3 Fixação do Nitrogênio

Ciclo do nitrogênio

O nitrogênio (N) é o nutriente obtido do solo necessário em maiores quantidades para as plantas, participando da composição de biomoléculas como proteínas, clorofilas e nucleotídios. O nitrogênio tem sido reconhecido como um importante recurso que influencia o desempenho e a distribuição de espécies vegetais em ecossistemas naturais. Além disso, geralmente é um dos nutrientes que mais limitam o crescimento e a produtividade de plantas cultivadas em sistemas agrícolas.

O nitrogênio está presente nos diversos compartimentos da biosfera, podendo ocorrer em formas como nitrogênio molecular (N ), nitrato (NO –), 2 3 nitrito (NO – 2), amônia (NH3), óxidos de nitrogênio (NOx: NO, NO2 e N2O) e compostos orgânicos nitrogenados (aminoácidos, bases nitrogenadas etc.). O conjunto de interconversões dessas formas nitrogenadas por meio de processos físico-químicos e biológicos compõe o ciclo biogeoquímico do

nitrogênio (Figura 3.1).

A atmosfera constitui um importante reservatório de nitrogênio, e cerca de 78% do seu volume corresponde ao N . Apesar dessa elevada 2 abundância, o N2 não está disponível para as plantas, em virtude da alta estabilidade da ligação tripla covalente entre os dois átomos de nitrogênio. Assim, para que os nitrogênios do N possam ser utilizados no metabolismo 2 vegetal, essa ligação precisa ser quebrada. A transformação do N 2 em compostos nitrogenados mais reativos (NO – 3 ou NH3) é conhecida como fixação do nitrogênio, que pode ocorrer por processos naturais e industriais

(Figura 3.2).

A fixação industrial do nitrogênio se dá pelo processo de Haber-Bosch, no qual altas temperaturas (acima de 400°C), elevadas pressões (acima de 200 atm) e um catalisador metálico (geralmente a base de ferro) são necessários para a síntese de NH a partir de N e hidrogênio molecular (H ) 3 2 2

(Figura 3.2). Esse processo, que é a base para a produção de fertilizantes agrícolas nitrogenados, implica elevado gasto de energia, além dos custos ambientais associados à emissão de CO2.

 

Figura 3.1 Esquema simplificado do ciclo biogeoquímico do nitrogênio, com destaque para as mais importantes interconversões do nitrogênio no solo e na atmosfera. A. Fixação atmosférica do nitrogênio. B. Fixação industrial do nitrogênio. C. Fixação biológica do nitrogênio, por microrganismos simbióticos e de vida livre. D. Absorção de íons nitrato e amônio pelas raízes. E. Amonificação. F. Nitrificação. G. Lixiviação. H. Oxidação anaeróbia do amônio e do nitrito (anamox). I. Desnitrificação. J. Volatilização de amônia e óxidos de nitrogênio pelas plantas. K. Liberação de amônia pela atividade vulcânica. L. Liberação de amônia e óxidos de nitrogênio pela queima de combustíveis fósseis. M. Precipitação de nitrato e amônio pela chuva.

 

Figura 3.2 Processos de fixação atmosférica (à esquerda), biológica (à direita) e industrial (acima) do nitrogênio.

 

O nitrogênio pode ser fixado naturalmente na atmosfera pela ação de relâmpagos. Nesse caso, a energia das descargas elétricas permite a conversão de N 2, oxigênio molecular (O2) e vapor de água a ácido nítrico

(HNO ), que é a forma protonada do NO – (ver Figura 3.2). O nitrogênio 3 3 também pode ser fixado a HNO 3 na atmosfera pelas reações fotoquímicas entre o óxido nítrico (NO) e o ozônio (O ). Em ambos os processos, o 3 HNO3 produzido na atmosfera precipita-se sobre a Terra com a chuva.

No entanto, a maior parte do nitrogênio fixado naturalmente resulta da ação de certos microrganismos procariotos que apresentam o complexo enzimático da nitrogenase. A nitrogenase catalisa a conversão de N e íons 2 hidrogênio (H+) a NH3, em uma reação que demanda elevado aporte de ATP

e fonte de elétrons (ver Figura 3.2). A NH é um gás que, em meio aquoso e 3 pH intracelular, se protona formando o íon amônio (NH + 4). A fixação biológica do nitrogênio pode ser realizada por microrganismos procariotos de vida livre ou que estabelecem interações simbióticas com outros seres vivos, principalmente com algumas espécies de plantas.

Todos os processos de fixação do nitrogênio permitem a entrada de nitrogênio reativo (NO – e NH +) no solo. Esses íons podem então ser 3 4 absorvidos pelas raízes das plantas e utilizados para a síntese de compostos orgânicos nitrogenados, os quais são transferidos aos animais ao longo da cadeia alimentar. Por sua vez, os compostos orgânicos nitrogenados presentes em resíduos ou matéria morta de animais e plantas são decompostos por fungos e bactérias, levando à formação de água, CO 2 e

NH +, no processo denominado amonificação (ver Figura 3.1). 4

Na maioria dos solos bem aerados, o NH + 4 é oxidado a NO – 3 por

bactérias nitrificadoras (ver Figura 3.1). Nesse processo, chamado de nitrificação, o NH + é oxidado inicialmente a NO – por Nitrosomas spp., e 4 2 posteriormente o NO – 2 é oxidado a NO – 3 por Nitrobacter spp. A nitrificação é inibida em solos pobres em O , ácidos ou frios, promovendo o acúmulo de 2

NH + + 4 nessas condições. Enquanto o NH 4 encontra-se adsorvido nas partículas do solo, o NO – 3 tende a permanecer dissolvido na solução do solo, sendo facilmente carreado por lixiviação para o lençol freático.

Diversos processos resultam na transferência de nitrogênio do solo para

a atmosfera (ver Figura 3.1). O NH + – 4 e o NO 2 podem ser oxidados anaerobiamente por bactérias, levando à formação de N , no processo 2 conhecido como anamox. O NO – 3 do solo também pode ser perdido para a atmosfera por desnitrificação, na qual bactérias anaeróbias reduzem o NO – 3 a N2 e NOx, e o nitrogênio retorna à atmosfera. As plantas também podem perder NH e NOx para a atmosfera por volatilização, especialmente após o 3

solo ter sido fertilizado com altos níveis de nitrogênio. Além disso, a atividade vulcânica resulta na liberação de NH 3 na atmosfera, assim como a queima de combustíveis fósseis libera NH 3 e NOx. Os NOx (convertidos em HNO ) e a NH na atmosfera retornam ao solo pela chuva. 3 3

Nas últimas décadas, a agricultura intensiva, a queima de combustíveis fósseis e outras atividades antropogênicas têm levado a alterações no ciclo biogeoquímico do nitrogênio. Em particular, tem-se observado um grande aumento da disponibilidade de nitrogênio reativo na biosfera, o que pode provocar sérios impactos ambientais (Fowler et al., 2013). Além das poluições atmosférica e aquática e suas consequências para a saúde humana, a deposição de nitrogênio reativo em ecossistemas terrestres está relacionada com uma acidificação dos solos e uma redução da biodiversidade vegetal, especialmente em razão da perda de espécies adaptadas a ambientes pobres em nitrogênio.

 

Fixação biológica do nitrogênio

Grande parte do nitrogênio reativo introduzido nos ecossistemas resulta da ação de microrganismos procariotos dos domínios Bacteria e Archaea. Estima-se que 90% do nitrogênio fixado naturalmente decorra do processo de fixação biológica. Os microrganismos capazes de fixar nitrogênio (denominados diazotróficos) apresentam o complexo enzimático da nitrogenase, que catalisa a conversão de N2 em NH3. Os microrganismos diazotróficos podem ser de vida livre, sendo encontrados no solo ou em ambientes aquáticos, sem se associarem diretamente com outros organismos. Outros estabelecem associações simbióticas com outros seres vivos, principalmente com algumas espécies vegetais. Nesse caso, os microrganismos fornecem o nitrogênio fixado diretamente para a planta hospedeira em troca de fotoassimilados. A associação normalmente não é obrigatória, de modo que muitos microrganismos simbióticos podem ser encontrados em vida livre. Similarmente, a planta hospedeira pode se desenvolver na ausência dos microrganismos simbióticos, principalmente se os níveis de nitrogênio disponível no solo forem adequados.

Há uma variedade de associações simbióticas entre plantas e

microrganismos diazotróficos, algumas das quais exemplificadas na Tabela

3.1. Pode ocorrer também a simbiose entre microrganismos diazotróficos e outros tipos de organismos além de plantas, como as que acontecem entre cianobactérias e diatomáceas em ecossistemas marinhos e entre cianobactérias e fungos em líquens.

Tabela 3.1 Exemplos de associações simbióticas entre plantas e microrganismos diazotróficos.

Grupo taxonômico Planta hospedeira Microrganismo Localização

 

Angiospermas Leguminosas Rizóbios Nódulos em raízes

(Azorhizobium, (mais frequente) ou

Bradyrhizobium, caules Mesorhizobium,

Rhizobium e

Sinorhizobium, entre

outros gêneros)

 

Parasponia spp. Rizóbios Nódulos em raízes

(Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium)

 

Espécies actinorrízicas Actinobactérias (gêneros Alnus, (Frankia) Myrica, Casuarina, Rubus etc.)

Gunnera spp. Cianobactérias Glândulas no caule

(Nostoc)

Gimnospermas Cicadáceas Raízes coraloides

 

Pteridó tas Azolla spp. Cavidades nas folhas

 

Brió tas Anthocerophyta Cavidades no talo do

gametó to

 

A simbiose mais comum consiste na associação entre espécies da família Fabaceae (leguminosas) e proteobactérias conhecidas como rizóbios (incluindo os gêneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium,

Rhizobium e Sinorhizobium, entre outros; ver Tabela 3.1). Nesse caso, a infecção com os rizóbios leva ao desenvolvimento de estruturas especializadas denominadas nódulos, os quais abrigam o tecido infectado

pelos microrganismos (Figura 3.3). Os nódulos fornecem um ambiente que favorece os processos de fixação do nitrogênio e troca de nutrientes entre os rizóbios e a planta. Quase sempre os nódulos são formados nas raízes. No entanto, existem exceções em que se formam nódulos caulinares, como ocorre na associação entre Azorhizobium caulinodans e Sesbania rostrata, leguminosa típica de ambientes alagados. São conhecidas mais de 3 mil espécies de leguminosas (principalmente das subfamílias Faboideae e Mimosoideae) que apresentam simbiose com rizóbios.

Figura 3.3 Raízes noduladas de Glycine max (soja). Observar o formato esférico característico dos nódulos determinados. Imagem gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Luciano do Amarante (Universidade Federal de Pelotas).

 

Alguns rizóbios também podem estabelecer simbiose com as árvores não leguminosas do gênero Parasponia (família Cannabaceae). Além disso, actinobactérias (também conhecidas como actinomicetos) do gênero Frankia podem se associar simbioticamente com espécies arbóreas ou arbustivas não leguminosas, como Alnus rubra (amieiro) e Myrica gale

(murta; ver Tabela 3.1). Em ambos os casos, a associação com rizóbios ou Frankia induz a formação de nódulos nas raízes. São conhecidas mais de 200 espécies de plantas (chamadas de actinorrízicas), de oito famílias de angiospermas, que interagem com Frankia, ao passo que todas as cinco espécies do gênero Parasponia podem estabelecer simbiose com rizóbios.

Cianobactérias diazotróficas, em especial as pertencentes ao gênero Nostoc, podem estabelecer interações simbióticas com espécies vegetais de

diferentes grupos taxonômicos (ver Tabela 3.1). Em contraste com as associações entre plantas e rizóbios ou actinobactérias, nas interações planta–cianobactéria não se formam nódulos, e a estrutura vegetal colonizada pelos microrganismos se desenvolve independentemente da infecção. Destaca-se a associação obrigatória entre a pequena pteridófita aquática Azolla spp. e a cianobactéria Nostoc azollae (também denominada Anabaena azollae), que se acomoda em cavidades especializadas das folhas da planta hospedeira. Entre as gimnospermas, as cicadáceas interagem com cianobactérias, localizadas no interior de raízes coraloides da planta

hospedeira.* Já entre as briófitas, a maioria das Anthocerophyta e poucas hepáticas abrigam cianobactérias simbióticas em cavidades no talo do gametófito, enquanto em alguns musgos se observam cianobactérias epifíticas. Outro exemplo é a simbiose entre angiospermas do gênero Gunnera e cianobactérias que entram por glândulas especializadas do caule e se alojam no interior de células corticais. As glândulas são formadas em condições de baixa disponibilidade de nitrogênio no solo, mesmo na ausência de cianobactérias.

Além das interações simbióticas anteriormente descritas, têm sido relatadas associações de bactérias diazotróficas com outras angiospermas, principalmente gramíneas. Essas bactérias podem ser endofíticas, alojando-se no apoplasto de tecidos vegetais, ou associativas, colonizando a rizosfera

ou o rizoplano.* Bactérias diazotróficas, como Gluconacetobacter diazotrophicus e Herbaspirillum seropedicae, foram identificadas no apoplasto de tecidos do caule de Saccharum officinarum (cana-de-açúcar), atuando como endofíticas nessa espécie vegetal. Estudos sugerem que essas bactérias possam contribuir com uma porcentagem considerável do nitrogênio demandado pela cana-de-açúcar (Oliveira et al., 2002). Além disso, a associação de plantas de milho (Zea mays), trigo (Triticum aestivum) e arroz (Oryza sativa) com bactérias diazotróficas, como Azospirillum brasilense, geralmente resulta em uma promoção do crescimento vegetal (Santi et al., 2013). Todavia, não está claro até que ponto esse efeito deriva de uma transferência direta do nitrogênio fixado para a planta ou de outros mecanismos, como a alteração do balanço hormonal, a solubilização de fosfato e a produção de vitaminas pelas bactérias.

 

Formação do nódulo em leguminosas

Sem dúvida, a associação entre rizóbios e leguminosas é a mais estudada das simbioses entre plantas e microrganismos diazotróficos. Inicialmente, acreditava-se que os nódulos de leguminosas decorriam de uma doença. Apenas no fim do século 19, a função dos nódulos na fixação de nitrogênio foi sugerida por Hellriegel e Wilfarth, que observaram que plantas de feijão com raízes noduladas poderiam crescer na ausência de fertilizantes nitrogenados. Desde então, vários pesquisadores têm investigado o mecanismo de formação de nódulos em leguminosas.

Os rizóbios podem viver livres no solo e crescer heterotroficamente na presença de compostos orgânicos. Da mesma forma, as leguminosas podem se desenvolver sem se associar com os rizóbios. Para que a simbiose se estabeleça, é necessário haver uma troca de sinais e um mútuo reconhecimento entre o rizóbio e a planta hospedeira, o que garante especificidade à interação. Essa troca de sinais normalmente é favorecida em solos com baixa disponibilidade de nitrogênio, possibilitando maior formação de nódulos e fixação simbiótica do nitrogênio nessa condição. Os processos de reconhecimento planta-rizóbio, infecção da raiz e desenvolvimento do nódulo envolvem um grupo de genes específicos do rizóbio (genes nod) e da planta hospedeira (genes que codificam nodulinas).

Primeiro, o rizóbio necessita multiplicar-se próximo à superfície da raiz antes de se aderir a esse órgão. Substâncias exsudadas pelas raízes podem estimular a multiplicação do rizóbio e sua migração em direção à rizosfera

da planta hospedeira (Figura 3.4). Entre as principais moléculas sinalizadoras liberadas pelas raízes das leguminosas, encontram-se alguns flavonoides, que são compostos fenólicos provenientes do metabolismo secundário vegetal. Flavonoides específicos são reconhecidos pela proteína NodD, expressa constitutivamente pelo rizóbio. Após a ligação com os flavonoides, a proteína NodD é ativada e atua como um fator de transcrição, ligando-se a regiões conservadas do DNA conhecidas como nodbox e induzindo a expressão de outros genes nod do rizóbio.

A transcrição dos genes nod leva à produção de enzimas associadas à biossíntese dos fatores Nod, que são oligossacarídios de lipoquitina com

função sinalizadora (Figura 3.4). Cada fator Nod apresenta um esqueleto de 3 a 6 unidades de N-acetil-D-glicosamina com ligações beta-(1S4), característico da quitina, em cuja extremidade não redutora se encontra ligado um ácido graxo. Os genes nod comuns (nodA, nodB e nodC), encontrados em todos os rizóbios, codificam enzimas associadas à síntese da estrutura básica dos oligossacarídios de lipoquitina. Já os genes nod hospedeiro-específicos (nodE, nodF, nodG etc.), cuja presença varia entre as espécies de rizóbio, codificam enzimas envolvidas na modificação do ácido graxo e na adição de grupos laterais aos fatores Nod, como sulfato ou açúcares. A estrutura química dos fatores Nod é crucial para o reconhecimento entre o rizóbio e a planta hospedeira, adicionando especificidade à interação simbiótica, além da composição dos exsudatos das raízes.

Os fatores Nod produzidos pelos rizóbios se ligam a proteínas receptoras da leguminosa, muitas vezes encontradas nos pelos das raízes. Cada espécie de leguminosa hospedeira responde a um fator Nod específico. Assim, espécies de rizóbios com uma faixa ampla de plantas hospedeiras produzem diferentes tipos de fatores Nod, em contraposição àquelas que apresentam maior especificidade. Além dos fatores Nod, a especificidade da associação simbiótica envolve a interação entre lectinas do pelo radicial com polissacarídios da superfície da bactéria, como

lipopolissacarídios e polissacarídios extracelulares.**

Os fatores Nod induzem várias respostas na raiz da planta hospedeira

(Figura 3.4), as quais podem ser mediadas pela expressão de genes de nodulinas precoces da planta. Dois processos coordenados ocorrem simultaneamente: a infecção do pelo pela bactéria e a organogênese do nódulo. Após a adesão do rizóbio, fatores Nod induzem uma reorganização do citoesqueleto e um pronunciado enrolamento do pelo, envolvendo os

microrganismos (Figura 3.5). Nessa região, ocorre uma degradação localizada da parede celular do pelo, de modo que os rizóbios entram em contato com a membrana plasmática vegetal.

Em seguida, forma-se o canal ou cordão de infecção, uma estrutura tubular composta pela invaginação da membrana plasmática e da parede celular do pelo da raiz, em cujo interior se localizam os rizóbios em

proliferação (Figuras 3.5 e 3.6). O canal de infecção cresce em direção à base da célula pela fusão de vesículas secretoras derivadas do complexo de Golgi, envolvendo a incorporação de membranas e a formação de uma parede semelhante à parede celular do pelo. Após atingir a base do pelo, o

canal de infecção pode se ramificar pelas células corticais (Figura 3.5). Dessa forma, o canal de infecção permite a condução dos rizóbios até o córtex da raiz, onde está sendo formado o primórdio nodular.

Figura 3.4 Troca de sinais durante o estabelecimento da simbiose entre leguminosas e rizóbios. A raiz da leguminosa exsuda flavonoides, que podem ser reconhecidos pela proteína NodD do rizóbio. Essa proteína, após sua ativação pelo flavonoide, se liga à região promotora dos operons nod, que apresentam sequências conservadas conhecidas como nodbox. Com isso, há a expressão de outros genes nod, os quais estão envolvidos na síntese dos fatores Nod pelo rizóbio. Essas moléculas sinalizadoras são oligossacarídios de lipoquitina capazes de induzir diversas respostas na raiz da leguminosa, levando aos processos de infecção e desenvolvimento do nódulo.

 

Em ao menos 25% dos gêneros de leguminosas, a infecção dos rizóbios se dá pela invasão intercelular, não ocorrendo infecção via pelo das raízes ou formação do canal de infecção (Ibanez et al., 2017). Nesse caso, as bactérias podem penetrar por entre as células epidérmicas, como observado em Mimosa scabrella (bracatinga). A penetração pode se dar também por rupturas da epiderme e do córtex provocadas pela emergência das raízes laterais ou ferimentos, como ocorre em Arachis hypogaea (amendoim).

Em paralelo à infecção, ocorre a formação do primórdio nodular na

região cortical da raiz (Figura 3.5). Em resposta aos fatores Nod, há uma alteração do balanço hormonal nas células da raiz, o que inclui um aumento da produção e da sensibilidade às citocininas. Essas moléculas, por sua vez, geram uma inibição localizada do transporte polar de auxina e um subsequente acúmulo desse hormônio em células corticais específicas. Auxinas e citocininas estimulam os processos de desdiferenciação e divisão de células, levando à organogênese do nódulo. Contudo, a produção localizada de etileno bloqueia a divisão de células próximas ao floema da raiz, de modo que o primórdio nodular é formado em posição oposta à dos polos do protoxilema.

Os rizóbios são liberados no citosol das células do primórdio nodular, permanecendo no interior de vesículas derivadas da membrana plasmática

da célula hospedeira (Figura 3.5). As bactérias podem se multiplicar antes e após sua liberação do canal de infecção. A partir de um sinal da planta, as bactérias param de se dividir e sofrem transformações morfológicas (aumento de tamanho e modificação da forma) e fisiológicas (indução dos genes relacionados com a fixação do nitrogênio), passando a ser

denominadas bacteroides (Figura 3.7). Os bacteroides são envolvidos pela membrana peribacteroide, constituindo o simbiossomo. A região do simbiossomo entre os bacteroides e a membrana peribacteroide é chamada de espaço peribacteroide. Dessa forma, os simbiossomos são organelas endossimbiontes, no interior das quais os bacteroides realizam a fixação do nitrogênio. Um simbiossomo pode conter apenas um ou vários bacteroides, dependendo da espécie de leguminosa. Já uma célula infectada pode

apresentar em seu interior de centenas a milhares de simbiossomos (Figura

3.7).

Figura 3.5 Principais etapas da infecção da raiz de uma leguminosa por rizóbios. A. Hipertrofia e enrolamento do pelo. B. Envolvimento dos rizóbios pelo pelo e degradação localizada da parede celular do pelo. C. Formação e crescimento do canal de infecção em direção à base do pelo. D. Ramificação do canal de infecção pelas células corticais. E. Liberação dos rizóbios no citosol de células corticais, envolvidos por uma membrana derivada da membrana plasmática de célula da planta hospedeira. F. Concomitantemente à infecção, há a desdiferenciação e divisão de células corticais, levando à formação do primórdio nodular.

 

Com a formação dos simbiossomos, há a indução da expressão de genes da planta que codificam nodulinas tardias, associadas ao funcionamento do nódulo. As nodulinas tardias incluem enzimas associadas ao metabolismo de carbono no nódulo e à assimilação da NH 3 produzida na fixação, além de proteínas de transporte localizadas na membrana peribacteroide, que permitem a troca de metabólitos entre os bacteroides e o citosol da célula infectada. A nodulina tardia mais abundante é a leg-hemoglobina (pode corresponder a mais de 20% das proteínas do nódulo), que apresenta cor avermelhada e tem a função de carrear o O para a respiração dos 2 bacteroides. Portanto, o nódulo funcional apresenta o tecido infectado com coloração rosada ou avermelhada contrastando com a ausência dessa

coloração dos tecidos restantes, visíveis a olho nu (Figura 3.8). O nódulo não funcional é facilmente reconhecível pelo fato de seu interior apresentar coloração esbranquiçada em virtude dos baixos níveis da leg-hemoglobina

(Figura 3.8).

 

Figura 3.6 Corte de um pelo de raiz de Dimorphandra jorgei sendo infectado por rizóbios. Os rizóbios são as células mais densas e estão localizadas dentro do canal de infecção. Imagem gentilmente cedida pelo Dr. Sérgio Miana de Faria (Embrapa Agrobiologia).

 

Tipos de nódulos de leguminosas

Há dois tipos principais de nódulos que podem ser encontrados em leguminosas: determinados ou indeterminados. Os primeiros caracterizam-se por apresentar um tecido meristemático que permanece ativo mesmo no

nódulo maduro, o que permite seu constante crescimento (Figura 3.9). Algumas células (chamadas intersticiais) não são infectadas, e os nódulos

resultantes apresentam forma alongada e cilíndrica (Figuras 3.9 e 3.10). Além disso, distintas zonas de células podem ser observadas em nódulos indeterminados, incluindo células meristemáticas em rápida divisão no ápice do nódulo, células maduras contendo bacteroides ativos (mais avermelhadas) e células senescentes (menos avermelhadas) na base,

próximo à inserção na raiz (Figura 3.10).

Os nódulos determinados são normalmente esféricos, sem apresentar

uma região meristemática típica quando maduros (Figuras 3.3, 3.8 e 3.9). Dessa forma, eles se desenvolvem até certo tamanho e, depois, não crescem mais. Os rizóbios são liberados em células do córtex externo, as quais se dividem e formam o tecido infectado, observando-se um grupo homogêneo de células. Por sua vez, nos nódulos indeterminados, as divisões celulares se iniciam no córtex interno. Em ambos os tipos de nódulos, a presença de tecidos vasculares bem desenvolvidos é de suma importância para a exportação dos compostos nitrogenados para outras partes da planta e para a provisão de fotoassimilados para os bacteroides.

 

Figura 3.7 Células infectadas de Tipuana tipu. bc: bacteroide; me: membrana peribacteroide; p: parede da célula vegetal infectada; s: simbiossomo. Imagem cedida pela Profa. Dra. Lázara Cordeiro (Universidade Estadual Paulista/Rio Claro).

 

Figura 3.8 Corte de nódulos de plantas de soja cultivadas com diferentes níveis de nitrogênio. O nódulo à esquerda foi coletado da raiz de uma planta cultivada na ausência de nitrogênio disponível (nitrato ou amônio). Observar a coloração avermelhada de seu interior, indicativa de altos níveis de leg-hemoglobina e da elevada atividade do nódulo. O nódulo à direita foi coletado da raiz de uma planta cultivada na presença de altos níveis de nitrato. Verificar nesse caso que a coloração interna é bem mais clara, indicando baixos níveis de leg-hemoglobina e reduzida atividade do nódulo. Notar também o menor tamanho do nódulo à direita. Imagem de Msc. Mariana Fernandes Hertel (Universidade Estadual de Londrina).

 

O tipo de nódulo é uma característica de cada espécie de leguminosa. Mimosa bimucronata (espinho-de-maricá), Lonchocarpus muehlbergianus (embira-de-sapo) e Pisum sativum (ervilha) são exemplos de espécies com nódulos indeterminados. Por sua vez, nódulos determinados estão presentes em Dalbergia nigra (jacarandá-da-baía), Phaseolus vulgaris (feijão) e Glycine max (soja).

Figura 3.9 Corte longitudinal do nódulo indeterminado de Lonchocarpus leucanthus (A) e determinado de Dalbergia nigra (B). Observe o formato alongado do nódulo indeterminado, no qual há células intersticiais (mais claras) em meio às células infectadas (mais escuras). O nódulo determinado tem formato esférico, apresentando uma massa homogênea de tecido infectado, sem células intersticiais. Outra diferença notável é a presença de meristema apical apenas no nódulo indeterminado. c: córtex; cf: células infectadas; ci: células intersticiais; fv: feixe vascular; m: meristema apical; ti: tecido infectado. Imagem da Profa. Dra. Lázara Cordeiro (Universidade Estadual Paulista/Rio Claro).

 

Bioquímica da xação do nitrogênio

Em todos os microrganismos diazotróficos, a fixação de N 2 é catalisada pelo complexo da enzima nitrogenase, conforme a reação a seguir:

N + – + 8 H + 8 e + 16 ATP → 2 NH + H + 16 ADP + 16 P

2 3 2 i

No processo de fixação, a ligação tripla do N 2 é rompida. Cada átomo de nitrogênio se liga a três íons H+ e recebe três elétrons, formando no total duas moléculas de NH 3. Adicionalmente, dois íons H+ são reduzidos, formando uma molécula de H2. Além de fontes de elétrons, todo o processo demanda a energia proveniente da hidrólise de 16 moléculas de ATP a cada duas moléculas de NH formadas. 3

O complexo da enzima nitrogenase é formado por duas proteínas

(Figura 3.11), codificadas por genes nif do microrganismo. A Fe-proteína é composta por duas subunidades idênticas (homodímero), codificadas pelo gene nifH, apresentando grupos ferro-enxofre. Já a Mo-Fe-proteína apresenta quatro subunidades codificadas por dois genes nif distintos (nifD e nifK). O heterotetrâmero dispõe de dois centros catalíticos, os quais apresentam grupos ferro-enxofre e o cofator ferro-molibdênio. Ambas as proteínas só apresentam atividade catalítica quando se associam, formando o complexo da enzima nitrogenase. Uma característica importante da nitrogenase é que tanto a Fe-proteína quanto a Mo-Fe-proteína são rápida e irreversivelmente inativadas pelo O2. Dessa forma, a atividade nitrogenase é inibida pelo O , dependendo de condições anaeróbias ou microaeróbias para 2

que ocorra a fixação do nitrogênio.

Nos nódulos de leguminosas, o ATP e os elétrons necessários para a fixação do nitrogênio são provenientes da oxidação da sacarose fornecida

pelo floema da planta hospedeira (Figura 3.11). Ainda nas células da raiz da planta hospedeira, a sacarose é metabolizada a ácidos dicarboxílicos, principalmente malato, os quais são os principais substratos transferidos para os bacteroides. Em seguida, esses compostos são oxidados no ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs) do bacteroide, levando à liberação de CO 2 e à redução de transportadores de elétrons, como o NADH. Por sua vez, os transportadores de elétrons podem reduzir a ferredoxina, a qual

fornece os elétrons para a reação catalisada pela nitrogenase.*

Figura 3.10 Raízes de Mimosa bimucronata apresentando nódulos indeterminados, caracterizados pelo seu formato alongado. Na imagem superior, observa-se a distribuição dos nódulos no sistema radicial da leguminosa, enquanto a imagem do meio apresenta nódulos em diferentes estágios de desenvolvimento. Na imagem de baixo, notam-se os nódulos seccionados longitudinalmente, evidenciando-se a coloração interna avermelhada decorrente da presença da leg-hemoglobina. Vale observar que a coloração interna apresenta a zonação característica de nódulos indeterminados, em que a porção apical (células infectadas mais jovens e ativas) tem um vermelho mais intenso que a porção basal (células senescentes e menos ativas). Escala: 2 cm. Imagens cedidas pela Profa. Dra. Camila Maistro Patreze (Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro).

 

 

Além disso, os transportadores de elétrons podem ser oxidados pela cadeia respiratória do bacteroide, em um processo no qual se forma a maior

parte do ATP utilizada na fixação do nitrogênio (Figura 3.11). Como os rizóbios são microrganismos aeróbios, o aceptor final de elétrons da cadeia respiratória é o O 2, fornecido pela leg-hemoglobina. A leg-hemoglobina consegue assim prover o O2 para a respiração do bacteroide, ao mesmo tempo que mantém baixíssimos níveis desse gás livre no nódulo, prevenindo a inativação da nitrogenase. Mais detalhes sobre os papéis da leg-hemoglobina na fixação do nitrogênio serão discutidos na próxima seção.

A ferredoxina atua como o principal doador de elétrons para a

nitrogenase nos nódulos (Figura 3.11). A Fe-proteína recebe os elétrons da ferredoxina reduzida, ligando-se em seguida ao ATP, o que a torna um redutor forte. A Fe-proteína transfere então os elétrons para a Mo-Fe-proteína, com subsequente hidrólise do ATP a ADP e Pi. Já a Mo-Fe-proteína completa a transferência de elétrons reduzindo o N e íons H+ com 2 a produção de NH3 e H2. A Mo-Fe-proteína pode reduzir outros substratos, apesar de a redução de N + 2 e H ser a única a ocorrer naturalmente. Por exemplo, a redução do acetileno (provido exogenamente) a etileno pode ser utilizada para estimar a atividade da nitrogenase. A atividade da nitrogenase pode ser também determinada pela dosagem do H 2 liberado, um método que fornece dados quantitativos mais confiáveis que a redução do acetileno.

A NH formada por ação da nitrogenase é rapidamente protonada em 3

meio aquoso sob o pH intracelular, formando NH + 4 (Figura 3.11). Esse cátion é transportado para o citosol da célula vegetal infectada, pelos canais presentes na membrana peribacteroide. Em razão de sua toxicidade, o NH + 4 é logo incorporado à molécula de glutamato na célula vegetal, formando glutamina, em uma reação catalisada pela enzima glutamina sintetase do nódulo. Após a formação de glutamina, o destino do nitrogênio fixado depende dos compostos utilizados para o transporte de nitrogênio na seiva do xilema da planta hospedeira. Em algumas leguminosas, principalmente espécies de clima temperado, o nitrogênio é exportado via xilema para outras partes da planta na forma de amidas (glutamina e asparagina). Por sua vez, leguminosas tropicais geralmente exportam o nitrogênio na forma de ureídos (p. ex., alantoína e ácido alantoico), compostos que apresentam uma razão C:N muito baixa. No caso dessas espécies, a dosagem de ureídos na seiva do xilema pode ser utilizada como um bom indicativo do grau de fixação de nitrogênio no nódulo. As reações de assimilação do NH + 4 e o transporte de nitrogênio na seiva do xilema serão apresentados com mais

detalhes no Capítulo 4.

Além da NH , outro produto da nitrogenase é o H , formado a partir da 3 2 redução de dois íons H+. A formação de H 2 compete com o próprio N2 pelo recebimento de elétrons provenientes da Mo-Fe-proteína, diminuindo assim a eficiência do processo de fixação de nitrogênio. Entretanto, alguns rizóbios e outros microrganismos diazotróficos apresentam a hidrogenase

(Figura 3.11). Essa enzima cliva o H antes que ele se difunda para fora do 2 simbiossomo, regenerando elétrons que podem ser utilizados na produção de ATP pela cadeia respiratória do bacteroide. Dessa forma, a expressão da hidrogenase em rizóbios está associada a uma maior eficiência da fixação de nitrogênio e, por conseguinte, a níveis aumentados de nitrogênio nos tecidos da planta hospedeira (Baginsky et al., 2005).

 

Fatores que afetam a xação do nitrogênio Oxigênio

O O 2 tem um efeito paradoxal sobre a fixação de nitrogênio. Apesar de o O2 e a respiração estarem geralmente envolvidos no suprimento dos altos níveis de ATP requeridos para a fixação do nitrogênio, a nitrogenase é rápida e irreversivelmente inativada pelo O2. Que estratégias foram desenvolvidas pelos microrganismos diazotróficos simbióticos ou de vida livre que lhes permitem manter a nitrogenase funcional em um planeta coberto por 21% de O 2 sem comprometer o aporte de energia necessário para a fixação do nitrogênio?

Figura 3.11 Processos bioquímicos envolvidos na fixação do nitrogênio no nódulo de uma leguminosa. A nitrogenase está representada pelas duas proteínas – ferro-proteína (Fe-PROT) e molibdênio-ferro-proteína (Mo-Fe-PROT) –, nas formas oxidada (ox) e reduzida (red). CAT: ciclo dos ácidos tricarboxílicos; e–: elétrons; Lb: leg-hemoglobina; Fd :

red

ferredoxina reduzida; Fd : ferredoxina oxidada. ox

 

A estratégia mais óbvia é a apresentada por microrganismos diazotróficos anaeróbios de vida livre, como Rhodospirillum e Clostridium, já que eles não dependem do O para produzir ATP. Eles são encontrados 2 somente em ambientes anaeróbios, sem haver o contato da nitrogenase com o O 2. Outras bactérias são anaeróbias facultativas, normalmente fixando o nitrogênio apenas quando se encontram em ambientes sem O . 2

Por sua vez, microrganismos aeróbios necessariamente dependem do O2 para obter energia, apresentando estratégias que reduzem os níveis desse gás no microambiente da nitrogenase. Membros da família Azotobacteriaceae apresentam um sistema de membranas intracelulares que formam nichos nos quais a nitrogenase fica localizada, protegida do O . 2 Outro mecanismo apresentado, em particular por Azotobacter, é a proteção respiratória, que consiste na manutenção de baixas tensões de O2 por meio de uma elevada taxa respiratória. Além disso, espécies de Azotobacter podem produzir grandes quantidades de polissacarídios extracelulares, que

limitam a difusão do O para dentro da célula (Figura 3.12). 2

Já as cianobactérias, além de serem aeróbias, liberam O2 durante a fotossíntese. Em alguns desses microrganismos, como os do gênero Cyanothece, esse problema é resolvido pela separação temporal entre a fixação de nitrogênio e a fotossíntese. Em outras cianobactérias, como Nostoc spp., a nitrogenase se localiza em células especializadas chamadas de heterocistos, que apresentam uma parede celular espessada, restringindo

a difusão do O (Figura 3.13). Além disso, os heterocistos têm apenas o 2

fotossistema I, que produz ATP por reações luminosas sem a liberação de

O 2 (ver Capítulo 5).

 

Figura 3.12 Micrografia eletrônica de células de Azotobacter vinelandii cultivadas em meio com 2,5% (A) e 20% (B) de O . Observe que sob 20% de O as células apresentam uma 2 2 camada espessa e compacta de polissacarídios extracelulares, que limita a difusão de O2 para dentro da célula. Sob baixos níveis de O , a camada de polissacarídios é mais frouxa. 2 Poli-beta-hidroxibutirato (PHB) é acumulado em condições de limitação de O como forma 2 de armazenamento de carbono e energia. Adaptada de Sabra et al. (2000).

Em associações simbióticas, o ambiente microaeróbio é gerado pela interação entre o microrganismo e a planta hospedeira. Considerando os nódulos de leguminosas, três mecanismos permitem, em conjunto, a manutenção de baixos níveis de O 2 (abaixo de 40 nM, cerca de 10 mil vezes

menor que a concentração de equilíbrio na água; Figura 3.14).

Primeiro, características estruturais do nódulo, especialmente ligadas ao córtex, como células escleroides com parede espessada e inclusões de glicoproteínas nos espaços intercelulares, atuam como uma barreira à

difusão de gases (Figura 3.14). No entanto, a permeabilidade do córtex ao O pode ser regulada em resposta a diversos fatores, como o suprimento de 2

NO – 3 e O2 no solo. Por exemplo, baixas concentrações exógenas de O2 promovem um aumento da permeabilidade do nódulo à difusão de gases, a fim de evitar uma diminuição na tensão de O nas células infectadas que 2 inibiria a respiração do bacteroide e, por conseguinte, a fixação de nitrogênio. A regulação da permeabilidade da barreira à difusão de O 2 envolve o fluxo de potássio entre a região central e o córtex do nódulo, o que altera a quantidade de água ou ar que ocupa os espaços entre as células corticais (Wei e Layzell, 2006).

Um segundo mecanismo consiste na presença da leg-hemoglobina no

citosol das células infectadas (Figura 3.14), intimamente associada aos simbiossomos. Conforme discutido anteriormente, essa proteína confere a cor rosada ou avermelhada dos nódulos ativos. A leg-hemoglobina se liga ao O com elevada afinidade (K de cerca de 10 nM), mantendo níveis 2 m muito baixos de O 2 livre no tecido infectado e assim protegendo a nitrogenase contra a inativação. Ao mesmo tempo, a leg-hemoglobina apresenta uma taxa relativamente rápida de dissociação do O , o que lhe 2 permite entregar com eficiência o O 2 para a citocromo c oxidase da cadeia respiratória do bacteroide.

Figura 3.13 Filamento da cianobactéria Dolichospermum circinalis, apresentando heterocisto (indicado pela seta) e células vegetativas. O heterocisto apresenta a parede celular espessada, o que possibilita a existência de um ambiente interno com baixos níveis de O , necessário para prevenir a inativação da nitrogenase. Imagem cedida pela Profa. 2

 

Dra. Ina de Souza Nogueira (Universidade Federal de Goiás).

 

O terceiro mecanismo é justamente a respiração do bacteroide, que

constitui um importante dreno para o O (Figura 3.14). A citocromo c 2 oxidase do bacteroide apresenta uma afinidade extremamente alta ao O 2 (Km de aproximadamente 7 nM), permitindo seu funcionamento mesmo sob baixas tensões desse gás.

Semelhantemente às leguminosas, nódulos de plantas actinorrízicas podem apresentar hemoglobinas simbióticas e uma barreira à difusão de gases. Além disso, em Frankia, tanto em vida livre quanto em algumas simbioses, a nitrogenase é encontrada no interior de vesículas especializadas envolvidas por um espesso envelope lipídico, o que limita a difusão do O até o sítio do complexo enzimático. 2

 

Nitrato A fixação simbiótica de nitrogênio é um processo que demanda alto gasto de energia pela planta hospedeira. Além dos fotoassimilados destinados para a produção de ATP e redução da ferredoxina diretamente utilizados pela nitrogenase, há um investimento de energia e esqueletos carbônicos para o processo de infecção e desenvolvimento do nódulo. Estima-se que os custos para a fixação do nitrogênio possam chegar a 25% do total de carboidratos produzidos pela fotossíntese da planta hospedeira por dia (Ryle et al., 1985). Comparada à fixação de nitrogênio, a redução do NO – + 3 a NH 4

pela planta é mais barata energeticamente (ver Capítulo 4). Dessa forma, em solos com alta disponibilidade de NO –, é mais vantajoso para a planta 3 reduzir esse ânion que manter a simbiose com microrganismos diazotróficos.

De fato, formas combinadas de nitrogênio (principalmente o NO – 3) conseguem inibir a fixação do nitrogênio em leguminosas, apesar de exceções já terem sido descritas em algumas espécies (Camargos e Sodek, 2010). O efeito negativo do NO – ocorre em diferentes etapas do processo, 3 como na infecção, no desenvolvimento do nódulo e na fixação de nitrogênio em si. Assim, quando há NO – 3 no solo, o número, a massa e a

atividade dos nódulos são reduzidos (ver Figura 3.8).

Figura 3.14 Representação de mecanismos dos nódulos de leguminosas, que permitem a existência de um microambiente com baixos níveis de O para proteger a nitrogenase 2 contra a inativação sem comprometer a produção aeróbia de ATP pelo bacteroide. No córtex, há a barreira à difusão de gases, que controla a permeabilidade do nódulo ao O . 2 No citosol das células infectadas, a leg-hemoglobina se liga ao O e o libera para a 2 respiração do bacteroide. No bacteroide, a citocromo c oxidase com elevada afinidade ao O auxilia na manutenção de baixos níveis desse gás no sítio da nitrogenase. 2

 

Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar o efeito do NO – 3 sobre a fixação de nitrogênio em leguminosas. O NO – pode reprimir a 3 expressão de genes relacionados com a biossíntese de flavonoides, suprimindo a liberação dessas moléculas sinalizadoras pelas raízes e, por conseguinte, a infecção pelos rizóbios (Coronado et al., 1995). Além disso, o NO – 3 modula a barreira à difusão de gases do nódulo, limitando a permeabilidade ao O e a produção aeróbia de ATP (Kaiser et al., 1997). A 2

nitrogenase e a leg-hemoglobina também podem ser inibidas por moléculas derivadas do NO – 3, como NO – 2 e NO. Outros mecanismos propostos envolvem a competição por carboidratos entre a fixação do nitrogênio e a

redução do NO – (ver Capítulo 4) e a inibição do metabolismo do nódulo 3

por compostos nitrogenados que se acumulam por causa da assimilação do nitrogênio do NO – 3.

 

Fatores de estresse abióticos

Fatores ambientais que provocam estresse podem afetar negativamente a fixação de nitrogênio por microrganismos simbióticos e de vida livre, uma vez que conseguem prejudicar a sobrevivência de microrganismos diazotróficos no solo, a formação e o funcionamento dos nódulos e o metabolismo da planta hospedeira. Por exemplo, a exsudação de compostos pelas raízes é menos efetiva em solos ácidos, afetando o reconhecimento e a infecção de leguminosas por rizóbios. Ambos os processos também podem ser comprometidos por altas temperaturas, bem como a fixação do nitrogênio e a assimilação de NH + 4 nos nódulos. Já o alagamento do solo resulta em um rápido decréscimo da atividade da nitrogenase, decorrente da insuficiência de O para manter o metabolismo aeróbio do rizóbio e da 2

planta hospedeira (Justino e Sodek, 2013). No caso da seca, a fixação do nitrogênio em nódulos de leguminosas pode ser comprometida por mudanças na barreira à difusão de O 2 (como observado na inibição da fixação pelo NO –). Além disso, a seca e qualquer outro fator de estresse 3

que prejudique a fotossíntese, como o sombreamento, reduzem o fornecimento de carboidratos ao nódulo pela planta hospedeira, prejudicando a fixação do nitrogênio.

O desenvolvimento de linhagens de rizóbios e cultivares de leguminosas mais tolerantes a fatores de estresse abióticos tem contribuído para otimizar a fixação de nitrogênio e a produção agrícola em ambientes desfavoráveis. O manejo adequado do solo também pode beneficiar a fixação do nitrogênio, como é o caso da calagem de solos ácidos e o plantio direto, técnica na qual a manutenção de restos vegetais de outras culturas aumenta a umidade e reduz a temperatura do solo (Hungria e Vargas, 2000). Autorregulação pela planta hospedeira A simbiose entre rizóbios e leguminosas tem o potencial de se tornar desvantajosa para a planta, uma vez que o nódulo é um dreno considerável de fotoassimilados. Quando um número excessivo de nódulos é formado na raiz, pode haver um efeito negativo no crescimento vegetativo e na produtividade da planta hospedeira. As leguminosas apresentam um mecanismo conhecido como autorregulação da nodulação, que lhes permite controlar o número de nódulos pela supressão do desenvolvimento de novos nódulos. Esse mecanismo envolve a troca de moléculas sinalizadoras entre a raiz e a parte aérea da leguminosa, como peptídios sinalizadores e citocininas (Nelson e Sadowsky, 2015). Alterações na exsudação de flavonoides pela raiz (como observado na inibição da nodulação pelo NO –) 3 e na sinalização dos fatores Nod (como a degradação desses fatores por quitinases) parecem estar envolvidas na supressão da nodulação.

 

Importância ecológica e agronômica da xação biológica do nitrogênio

A fixação biológica do nitrogênio é o principal processo que permite a entrada de nitrogênio reativo (NH + – 4 e NO 3) na biosfera. Ainda, boa parte do nitrogênio fixado biologicamente é encontrada em simbioses entre microrganismos diazotróficos e plantas, entre as quais se destaca a associação entre rizóbios e leguminosas. Apesar dos custos envolvidos na manutenção do simbionte e do próprio processo de fixação do nitrogênio, a simbiose com microrganismos diazotróficos pode ser bastante vantajosa para a planta hospedeira, uma vez que permite o seu crescimento e desenvolvimento sem depender do nitrogênio disponível (p. ex., NO – e 3

NH + 4) no ambiente (Figura 3.15). Dessa forma, a planta hospedeira pode ocupar ambientes onde a disponibilidade de nitrogênio é baixa, apresentando grande vantagem competitiva nessas condições. Um bom exemplo é o caso das espécies actinorrízicas, plantas pioneiras geralmente encontradas em solos deficientes em nitrogênio. A capacidade de Parasponia spp. e algumas leguminosas pioneiras estabelecerem simbiose com rizóbios também é considerada uma característica importante para que essas espécies arbóreas ocupem áreas de início de sucessão ecológica onde a disponibilidade de nitrogênio é baixa.

 

Figura 3.15 Plantas de soja cultivadas em substrato sem fontes de nitrogênio disponível (NO – + ou NH). A planta à esquerda foi inoculada com Bradyrhizobium diazoefficiens,

3 4

enquanto a da direita foi cultivada na ausência de rizóbios. Observe que a planta não nodulada apresentou claros sintomas de deficiência de nitrogênio, como clorose foliar e redução do crescimento. Esses sintomas não são observados na planta nodulada, uma vez que a fixação do nitrogênio pelo rizóbio foi capaz de suprir a demanda da planta por esse nutriente. Imagem cedida pela Dra. Mariangela Hungria (Embrapa Soja).

 

O nitrogênio fixado simbioticamente também pode contribuir para o nitrogênio reativo acumulado no solo e na comunidade vegetal, afetando a ciclagem desse nutriente no ecossistema. A decomposição de órgãos da planta hospedeira (folhas, galhos, raízes e nódulos senescentes) fornece nitrogênio orgânico ao solo, o qual pode ser mineralizado a NH + e NO – 4 3 pela ação de microrganismos e, então, absorvido por plantas vizinhas. Há fortes evidências de que o nitrogênio fixado em plantas simbióticas pode ser transferido para outras espécies vegetais (Thilakarathna et al., 2016). Além de ser liberado pela decomposição de tecidos, o nitrogênio fixado pode ser transferido para plantas vizinhas por intermédio de micorrizas ou pela exsudação de compostos nitrogenados pelas raízes da planta hospedeira. Dessa forma, o plantio de mudas de leguminosas arbóreas simbióticas em reflorestamentos pode favorecer o enriquecimento de nitrogênio reativo no solo e o estabelecimento de novas espécies vegetais, acelerando a recuperação de áreas degradadas com baixa disponibilidade de nitrogênio.

A fixação biológica de nitrogênio também apresenta grande relevância em ecossistemas aquáticos. Alguns autores estimam que 140 trilhões de gramas de nitrogênio sejam fixados por ano nos oceanos, uma quantidade que pode exceder o total de nitrogênio fixado biologicamente nos solos (Fowler et al., 2017). Cianobactérias, como as do gênero Trichodesmium, estão entre os principais microrganismos envolvidos na fixação de nitrogênio em ambientes aquáticos (Zehr, 2011). As cianobactérias diazotróficas de vida livre também contribuem para o suprimento de nitrogênio reativo em solos alagados, uma vez que liberam o nitrogênio fixado no solo quando morrem. Isso é particularmente importante para a manutenção do cultivo de arroz em países asiáticos. A associação entre a pteridófita aquática Azolla spp. e cianobactérias do gênero Nostoc constitui outra importante fonte de nitrogênio para o cultivo de arroz em campos alagados.

O cultivo de leguminosas que estabelecem interações com rizóbios, como soja e feijão, também se beneficia da fixação biológica do nitrogênio. No caso da soja, quase todo o nitrogênio demandado pela planta pode ser fornecido pela fixação biológica, não sendo necessária a aplicação de fertilizantes nitrogenados. Estudos em diferentes regiões do Brasil indicam que a complementação com fertilizantes nitrogenados diminui a nodulação da soja e a contribuição da fixação para o conteúdo de nitrogênio da planta (em decorrência do efeito inibitório do NO – 3 discutido anteriormente), não havendo ganho de produtividade. Contudo, a inoculação das sementes de soja com espécies de Bradyrhizobium potencializa a nodulação das plantas e o rendimento dos grãos (Hungria e Mendes, 2015). Assim, a fixação biológica de nitrogênio permite a economia de bilhões de reais com a aplicação de fertilizantes nitrogenados em cultivos de soja no Brasil.

No sistema de rotação de culturas, o nitrogênio residual proveniente de leguminosas simbióticas pode favorecer culturas subsequentes. Outra estratégia consiste na chamada adubação verde, em que leguminosas simbióticas são cultivadas em consórcio ou em rotação com a cultura de interesse econômico, aumentando a disponibilidade de nitrogênio e a reciclagem de nutrientes no solo. Crotalaria juncea (crotalária), Cajanus cajan (guandu) e Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) são exemplos de leguminosas utilizadas para a adubação verde (Espindola et al., 2005).

Dessa forma, a fixação biológica de nitrogênio tem crucial importância em ecossistemas agrícolas, permitindo uma menor aplicação de fertilizantes nitrogenados. Além da redução de custos, esse fato tem grande relevância ambiental. O uso indiscriminado de fertilizantes está associado à contaminação do lençol freático e de rios, lagos e oceanos com compostos nitrogenados (principalmente NO –), podendo atingir níveis tóxicos à fauna 3 aquática e à saúde humana. Adicionalmente, a produção de fertilizantes promove uma grande quantidade de gases relacionados com o aquecimento global. Assim, tecnologias que permitam maximizar a contribuição da fixação biológica do nitrogênio em ecossistemas agrícolas são essenciais para o desenvolvimento de uma agricultura sustentável.

 

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_________

* Raízes coraloides de cicadáceas são raízes adventícias que crescem para

cima e se ramificam próximo à superfície do solo, apresentando forma

semelhante à de um coral.

* A rizosfera é a região do solo que sofre influência da raiz, enquanto o

rizoplano compreende a superfície da raiz e as partículas do solo e

matéria orgânica aderidas a ela.

** As lectinas são glicoproteínas de origem vegetal capazes de se ligar a

carboidratos específicos.

* A ferredoxina é uma proteína ferro-enxofre que intermedeia

transferências de elétrons em várias reações metabólicas (ver Capítulo

5).

 

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