico (grãos de pólen), do rizoide (esporos de pteridófitas) ou de gemas (cana-de-açúcar).

 

Semente

Do ponto de vista biológico, a semente representa o resultado de uma tendência evolutiva à redução do gametófito, que passa de organismo individualizado e autotrófico, como nas briófitas, a “parasito” do esporófito, como nas angiospermas, nas quais o gametófito feminino, também chamado de saco embrionário ou megagametófito, é resultado do crescimento de um esporo (megásporo n) retido dentro do megasporângio (óvulo, 2n). O megagametófito maduro é composto por sete células: na extremidade micropilar ficam a oosfera (gameta feminino haploide) e duas sinérgides, cada qual com um núcleo; na extremidade oposta ficam outras três células, denominadas antípodas; restando uma grande célula central contendo dois

núcleos, chamados polares (Figura 20.1). Já o gametófito masculino (microgametófito) maduro, também chamado de pólen, é composto por uma célula vegetativa maior e uma generativa menor, cada qual com um núcleo. Após a polinização – transferência do pólen da antera para o estigma (extremidade superior do ovário) –, o grão de pólen “germina”, formando o tubo polínico. Os fatores e mecanismos envolvidos na germinação do pólen no estigma ainda não são totalmente conhecidos, mas estudos in vitro mostram que o crescimento do tubo polínico é favorecido pela adição de sacarose, cálcio e boro ao meio de cultura. O crescimento do tubo envolve também a participação de proteínas, como a PSiP (proteína sinalizadora do pólen), uma enzima. Além disso, em pólen de arroz (Oryza sativa) mostrou-se que o gene OsAP65, que codifica uma protease, é essencial para a germinação e o crescimento do tubo. Durante o crescimento do gametófito masculino pelo tecido do ovário, a célula generativa sofre mitose, formando duas células espermáticas, cada qual com um núcleo haploide. No momento da fertilização, quando o tubo polínico atinge o saco embrionário na região da micrópila, uma das células espermáticas se funde com a oosfera, resultando no zigoto (2n), enquanto a outra se une à célula central, quando se fundem os respectivos núcleos (dois núcleos polares + um núcleo espermático), resultando em um único núcleo triploide (3n). Esse núcleo 3n entrará em processo de contínua divisão, sem a formação de paredes, originando inicialmente um endosperma nuclear ou cenocítico que resultará em endosperma celular graças à formação de microtúbulos radiais, deposição de calose e alveolação (formação de pequenas cavidades limitadas por paredes). As sinérgides e as antípodas são degradadas após a fertilização. O processo da dupla fertilização descrito anteriormente é exclusivo das angiospermas. Nas gimnospermas, apenas um gameta participa da fertilização, e, na semente madura, o próprio gametófito feminino servirá como reserva nutritiva ao embrião, cumprindo um papel semelhante ao do endosperma.

Figura 20.1 Ciclo de desenvolvimento de uma angiosperma. Imagem meramente ilustrativa do esporófito. Adaptada de Jones et al. (2013).

 

 

O desenvolvimento do zigoto, formando o esporófito jovem de segunda geração (embrião), dá-se à custa do esporófito anterior ou planta-mãe. Nutrientes oriundos das fontes na planta são descarregados no apoplasto (paredes celulares) dos tecidos adjacentes ao óvulo (p. ex., integumentos e calaza), ocorrendo então o influxo de nutrientes no embrião via apoplasto e/ou simplasto (protoplasto). O conjunto formado pelo embrião, pelo tecido de reserva e pelas estruturas que os envolvem é chamado de semente, o qual, dependendo da complexidade das estruturas envolventes, constitui o diásporo ou a unidade de dispersão. Nas angiospermas, a semente madura é basicamente constituída por três estruturas distintas:

• O embrião, que se desenvolve a partir do zigoto diploide • O endosperma, geralmente triploide • O tegumento ou testa (casca), formado a partir dos integumentos

(geralmente dois) que envolvem o óvulo, sendo, portanto, de origem

materna.

A semente madura de uma gimnosperma, exemplificada pelo pinheiro-do-paraná (Araucaria angustifolia), apresenta organização semelhante, exceto pelo fato de que o próprio gametófito feminino serve como reserva

nutritiva ao embrião (Figura 20.2).

As fases de desenvolvimento do embrião (embriogênese) variam conforme os padrões de divisão e diferenciação celular característicos dos diferentes taxa. No caso do embrião de dicotiledôneas, seu desenvolvimento divide-se em diferentes estágios, de acordo com a forma aproximada que o embrião assume com o aumento do número de células: linear; globular; trapezoidal; cordiforme; torpedo; e embrião maduro. Em monocotiledôneas, o desenvolvimento inicial do embrião é similar ao das dicotiledôneas, havendo nas etapas finais algumas diferenças importantes: o par de cotilédones reduz-se a um único cotilédone modificado, denominado escutelo, que atua como tecido condutor entre o endosperma e o embrião. Além disso, os primórdios da parte aérea e da raiz são protegidos por tecidos especializados denominados, respectivamente, coleoptile e coleorriza. O embrião maduro em geral é formado pelo eixo embrionário (ou eixo hipocótilo-radícula), que apresenta em uma de suas extremidades o primórdio caulinar ou plúmula, e um ou mais cotilédones, e na outra extremidade o primórdio radicular. Este pode ser uma raiz embrionária (radícula), enquanto o primórdio caulinar pode ser um caule embrionário formado por uma gema apical (plúmula) inserida no epicótilo (parte do caule acima da inserção dos cotilédones). A parte do eixo caulinar abaixo dos cotilédones é chamada de hipocótilo (região de transição para a radícula).

O endosperma, por sua vez, completa o desenvolvimento geralmente antes do embrião, absorvendo material nutritivo depositado em outras partes do óvulo. Em dicotiledôneas (como no caso de sementes de feijão), o endosperma celular é consumido pelo embrião durante as etapas de maturação da semente, sendo os principais produtos de armazenamento (lipídios e proteínas) acumulados nos cotilédones (estruturas foliares primárias do embrião), que exercem a função de nutrir o embrião na germinação. Em monocotiledôneas (como grãos de milho), o endosperma persiste após a celularização, acumulando principalmente amido e proteínas de reserva, enquanto o embrião permanece delgado no interior da semente

(Figura 20.2). O endosperma pode ser classificado como oleaginoso (rico em gorduras), córneo (com paredes celulares espessadas, de consistência dura), carnoso (rico em reservas celulósicas, menos compactas), mucilaginoso (com compostos altamente higroscópicos) e amiláceo (constituído basicamente de amido). Nesse último caso, o endosperma apresenta uma camada mais externa, formada por células menores, chamada aleurona. Na fase de germinação da semente, o endosperma é totalmente consumido.

 

Figura 20.2 Seções transversais de sementes de: uma monocotiledônea (Chloris sp., Poaceae) (A); uma dicotiledônea (Phaseolus vulgaris, Fabaceae) (B); e uma gimnosperma (Araucaria angustifolia, Araucariaceae) (C – imagem de Chloris cedida pela Prof. Dra. Vera Lucia Scatena).

 

O revestimento ou a casca (seed-coat) inicia seu desenvolvimento com a fecundação do óvulo, sendo inteiramente formado a partir de tecido diploide da planta-mãe. É constituído pelos tegumentos (testa e tégmen), pelos tecidos calazal e rafeal e, frequentemente, pelo nucelo. De modo generalizado, os termos testa ou tegumento podem ser usados para designar o envoltório das sementes como um todo. A transformação da parede do ovário em envoltório se dá por intermédio de divisões celulares periclinais (responsáveis pelo crescimento em espessura) e anticlinais (responsáveis pelo crescimento em superfície), bem como por alongamento celular. As principais propriedades do revestimento da semente são determinadas durante as fases de maturação e dessecamento. O tegumento representa uma via de troca de matéria entre os meios interno e externo, mas ao longo do desenvolvimento pode lignificar-se, suberizar-se ou cutinizar-se, aumentando a resistência às trocas de gases, de água e de solutos entre a semente e o meio.

 

Desenvolvimento da semente

O desenvolvimento da semente refere-se ao conjunto de modificações pelo qual ela passa durante sua retenção na planta-mãe. Nessa fase, o desenvolvimento é representado por variações quantitativas (crescimento) e qualitativas (diferenciação), sendo dividido em três etapas ou fases:

• Embriogênese ou histodiferenciação • Maturação ou armazenamento

• Dessecação (Figura 20.3).

Figura 20.3 Progressão de alguns eventos citológicos e bioquímicos observados durante a formação e o desenvolvimento da semente, mostrando as fases de histodiferenciação, maturação e dessecação das sementes. Variações quantitativas são representadas pela espessura dos polígonos em verde. Adaptada de Kermode (1995) e Bradford (1994).

 

Histodiferenciação e maturação

A histodiferenciação ou embriogênese é marcada por intenso processo de divisão e diferenciação celular, originando os tecidos do embrião e o endosperma. Também pode ser chamada de fase de divisão celular – ou seja, na fase de histodiferenciação, constrói-se embrião. A suspensão da síntese de DNA e da atividade mitótica marca o fim dessa fase e o início da maturação, conforme observado em sementes de tomate. Cerca de 80% dos genes representados no genoma são transcritos nessa fase e na fase intermediária, coincidindo com uma maior porcentagem de eucromatina (complexo proteínas-DNA ativo). Essa proporção cai para algo em torno de 40 a 45% na fase de maturação, quando ocorrem o aumento da condensação da cromatina e a redução do núcleo. Assim, a regulação dos eventos na histodiferenciação se dá predominantemente no nível de transcrição, mediado por fatores de transcrição (como LEC1, leafy cotyledon 1) e por eventos epigenéticos (não envolvem diretamente transcrição gênica). As

citocininas (ver Capítulo 10) desempenham importante papel nessa fase.

A fase de maturação da semente caracteriza-se pela expansão celular e alocação de substâncias, notadamente proteínas, lipídios e/ou carboidratos, para os tecidos de reserva (os cotilédones ou o endosperma), resultando no aumento da matéria seca na semente em desenvolvimento. Por esse motivo, a fase de maturação também é chamada de fase de armazenamento, preenchimento ou enchimento. O crescimento do embrião nessa fase ocorre por meio do alongamento celular, resultante da captação de água e do acúmulo de reservas. Em geral, o final da fase de maturação, quando a massa de matéria seca da semente atinge o máximo, representa o ponto de maturidade fisiológica.

Estudos realizados com sementes de leguminosas mostram que entre as fases de histodiferenciação e de maturação há uma etapa intermediária ou

de transição (Figura 20.4). Na transição, o embrião até então marcado pela atividade mitótica torna-se diferenciado e acumulador de reservas, em decorrência de mudanças na expressão gênica que levam à operacionalização de vias de resposta a açúcares e hormônios. Uma característica da fase de transição consiste na mudança acentuada da relação entre hexoses (monossacarídios) e sacarose (dissacarídio) no embrião. No início do desenvolvimento (fase de divisão celular), há maior atividade da enzima invertase ácida, ao passo que, na fase de maturação, aumenta-se a atividade da sintase da sacarose, de modo que a relação hexoses:sacarose é alta na fase de divisão e baixa na de maturação. Além da inversão na relação hexose:sacarose, na fase de transição ocorre a indução da expressão de genes associados ao acúmulo de reservas, demonstrada pelo aumento nas

taxas de acúmulo de nitrogênio e amido no embrião (Figura 20.4). Assim, enquanto na fase de divisão os fluxos são dirigidos para a formação de compostos celulares (dreno de utilização), na maturação os metabólitos são direcionados para compostos de reserva (dreno de armazenamento). Finalmente, considerando-se que a demanda energética na fase de divisão é menor que na fase de maturação, a quantidade de energia metabólica disponível sob a forma de nucleotídios de adenina (ATP, ADP e AMP) é baixa na fase de divisão e elevada na maturação. Em suma, na fase de transição, a passagem do crescimento mitótico para o crescimento por expansão celular é acompanhada de mudanças intensas no metabolismo e na distribuição de metabólitos no embrião. Além disso, em sementes de leguminosas, na fase de transição o embrião torna-se verde e fotossinteticamente ativo, o que assegura suprimento extra de oxigênio ao embrião em um ambiente hipóxico.

Figura 20.4 Variação relativa do crescimento e dos níveis de nitrogênio, amido, sacarose e hexoses no embrião de sementes de Vicia fava nas fases de histodiferenciação (pré-armazenamento) e maturação (armazenamento) Fonte: Weber et al. (2005).

 

Dessecação

Ao final da fase de maturação, há um acentuado aumento na taxa de desidratação e a ruptura das conexões tróficas da semente com a planta, ocorrendo forte redução do metabolismo no embrião. Essa perda progressiva de água deve ser controlada com precisão, permitindo à semente sobreviver no estado desidratado após a dispersão. Ao final dessa fase, chamada de dessecação, as sementes em geral atingem o estágio ótimo para a dispersão, ou para a coleta e o beneficiamento pelo homem. Na etapa de dessecação, ocorre a ruptura entre o metabolismo direcionado ao desenvolvimento e aquele voltado à germinação. Enquanto a via para o desenvolvimento é predominantemente anabólica e marcada pelo acúmulo de energia potencial nos tecidos de reserva da semente, na germinação predominam os processos catabólicos e a mobilização da energia acumulada, retomando-se o crescimento do embrião. A fase de dessecação normalmente é mais acentuada em frutos secos, como em Phaseolus vulgaris (feijão), mas também pode ser observada em frutos carnosos, como Cucumis anguria (maxixe). Embora não haja consenso, o critério mais simples para marcar o início da fase de desidratação ou dessecação consiste na estabilização da massa de matéria seca, quando o embrião e/ou o endosperma param de acumular reservas. Com base nesse critério, observa-se que o início da fase de desidratação, em relação ao tempo total de desenvolvimento da semente, varia bastante dependendo da espécie,

conforme ilustrado na Figura 20.5.

O processo de desidratação na fase final da maturação é característico das sementes classificadas como ortodoxas, capazes de serem armazenadas por períodos relativamente longos. Em algumas espécies, como Hevea brasiliensis (seringueira), as sementes não sofrem desidratação acentuada ao final da maturação, sendo dispersas com conteúdos de água elevados (da ordem de 30 a 40%) e estando, dessa forma, sujeitas a estresse hídrico e perda da viabilidade. Tais sementes são denominadas recalcitrantes.

Do ponto de vista fisiológico, a fase de dessecação é importante para o embrião tolerar níveis baixos de água (cerca de –150 Mpa) no período pós-dispersão e retomar o crescimento durante a germinação. Sementes removidas da planta-mãe e submetidas à secagem antes de completarem seu ciclo de desenvolvimento podem germinar se tiverem atingido a condição de tolerância à dessecação, adquirida gradualmente ao longo do desenvolvimento e perdida na fase de germinação. A tolerância à dessecação pode ser definida como a capacidade do sistema vivo de sobreviver à desidratação celular, até concentrações de água da ordem de 0,1 g por grama de tecido (base massa seca) ou menores, por período relativamente prolongado. Sementes de tâmara encontradas em escavações em Israel germinaram após cerca de 2 mil anos. No caso da semente, a desidratação pode alcançar algo em torno de 90% do conteúdo de água inicialmente presente nos tecidos.

Durante essa fase tardia da maturação, a semente vai adquirindo longevidade cada vez maior, que atinge o pico pouco antes do estado “seco”, que antecede a etapa da dispersão. Quando o conteúdo de água na célula cai abaixo de 0,1 g de água por grama de massa seca, o citoplasma passa ao chamado “estado vítreo”, com viscosidade extremamente elevada (da ordem de 1014 Pa.s–1). Nesse estado, a mobilidade molecular é severamente reduzida, assim como as taxas de difusão, desfavorecendo reações químicas deletérias e causando hipobiose, condição em que as trocas de matéria e energia entre a semente e o meio ocorrem em velocidades extremamente baixas. Há evidências, contudo, da existência de “ilhas” de maior concentração de água localizadas, por exemplo, no interior da mitocôndria e dos plastídios. Isso indicaria um meio intracelular vítreo não homogêneo, com densidade variável, com bolsões suficientemente fluidos para permitir reações químicas em tecidos com elevado grau de desidratação e considerados tolerantes ao dessecamento.

Figura 20.5 Duração relativa das fases de embriogênese (barras horizontais rosadas), maturação (barras laranjas) e dessecamento (barras verdes). Adaptada de Leprince et al. (2016).

 

Entre os principais eventos fisiológicos e bioquímicos associados à fase de desidratação, destacam-se: degradação de pigmentos fotossintéticos; mudanças no conteúdo e na composição de açúcares solúveis; condensação da cromatina; indução de proteínas de choque térmico (HSP); e acúmulo de

proteínas LEA (abundantes nas fases tardias da embriogênese; Figura 20.6).

 

Degradação de pigmentos

Uma das alterações mais visíveis associadas à fase final da maturação é a degradação de pigmentos fotossintéticos, particularmente clorofilas e carotenoides. As razões fisiológicas disso ainda não são claras, acreditando-se que, no caso das clorofilas, sua retenção possa ser prejudicial à longevidade da semente, ou, então, que produtos da quebra da clorofila possam ser usados como substratos para a síntese de tocoferóis, agente antioxidante envolvido na longevidade. Em sementes de Arabidopsis, a degradação de clorofila é regulada pelo ácido abscísico (ABA), por meio do fator de transcrição ABI3 (ácido abscísico 3), uma vez que sementes de mutantes abi3 permanecem verdes ao final da maturação. ABI3 ativa a expressão de genes que codificam enzimas que degradam a clorofila, como

NYC1 (non-yellow coloring 1) e NOL (non-yellow coloring 1-like; Figura

20.6). Em sementes, a degradação de carotenoides é regulada por dioxigenases, como a NCED (9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase), também envolvida na síntese de ABA.

 

Açúcares

Alterações no conteúdo e na composição de açúcares solúveis também são características da fase de dessecação. Um exemplo consiste no desaparecimento progressivo de hexoses (glicose e frutose) –, monossacarídios que podem reagir com aminoácidos e liberar moléculas tóxicas, comprometendo a longevidade da semente armazenada – acompanhado do aumento de açúcares não redutores (sacarose, arabinose, galactose e rafinose). Não se sabe ainda qual a função da sacarose e da rafinose na semente seca, acreditando-se que elas possam contribuir para a formação do estado vítreo (sólido amorfo) no citoplasma. A estabilidade dessas matrizes vítreas intracelulares se daria graças à interação entre esses açúcares e proteínas LEA, com os filamentos proteicos atuando como elemento de reforço da matriz amorfa de carboidratos, à semelhança da armadura de ferro no concreto armado. A regulação do conteúdo de rafinoses (RFO) ocorre no nível de transcrição durante a fase final de maturação, controlada pelos hormônios ácido abscísico (ABA) e giberelina (AG).

Cromatina

Durante a dessecação, há acentuada redução dos núcleos e condensação da cromatina, fenômeno que não deve ser provocado pela dessecação em si,

mas sim controlado pelo fator de transcrição ABI3 (Figura 20.6). Embora essa “compactação” do DNA não impeça a transcrição, a cromatina condensada pode proteger o genoma contra danos oxidativos ou aqueles causados pela radiação à estrutura da dupla-hélice. Estudos mostram também que modificações na cromatina podem regular os níveis de transcrição de genes associados à dormência de sementes.

 

Proteínas de choque térmico

O programa genético na fase de dessecação envolve também a indução de genes da síntese de HSP (proteínas de choque térmico), as quais devem desempenhar algum papel protetor na longevidade da semente. A expressão desses genes é induzida por fatores de choque térmico (HSF), que atuam na via de sinalização de HSP em situações de estresse, embora, no caso das sementes, o acúmulo de HSP ocorra independentemente do estresse. Na maturação, a expressão das HSP é regulada a montante (“antes” da região codificadora do DNA, ou seja, entre essa região e a extremidade 5’ da fita) por um fator específico de sementes (HSFA9 – heat shock transcription fator 9) expresso exclusivamente no final da maturação. HSFA9 é também controlada pelos fatores ABI3 (abscisic insensitive 3), ABI5 e DOG1 (delay

of germination 1; Figura 20.6).

 

Proteínas LEA

Finalmente, o acúmulo de proteínas LEA (late embriogenesis abundant) representa um marco do final da maturação. Embora essas proteínas apareçam na fase final do desenvolvimento, seus transcritos (RNAm) podem ser detectados 10 a 20 dias antes, indicando que a regulação de sua

quantidade ocorra em nível pós-transcrição (Figura 20.6). Tais proteínas podem estar associadas à tolerância do embrião à dessecação, verificando-se uma coincidência entre a aquisição de tolerância ao dessecamento durante o desenvolvimento de sementes e a síntese e o acúmulo dessas proteínas. Extremamente hidrofílicas e termoestáveis, as proteínas LEA poderiam atuar como sequestradores de íons – como o Fe2+, catalisador da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) – ou como agentes de solvatação de membranas e outras proteínas, protegendo os componentes celulares dos danos decorrentes da falta de água. Embora a maioria dos genes LEA tenha sido identificada em sementes ortodoxas, portanto tolerantes ao dessecamento, essas proteínas, assim como o hormônio ABA, também podem ser encontradas em sementes recalcitrantes (sensíveis ao dessecamento). A presença de proteínas LEA nessas sementes poderia contribuir para aumentar, ainda que em pequeno grau, sua tolerância à desidratação e ao frio. A transcrição de inúmeros genes LEA durante o desenvolvimento é em parte governada por uma rede de fatores de transcrição, incluindo ABI3, ABI4, ABI5 e DOG1.

A tolerância ao dessecamento envolve, portanto, alterações na expressão gênica em função do estado de hidratação do tecido. A síntese de proteínas LEA, bem como de proteínas de choque térmico, pode ser influenciada pelo ABA, conferindo proteção ao embrião contra eventuais danos decorrentes da dessecação. Esse hormônio, quando aplicado exogenamente, restabelece a tolerância à dessecação em mutantes deficientes de ABA.

Figura 20.6 Principais eventos e alguns elementos participantes no estabelecimento da longevidade durante as fases de maturação e dessecação de uma semente dicotiledônea. Caixas verdes representam fatores de transcrição ou proteínas cujos mutantes têm longevidade reduzida; caixas cinza, fatores cuja participação na longevidade é indireta ou carecem de estudos; e caixas rosadas, compostos ou eventos cuja síntese ou ativação é estabelecida. ABI: ABA insensitive (insensível ao ABA); DOG1: delay of germination1 (retardador da germinação 1); GOLS1: galactinol syntase1 (sintase do galactino l); HSFA9: heat shock factor A9 (fator de choque térmico A9); HSP: heat shock proteins (proteínas de choque térmico); LEA: late embryogenesis abundant (abundantes nas fases tardias da embriogênese); NOL: NYC1-like (semelhantes à NIC1); NYC1: non yellow coloring1 (coloração não amarela 1); SNF4b: sucrose nonfermenting subunit4b (subunidade não fermentadora da sacarose4b); SNRK2: sucrose nonfermenting-related kinase2 (cinase não relacionada à fermentação da sacarose 2). Adaptada de Leprince et al. (2016).

 

Controle do desenvolvimento

O desenvolvimento da semente representa um evento complexo, com múltiplos sistemas de regulação e controle, do qual dependerá a capacidade germinativa da semente em resposta ao meio. Conforme os fatores endógenos e/ou externos, ao final do desenvolvimento tem-se uma semente não dormente ou quiescente, ou seja, apta a germinar na maior amplitude possível – respeitando-se os limites impostos por seu genótipo – de condições ambientais; ou uma semente dormente, que necessitará de estímulos ambientais específicos para adquirir plena capacidade de germinação. Este item tratará principalmente de fatores e mecanismos que atuam durante o desenvolvimento da semente e são determinantes para sua competência germinativa. Nesse contexto, serão abordados também alguns mecanismos relativos à indução da dormência, descrita com mais detalhes no item “Dormência”.

 

Viviparidade

A existência do período de dessecação entre as fases de desenvolvimento e germinação sugere que a desidratação influencia a transição do metabolismo celular do modo predominantemente anabólico, característico das fases iniciais do desenvolvimento, para o modo catabólico ou germinativo, típico da semente madura. Existem, entretanto, situações em que a perda de água não constitui pré-requisito para o estabelecimento do metabolismo germinativo, como é o caso de embriões imaturos de várias espécies, que adquirem a capacidade de germinar, quando removidos da semente em desenvolvimento e colocados em água ou meio de cultura. Isso sugere que a competência do embrião para germinar é adquirida já nas primeiras etapas do desenvolvimento, em geral após a fase de histodiferenciação, e que fatores maternos e/ou da própria semente controlam o desenvolvimento do embrião e impedem a germinação da semente na planta-mãe. Assim, concomitantemente à aquisição da capacidade de germinação, a semente deve criar mecanismos que impeçam o crescimento do embrião antes da dispersão. Essa germinação precoce, conhecida como viviparidade, acontece quando tais mecanismos restritivos não estão presentes ou são atenuados, permitindo o crescimento ininterrupto do embrião com a semente ainda ligada à planta. Contudo, quando a ação desses fatores restritivos da germinação perdura após a semente ter atingido sua completa maturidade, há uma semente dormente. A compreensão da cadeia de processos permissivos e restritivos à germinação durante o desenvolvimento da semente é de suma importância, particularmente na área de tecnologia de sementes. Em muitas variedades de cereais (p. ex., trigo, sorgo e cevada), a dormência começa a diminuir na fase final da maturação, antes da coleta. Em outras variedades, entretanto, a redução da dormência inicia-se logo após a maturidade fisiológica, como na cevada, ou mesmo antes, como em certas variedades de sorgo, sujeitando a semente à anomalia conhecida como brotamento pré-coleta (em inglês, PHS, pre-harvest sprouting). Reconhece-se, desse modo, que a dormência é necessária contra o PHS, embora essa característica seja desvantajosa na pós-coleta. Já a ausência total de dormência, exemplificada pelo fenômeno da viviparidade, embora vantajosa para algumas espécies selvagens, como Rhizophora mangle (mangue), pode representar sério problema para espécies agrícolas por permitir a germinação precoce. Diversos genes associados à dormência e à resistência ao PHS têm sido identificados, sendo alguns associados também à coloração do tegumento. Em cevada (Hordeum vulgare) e trigo (Triticum aestivum), os genes MKK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3) e ARGONAUTE 9 (um regulador da metilação do DNA) causam o brotamento pré-coleta (PHS). Além desses, o gene MFT (mother of FT and TFL1), expresso no embrião, foi identificado como regulador do PHS em trigo, reprimindo a germinação precoce.

A viviparidade fornece boas evidências sobre o envolvimento de hormônios vegetais no controle da germinação da semente. Estudos com

mutantes de milho deficientes e insensíveis ao ABA (ver Capítulo 12) e com inibidores da biossíntese de giberelina (AG) demonstram que este último é um regulador positivo da viviparidade. Não por acaso, a inibição da biossíntese de AG simula o efeito da aplicação de ABA, suprimindo a viviparidade. Verifica-se também que o controle desse fenômeno parece estar relacionado com a razão AG:ABA, e não com a quantidade absoluta do hormônio, sugerindo ação antagônica desses hormônios durante o desenvolvimento do grão de milho. Alguns experimentos sugerem que embriões de Rhizophora mangle são relativamente insensíveis ao ABA, necessitando de concentrações relativamente elevadas do hormônio para inibir seu crescimento. Outras evidências do envolvimento do ABA na viviparidade vêm do fato de que mutantes de milho vivíparos contêm menos ABA ou são menos sensíveis ao hormônio que os tipos selvagens, além de esse hormônio inibir a germinação precoce de embriões imaturos em meio de cultura. Desse modo, a manipulação da biossíntese de ABA pode funcionar como ferramenta para aumentar a dormência e suprimir o PHS. Como exemplo, o aumento da expressão de NCED, que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de ABA, tem sido usada para suprimir a germinação de Arabidopsis. Isso acarreta, por sua vez, a necessidade de tratamentos específicos, como o uso de antagonistas do ABA, para recuperar a capacidade germinativa dessas sementes hiperdormentes.

 

Indução da dormência

Como mencionado anteriormente, a viviparidade é resultado da capacidade de crescimento do embrião adquirida na maturação. Entretanto, para que a semente cumpra seu papel como agente disseminador na maioria das espermatófitas, é necessário prevenir a germinação precoce e, ao mesmo tempo, preparar o embrião para sobreviver em ambientes desfavoráveis e para responder a estímulos favoráveis ao crescimento (germinação). Assim, a indução de mecanismos restritivos da germinação é parte integrante do controle do desenvolvimento e da maturação da semente. O ABA sintetizado nos tecidos da própria semente desempenha papel fundamental mantendo o metabolismo do embrião no “modo desenvolvimento” até que o embrião esteja apto para uma germinação bem-sucedida da semente após a dispersão. Esse hormônio, cujos níveis na semente são, em geral, relativamente baixos na histodiferenciação e altos na maturação, atuaria como inibidor da germinação na etapa de expansão celular, além de promover aumento da síntese de proteínas de reserva. Assim, o ABA teria função dupla durante o desenvolvimento, induzindo processos biossintéticos e, ao mesmo tempo, mantendo o embrião em estágio pré-germinativo, por meio da inibição da maquinaria responsável pela hidrólise das reservas. Durante a fase de dessecação, em muitos casos, ocorre decréscimo acentuado na concentração de ABA endógeno, que atinge teores muito baixos na semente madura. O envolvimento do ABA na indução da dormência, bem como no desenvolvimento da semente como um todo, também é demonstrado pelo uso de mutantes com a capacidade de biossíntese ou sensibilidade ao hormônio afetadas (como abi3, nced3 e aba2). Tais mutantes apresentam embriões imaturos ao final do desenvolvimento, baixa expressão do gene LEA, baixa tolerância ao dessecamento e baixos níveis de proteínas de armazenamento em sementes. Entretanto, em geral não há correlação entre os níveis de ABA e o grau de dormência na semente madura, mas sim entre a capacidade de resposta de embriões isolados ao ABA exógeno e o grau de dormência da semente, lembrando que, no caso de Arabidopsis, a remoção dos envoltórios (testa e endosperma) favorece o crescimento do embrião. Mutantes de Arabidopsis thaliana e Nicotiana plumbaginifolia (fuminho) deficientes em ABA são incapazes de entrar em dormência. AG, por sua vez, apresenta efeito antagônico ao do ABA, e mutantes deficientes em AG (como ga1) são incapazes de germinar na ausência de giberelina exógena. Além disso, sementes de mutantes deficientes em GA2 oxidases (GA2ox), que inativam AG, exibem reduzido nível de dormência. Com base em estudos realizados em sementes de Arabidopsis, observou-se que a giberelina degrada RGL2 (RGA-like 2), fator de transcrição que inibe a via de sinalização desse

hormônio (ver Capítulo 11). Em baixos níveis de giberelina, RGL2 promove a biossíntese de ABA. O OPDA (ácido 12-oxo-fitodienoico) – precursor do ácido jasmônico – age como repressor da germinação em Arabidopsis, aumentando a biossíntese e a sensibilidade ao ABA por meio da proteína MFT (mother of FT and TFL1).

Entre os genes que, até o momento, têm sido associados exclusivamente à regulação da dormência e germinação em sementes de Arabidopsis, destacam-se DOG1 (delay of germination 1) e RDO5 (reduced dormancy 5), estando o primeiro envolvido na indução de dormência por temperaturas baixas durante a fase de maturação. DOG1 codifica uma proteína cuja função é ainda desconhecida, acreditando-se que deva atuar inibindo o enfraquecimento do endosperma durante a embebição e favorecendo a dormência imposta pelos tecidos que envolvem o embrião. Há forte correlação entre os níveis das proteínas RDO5 e DOG1 e a dormência em sementes recém-colhidas de Arabidopsis, sendo sua atuação aparentemente independente do ABA. Além disso, a função de DOG1 parece restringir-se à maturação, já que sua expressão é bastante reduzida durante a embebição, primeira etapa do processo de germinação. Curiosamente, demonstrou- se que a região 3’ do gene DOG1 contém promotor autônomo para a transcrição de RNAm não codificante antissenso (asDOG1), que reprime a expressão de DOG1 durante a maturação, atuando, assim, como regulador negativo da dormência.

Além da temperatura, que influencia a expressão de DOG1, o nitrato é um eficiente regulador da expressão gênica durante o desenvolvimento da semente. Nesse caso, o nitrato atuaria reduzindo a expressão de NCED – diminuindo, assim, a biossíntese de ABA – e aumentando a expressão de CYP707A2, gene envolvido no catabolismo desse hormônio. Desse modo, o nitrato consegue reduzir os níveis de ABA na semente e promover a germinação, podendo ser usado durante a embebição para reverter o estado de hiperdormência. O metabolismo do nitrato, por sua vez, também pode estar envolvido na resposta à temperatura, considerando-se que, em Arabidopsis, temperaturas elevadas durante o desenvolvimento estão associadas ao aumento da expressão dos genes NIA1 (redutase do nitrato) e NIR1 (redutase do nitrito) em sementes maduras, sugerindo que a temperatura possa afetar a dormência por meio do metabolismo do nitrato

durante o desenvolvimento da semente (Figura 20.7).

Os envoltórios parecem desempenhar importante papel no controle do desenvolvimento de algumas sementes na fase de divisão celular. Envoltórios jovens de Vicia faba (fava) e ervilha acumulam amido e proteínas, antes de o embrião passar a funcionar como órgão de armazenamento. Qualquer mutação que afete essa atividade armazenadora dos envoltórios impedirá o crescimento do embrião. Essa propriedade dos envoltórios parece estar relacionada com a atividade de enzimas, como invertases e sintase da sacarose, e hormônios, especialmente o ABA. Em Arabidopsis e tabaco, ABA sintetizado nos tegumentos – tecido de origem materna – é translocado para o embrião, evitando o abortamento e promovendo seu crescimento por intermédio da regulação da importação de metabólitos. O aumento da atividade de invertases associadas às paredes do envoltório elevaria a disponibilidade de hexoses para o embrião, estimulando seu crescimento por divisão celular. O ABA controlaria a maturação pela indução de inibidores da invertase, que reduzem os níveis de hexose, cessando as divisões celulares e iniciando a etapa de diferenciação. Além disso, invertases solúveis (INVvc) parecem desempenhar importante papel no decréscimo na atividade de dreno da semente em desenvolvimento. Em situações de estresse, com redução de atividade na fonte, uma maior produção de inibidores de INVvc reduz o consumo de sacarose e, consequentemente, a demanda do dreno por esse metabólito, tendo como resultado a redução no tamanho e/ou no número de sementes. A própria sacarose, cuja concentração aumenta sensivelmente na fase de transição, parece induzir a expressão de genes associados ao armazenamento e à expansão celular, características da fase de maturação. Nessa fase, o controle do metabolismo deixa de ser exercido pela invertase – que consome ATP e eleva a concentração de hexose – e passa para a sintase da sacarose, que eleva o teor do açúcar e economiza ATP.

Em Fabacea, a natureza do tegumento pode influenciar a capacidade de germinação da semente, limitando a absorção de água. A permeabilidade do tegumento nessas sementes está relacionada com a concentração de pigmentos, como taninos, e sementes mais claras em geral são menos dormentes que as mais escuras (com maior pigmentação). Fatores ambientais, principalmente a temperatura, podem influenciar o tegumento. Em Chenopodium, por exemplo, a dormência depende da espessura do tegumento, que, por sua vez, é afetada pelas condições ambientais durante o desenvolvimento. Estudos em Arabidopsis mostram a participação do gene FT (flowering locus) na resposta à temperatura. Nesse caso, sementes mutantes ft exibem elevada dormência quando maturadas a 16°C ou 22°C. Quando a maturação se dá em temperaturas mais elevadas (22°C), a proteína FT do fruto reprime a produção de taninos, tornando o tegumento da semente mais fino e permeável, permitindo germinação mais rápida. Temperaturas mais baixas antes da floração, ao contrário, acarretarão menor produção de FT, mais taninos, tegumentos mais espessos e menos permeáveis e, portanto, germinação mais lenta. Quanto ao efeito da luz, baixas irradiâncias durante a fase de maturação resultam em sementes com maior grau de dormência, enquanto o comprimento do dia não tem efeito, no caso de Arabidopsis. Razões elevadas vermelho-extremo:vermelho (VE:V) também produzem sementes mais dormentes em comparação a

sementes maturadas em baixas razões VE:V. A Figura 20.7 ilustra a participação de alguns fatores na indução da dormência durante o desenvolvimento da semente na planta-mãe.

Como mencionado anteriormente, a capacidade de germinação é adquirida antes de a semente completar todo o seu ciclo de desenvolvimento na planta. Além do ABA, o potencial osmótico relativamente baixo (causado por concentrações elevadas de solutos) dos tecidos adjacentes ao embrião, impedindo o suprimento adequado de água a este, é fator inibitório da germinação durante o desenvolvimento, conforme observado em frutos carnosos como o tomate. O estresse hídrico causado pelo potencial osmótico mais baixo pode aumentar a concentração de ABA no embrião, embora isso nem sempre ocorra. Outras substâncias inibidoras – provavelmente alcaloides – no fruto, como as detectadas em algumas espécies de Psychotria (Rubiaceae), também podem restringir a germinação. Em muitas outras espécies – particularmente arbóreas tropicais –, é possível que outras substâncias (especialmente compostos do metabolismo secundário) atuem durante a fase de desenvolvimento da semente. Em Myroxylon peruiferum (cabreúva), por exemplo, detectou-se a presença de cumarina no fruto e na semente, podendo essa substância estar envolvida na supressão da germinação precoce.

 

Figura 20.7 Modelo simplificado mostrando as ações de alguns fatores endógenos (AG, ABA e taninos) e ambientais (nitrato, luz, frio e calor) sobre a indução de dormência em sementes de Arabidopsis. Setas contínuas indicam regulação positiva (promoção) e setas tracejadas, regulação negativa (inibição) pela luz e temperatura baixa. Elementos mediadores das ações são mostrados dentro das molduras laranja. OPDA: 12-oxo phytodienoic acid (ácido 12-oxofitodienoico); MFT: mother of FT and TFL1 (mãe do FT e TFL1); NCED: nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (dioxigenase do nove-cis-epoxicarotenoide); CYP707A2: cytochrome P701 ABA8’ hidroxilase (hidroxilase do citocromo P701 ABA8’); RGL2: repressor-of-GA-like2 (semelhante ao repressor do GA 2); DOG1: delay of germination1 (retardador da germinação 1); FT: flowering locus T (locus T da floração); NIA1: nitrate reductase1 (redutase do nitrito 1); NIA2: nitrate reductase2 (redutase do nitrato 2); PIL5: phytochrome-interacting factor3-like5 (semelhante ao fator de interação3 com fitocromo 5); ABI3/5: abscisic acid insensitive 3/5 (insensível ao ácido abscísico 3/5).

 

Germinação

Terminologia e tipos

A germinação inicia-se com a entrada de água na semente (embebição) que ativará o metabolismo, culminando no crescimento do eixo embrionário. De acordo com o critério fisiológico, a germinação se completa quando uma parte do embrião, em geral a raiz primária (chamada, nesse estágio, radícula), penetra e trespassa os tecidos que o envolvem. Além desse, existem outros critérios de germinação, como a curvatura gravitrópica da radícula ou a emergência da plântula através da superfície do solo (critério agronômico ou tecnológico).

Se, do ponto de vista fisiológico, a germinação se encerra com a protrusão radicular, em estudos de ecofisiologia, os atributos da plântula também devem ser levados em consideração. A plântula é o resultado da germinação, mas até quando um indivíduo jovem pode ser considerado uma plântula ainda não está bem definido. Um critério morfológico estabelece o uso do termo “plântula” até o surgimento do primeiro eófilo (primeira folha após os cotilédones), quando então a planta entraria na fase juvenil. Outro critério, este de natureza fisiológica, considera plântula enquanto essa depender, predominantemente, das próprias reservas seminais.

No caso das dicotiledôneas, a classificação das plântulas em geral leva em consideração o comprimento do hipocótilo (epígeas ou hipógeas), a exposição dos cotilédones (criptocotiledonar e fanerocotiledonar) e a natureza dos cotilédones (carnosos ou foliáceos). Na germinação epígea, o crescimento do hipocótilo faz com que os cotilédones se elevem acima do solo (p. ex., feijão), enquanto na hipógea o hipocótilo é curto, de modo que os cotilédones permanecem no solo (p. ex., ervilha). Uma plântula é criptocotiledonar quando seus cotilédones permanecem envolvidos pelos tegumentos, como em Virola bicuhyba, e fanerocotiledonar quando estão livres, como em Trema micrantha (candiúva). Finalmente, cotilédones carnosos, exemplificados em Hymenaea courbaril (jatobá), apresentam função principalmente armazenadora de energia, enquanto cotilédones foliáceos, como em Stryphnodendron adstringens (barbatimão), são predominantemente fotossintéticos, fazendo o papel de verdadeiras folhas.

 

Etapas

Embebição

A embebição (hidratação dos tecidos) é um processo físico, relacionado basicamente com as propriedades coloidais e as diferenças de potencial hídrico (Ψω) entre a semente e o meio externo. No início da embebição, o componente matricial (Ψ ) da semente é o principal responsável pela m

difusão da água para o seu interior, mas, com o aumento da disponibilidade de água livre e do metabolismo na semente, o componente osmótico (Ψπ) aumenta sua participação no processo.

Os valores de Ψ em sementes secas são muito variáveis, situando-se entre –50 MPa e –400 MPa, produzindo gradiente de potencial hídrico relativamente elevado entre a semente e um solo com, por exemplo, –2 MPa (próximo ao ponto de murcha permanente de diversas culturas, como a cana-de-açúcar). Entretanto, para que ocorra a embebição, os tecidos que envolvem o embrião precisam ser permeáveis à água. Considerando as estruturas da semente e do fruto, existem sementes com envoltórios impermeáveis (impedem a entrada de água no interior da semente), parcialmente permeáveis (reduzem a velocidade de embebição) ou totalmente permeáveis (não afetam a velocidade de embebição).

Com base na cinética de absorção de água, as etapas da germinação de uma semente não dormente ou com baixa dormência formam uma curva trifásica: na fase I, que constitui a embebição propriamente dita, o teor de água na semente aumenta rapidamente, seguido de estabilização na fase II, mantida até o início da germinação visível (protrusão radicular), quando se inicia a fase III, caracterizada por um segundo aumento na captação de água

em decorrência do crescimento da plântula (ver Figura 20.10 mais adiante).

A rápida entrada de água na fase I causa alterações na permeabilidade das membranas resultadas da mudança do estado gel (na semente seca) para o estado líquido-cristalino, característico das membranas normalmente

hidratadas (Figura 20.8). Essas alterações promovem o vazamento de metabólitos de baixo peso molecular e outros solutos para o meio, sendo essa perda reduzida com o retorno à configuração líquido-cristalina. A pré-umidificação e o aquecimento da semente não hidratada podem reduzir eventuais danos decorrentes da embebição. Alguns carboidratos (especialmente a sacarose) e fosfolipídios (como o N-acetilfosfatidiletanolamina), cuja concentração aumenta durante a embebição de sementes de algodão, podem estar envolvidos na estabilização e no reparo das membranas.

A fase II, ou fase estacionária, caracteriza-se pela estabilização no conteúdo de água e pela ativação de processos metabólicos necessários para o início do crescimento do embrião. A fase II termina com a protrusão da raiz primária através da testa. A duração dessa fase e a quantidade de água absorvida dependem do potencial hídrico do meio, da temperatura e da presença ou não de dormência. Sementes dormentes podem conservar-se na fase II durante meses ou anos, até a quebra da dormência. Nessa fase, o embrião ainda é capaz de suportar a desidratação, característica perdida na fase III, que marca o início do crescimento do eixo embrionário e a retomada da absorção de água. Nas duas primeiras fases, o desenvolvimento se dá sem divisão celular, enquanto a fase III está associada ao crescimento da radícula e ao início da divisão celular no embrião.

 

Figura 20.8 Mudanças de fase das membranas durante a dessecação e a embebição da semente. Adaptada de Oliver et al. (1998).

 

Crescimento radicular

Em sementes de Arabidopsis, a protrusão radicular (após cerca de 32 h do início da embebição) decorrente do alongamento do eixo embrionário e traspassamento do endosperma pela radícula é precedida de uma primeira etapa representada pela ruptura da testa, que ocorre aproximadamente após 25 a 28 h da embebição. Nessa primeira etapa, o crescimento das células corticais da radícula é baixo, e a expansão ocorre inicialmente nas células epidérmicas, movendo-se progressivamente para as camadas mais internas. A direção de crescimento do eixo do embrião é radial, principalmente na epiderme, e se dá nas células subjacentes à região na qual a testa se romperá. Inicialmente, esse crescimento radial limita-se à radícula e à região inferior do hipocótilo; mas, na transição para a etapa de protrusão radicular, o crescimento se expande como uma onda, ao longo do comprimento do eixo, para as regiões superiores do hipocótilo. Nessa fase, o crescimento da célula é predominantemente longitudinal, em particular nas células corticais da região mediana do hipocótilo. Esse crescimento longitudinal é que dará origem à segunda etapa do processo germinativo de Arabidopsis, ou seja, a ruptura do endosperma e a protrusão radicular. O topo da radícula, no qual ocorre a indução da primeira etapa da germinação e o crescimento começa, é o sítio de onde se irradia a expressão gênica relacionada com a promoção do crescimento. A segunda etapa da germinação, por sua vez, é precedida pela expressão gênica na região mediana do hipocótilo, destacando-se EXPAA3 (EXPA3), codificante para