25. Gnotobiologia

 

Delma Pegolo Alves; Luiz Augusto Corrêa Passos; Ana Maria Aparecida Guaraldo; Marcos Zanfolin

 

Introdução

A evolução do conhecimento na área biomédica exigiu que os ensaios passassem a ser realizados de forma totalmente controlada. Para tanto, foi necessário o aprofundamento das atividades de várias áreas como aquelas relacionadas às drogas, reagentes e equipamentos, entre outros. Entre essas áreas, destaca-se a ciência em animais de laboratório, que passa a apresentar dois objetivos principais: a produção de animais já estabelecidos para a pesquisa biomédica e o desenvolvimento de novos modelos. Esses novos modelos seriam utilizados para responder a perguntas específicas, e por esta razão a sua constituição genética, o seu status sanitário e o ambiente no qual são produzidos passam a ser determinantes.

Nesse contexto, surgem os animais gnotobióticos. Palavra de origem grega, gnotos significa “bem conhecida” e biota “forma de vida associada”. Assim, o modelo gnotobiótico é constituído de um animal criado em ambiente controlado e portador de uma flora associada totalmente conhecida.

Os primeiros estudos na área da gnotobiologia foram iniciados com Luis Pasteur, que investigou a sobrevivência de organismos superiores na ausência de bactérias. Entretanto, obstáculos como a manutenção dos animais em um ambiente isento de germes dificultavam a realização desses testes. A solução surgiu com o desenvolvimento de equipamentos capazes de criar um ambiente que, embora artificial, permitisse o alojamento dos animais e o estudo das relações entre eles e a microbiota.

As diversas aplicações científicas desses animais serão discutidas no decorrer deste capítulo. Antes, porém, apresentamos, a seguir, uma pequena revisão histórica dos pontos de maior relevância dessa nova ciência.

1895 – Nuttall & Thierfelder conservam a vida de uma cobaia

por 15 dias, na ausência de bactérias, porém sem crescimento.

1914 – Kuster mantém uma cabra por 1 mês com crescimento

normal e sem contaminação bacteriana.

1930 – Reyners relata seus esforços para obter a primeira

cobaia germfree em ambiente estéril.

1930-1933 – Reyners desenvolve projeto para o estudo da

variação bacteriana em organismos superiores.

1934 – Reyners & Trexler introduzem a tecnologia para a

manutenção de animais axênicos e para a construção de um

novo modelo de isolador.

1936 – Uso de isoladores na histerectomia de macacos e

cobaias e desenvolvimento de isoladores para galinhas.

1939 – Simpósio na Universidade de Notre Dame: Micrurgical

and Germfree Methods.

1943 – First Symposium on Gnotobiotic Technology e desmame

do primeiro rato axênico.

1948 – Gustafsson: desenvolve isolador rígido em aço inox.

1951-1956 – Reyners mantém em uso, por cinco anos, um

isolador em aço inox. Assim, foram produzidos 286 ratos e

registradas 10 contaminações.

1956 – National Meeting of the Animal Care Panel. Reyners

propõe o uso de colônias de animais Specific Pathogen Free

(SPF) como modelo para pesquisa biomédica, em decorrência

da qualidade do animal derivado das colônias de unidades

isoladoras.

1957 – Trexler & Reynolds: desenvolvem o primeiro isolador

flexível com baixo custo.

1959 – Second Symposium on Gnotobiotic Technology,

abordando a importância dos animais SPF e da Flora Definida

no desenvolvimento da ciência.

1960 – Utilização de animais germfree na rederivação de

estoques de animais de empresas privadas e comercialização

dos primeiros animais germfree para pesquisa.

1962 – Third Symposium on Gnotobiotic Technology. Do evento

participaram 110 pesquisadores em apresentação de trabalhos,

mesa-redonda e discussão sobre animais gnotobióticos. Nessa

década, mais de 40 laboratórios já estavam utilizando

isoladores flexíveis e 4 empresas privadas comercializavam

roedores gnotobióticos.

1962 – Trexler: deixa o Albert Einstein College of Medicine para

desenvolver isoladores hospitalares.

1966 – Trexler e o Staff da Royal Veterinary College

desenvolvem isoladores para animais de grande porte.

 

A gnotobiologia no Brasil

No Brasil, em 1961, as pesquisas em gnotobiologia foram iniciadas pelo professor Dr. Enio Cardillo Vieira, na Universidade Federal de Minas Gerais, com projeto sobre crescimento e reprodução de caramujo Biompharia glabrata em condições axênicas, criados em tubos de ensaio. Posteriormente, os caramujos axênicos foram cultivados em isoladores de plástico flexível. Em 1979, o pesquisador importou uma colônia de camundongos axênicos da Universidade de Notre Dame (EUA) e, desde então, diversos trabalhos têm sido realizados utilizando esses animais.

 

Classificação sanitária dos animais

A classificação dos animais de laboratório está relacionada ao tipo de biotério: aberto (animais sanitariamente não definidos) ou fechado (com uma complexidade variável do sistema de barreiras, capaz de manter colônias sanitariamente definidas).

AXÊNICO (GERMFREE): totalmente livres de flora microbiana

associada, mantidos em unidade isoladora.

GNOTOBIÓTICO: com flora microbiana associada definida.

SPF: livres de patógenos específicos.

COBS: Cesarian Obtained Barrier System. São animais

derivados de cesariana e mantidos sob sistema de barreiras.

VAF: Virus Antibody Free. São animais que não possuem

anticorpos virais sorologicamente demonstráveis.

 

Objetivos da gnotobiologia

A gnotobiologia apresenta uma vasta aplicação, possibilitando a elaboração de ensaios experimentais multidisciplinares. Entretanto, alguns dos objetivos podem ser claramente evidenciados. Dentre eles destacamos:

obtenção de matrizes livres de patógenos na derivação de novas colônias de animais em biotério para pesquisa biológica; elucidação das inter-relações entre o hospedeiro e sua flora microbiana associada;

eliminação da interferência dessa flora no estudo de fenômenos biológicos.

Comparação entre animais convencionais e

germfree

A utilização e a comparação entre animais convencionais e germfree mostram a influência e o papel da flora quanto às modificações qualitativas do conteúdo gástrico, à anatomia do tubo digestivo, à fisiologia digestiva e geral, à modificação do sistema imunitário do tubo digestivo, além do efeito barreira. Essas modificações envolvem o tubo digestivo e o trato intestinal, exposto à ação da microflora.

A seguir, destacaremos os efeitos importantes em nível de fisiologia geral e o efeito barreira.

Fisiologia Geral

Os animais germfree apresentam crescimento, peso e temperatura corporal iguais aos animais convencionais. No animal germfree, o coração é menor, e como conseqüência também o são o funcionamento cardíaco, o fluxo de sangue para a pele, fígado e intestino e o consumo de oxigênio.

Conforme descrito por Gordon (1965), os animais germfree apresentam paredes capilares e alveolares no pulmão menos espessas. A maturação sexual no germfree é mais lenta.

Alterações do Tubo Digestivo

Nos animais axênicos, o conteúdo cecal tem um pH maior, em virtude da ausência dos ácidos graxos voláteis produzidos pelo metabolismo fermentativo da microflora intestinal.

Não há diferença histológica estomacal entre o germfree e o convencional. A ausência de microflora não causa modificações de peso e da estrutura histológica do pâncreas. A morfologia do intestino delgado no rato e na cobaia axênicos difere pelo peso menor, mucosa mais lisa e uma população menor de células reticuloendoteliais; a superfície da mucosa intestinal, no rato axênico, é 30% menor, sendo maior nas partes média e inferior do intestino delgado. As vilosidades são maiores na parte proximal e menores na parte distal do intestino delgado.

Estudos de micrografia eletrônica mostraram que as microvilosidades apresentam comprimento menor na presença da microflora. O decréscimo em relação ao axênico é de 5% no duodeno, 9% no jejuno e 18% no íleo.

No animal axênico, o trânsito intestinal é lento. Os animais axênicos ainda apresentam números reduzidos de placas de Peyer e de plasmócitos.

Efeito Barreira

A flora bacteriana intestinal normal protege o hospedeiro contra a instalação de agentes patogênicos. Esse fenômeno de rejeição dos microorganismos exógenos é denominado efeito de eliminação ou de barreira.

 

Descrição do isolador equipamento

Apresentação dos Componentes Básicos do Isolador

Para que haja eficiência no isolamento do animal durante o ensaio experimental, o equipamento deve apresentar as seguintes estruturas fundamentais.

ESTRUTURA PRINCIPAL, CORPO OU ENVELOPE – deve ser,

do ponto de vista óptico, transparente para melhor visualização

dos animais no interior do equipamento. Nos equipamentos

flexíveis, utiliza-se uma grande variedade de material plástico

como polietileno, polipropileno, poliuretano; no entanto, o

polyvinycloride (PVC) é o material mais comum para a

confecção do equipamento. Os isoladores precisam ter PVC de

espessura fina, resistência à ruptura e caráter atóxico. Devem

também apresentar a vantagem de ajustar-se facilmente à

pressão durante o manejo.

Os isoladores rígidos são confeccionados em aço inox, PVC

rígido, fibra de vidro, sendo assim fortes e resistentes.

Apresentam inconveniente em relação à restrição aos

movimentos do operador. Para determinadas espécies de

animais (por exemplo, as aves), adota-se isoladores rígidos ou

semi-rígidos.

PORTO DE PASSAGEM – é o local através do qual os

materiais são introduzidos e retirados do isolador. O porto deve

possuir diâmetro e localização, de acordo com as necessidades

do ensaio experimental. As extremidades externa e interna do

porto de passagem são revestidas por membranas plásticas

denominadas capas, sendo removidas para a introdução ou

retirada dos materiais. Esse tipo de porto de passagem é

denominado de convencional.

LUVAS DE MANUSEIO – as luvas podem ser de cano curto ou

longo. O tipo de luva a ser adotado dependerá das atividades

que serão desenvolvidas. Nos trabalhos que envolvem agentes

químicos, as luvas devem ser avaliadas freqüentemente.

Com o decorrer do tempo, as luvas de borracha podem

apresentar microfissuras que, apesar de imperceptíveis,

oferecem risco potencial de contaminação. Nesse contexto, a

adoção de luvas de cano curto se torna mais adequada por

assegurar a sua reposição mesmo com o equipamento em uso.

FILTROS DE AR – a estrutura do filtro é cilíndrica, de forma a

possibilitar maior superfície de contato com o ar e permitir a

deposição do material filtrado. O elemento filtrante deve ser

preferencialmente hidrófobo e apresentar atividade high

efficiency in pore activity (Hepa), retendo assim 99,99% de

partículas com o diâmetro superior a 0,3 m. O conjunto deve ser

esterilizado no forno Pasteur a uma temperatura de 180 °C

durante 120 minutos, ou autoclavados a 121 °C por 30 minutos.

MOTOR DE INSUFLAÇÃO – o ar é insuflado no equipamento

por meio de um motor, permitindo um volume médio de 16 a 18

trocas de ar por hora. Alguns equipamentos podem oferecer

motores para exaustão. São os isoladores de pressão negativa.

Figura 1 – Unidades isoladoras flexíveis

 

Fonte: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

(Cemib/Unicamp).

Nos protocolos experimentais, onde há risco de contaminação para o pesquisador e para o meio ambiente em virtude da manipulação de agentes zoonóticos, adota-se isoladores com ‘pressão negativa’. Nesse modelo de equipamento, caso ocorra um acidente, há entrada de ar externo, impedindo o comprometimento do meio ambiente.

Já nos casos nos quais os ensaios experimentais são realizados com animais livres de zoonoses, a escolha deve ser de isoladores

com ‘pressão positiva’ (Fig. 1), pois no caso de um eventual acidente que comprometa o ‘corpo principal’ do equipamento, o ar sai, salvaguardando a integridade dos animais mantidos em seu interior.

Em ambos os modelos, a pressão final média é de 2 mm a 4 mm de coluna de água abaixo ou acima da pressão atmosférica normal.

Acessórios Básicos

A manutenção da rotina exige a utilização de alguns acessórios essenciais: o cilindro de esterilização e a luva de transferência.

CILINDRO DE ESTERILIZAÇÃO – acessório confeccionado em

aço inoxidável com perfurações na porção mediana que serão

cobertas por três camadas de elemento filtrante com atividade

Hepa. Uma de suas extremidades é aberta, possibilitando o

alojamento dos insumos básicos (ração, maravalha etc.). Após

a colocação desses materiais, a extremidade é selada com uma

membrana termorresistente e fixada com fita resistente a altas

temperaturas. O cilindro é então introduzido na autoclave para

ser esterilizado.

LUVA DE TRANFERÊNCIA – permite a conexão entre o cilindro

e o porto de passagem. A luva apresenta dois orifícios, nos

quais são pulverizadas/vaporizadas as soluções germicidas

utilizadas na esterilização.

Acessórios Especiais

Tanto a manutenção de colônias de animais em centros de bioterismo como o desenvolvimento de alguns protocolos experimentais, algumas vezes, exigem acessórios especiais. Dentre esses, destacamos:

MANÔMETRO DIFERENCIAL – fornece indicações da pressão

no interior do isolador quando em uso, indicando também o

momento de troca dos filtros.

SISTEMA NO BREAK – é acionado quando ocorre interrupção

de energia elétrica, mantendo o isolador inflado. É

particularmente importante nas instituições que não têm

sistema central de segurança (grupo gerador).

VÁLVULA NA SAÍDA DE AR – permite rápida compensação

das oscilações na pressão oriundas do manuseio. É, portanto,

um acessório que possibilita um controle rápido da pressão no

interior do equipamento.

CONTROLADOR DE TEMPERATURA E UMIDADE – torna

possível o registro das temperaturas mínimas e máximas no

período. Quando a temperatura ultrapassa a faixa do bem-estar

animal, o organismo sofre alterações, principalmente

aumentando a freqüência respiratória, cardíaca e elevando a

temperatura.

Preparo de Unidades Isoladoras

A montagem dos isoladores, com seus respectivos acessórios, necessita de cuidados que possam assegurar a integridade do equipamento e a manutenção do status microbiológico das colônias.

Antes de efetuar a lavagem, desinfecção e esterilização, o isolador deve ser montado, inflado e avaliado quanto a sua integridade; para essa avaliação, pode ser usado o gás Freon 12.

Antes da ocupação do equipamento, recomenda-se a adoção dos seguintes procedimentos:

Lavar todos os componentes do equipamento separadamente (corpo plástico ou envelope, luvas e punhos, chapéus interno e externo, tapetes, suportes e capas dos filtros, rolhas de borracha) com detergente para retirada de sujeira e gordura. Montar o equipamento e proceder a lavagem e desinfecção interna do corpo com detergente comum ou, preferencialmente, com solução detergente de amônia quaternária 0,5%.

Enxaguar com água destilada/filtrada e enxugar. Aplicar álcool 70% com pulverizador.

Introduzir os materiais que podem ser expostos a soluções químicas (tapete, gaiolas, pinças, rolhas de borracha, chapéu interno) e pulverizar toda a superfície interna e materiais com um poderoso germicida como o ácido peracético diluído 1:2. Deixar todos esses materiais expostos durante um período de 48 horas. Em seguida, romper o lacre dos filtros e proceder a ventilação até a completa retirada de resíduos do produto químico utilizado (por exemplo, o ácido peracético). Os filtros de ar montados com manta de lã de vidro em estruturas metálicas de aço inoxidável devem ser previamente esterilizados pelo calor seco a 180 °C durante 120 minutos. A autoclavagem a 121 °C por 30 minutos pode ser utilizada, porém, os filtros devem ser colocados em estufa para secagem após o processo. OBS.: em isoladores utilizados para manutenção de colônias axênicas e gnotobióticas, alguns procedimentos adicionais são indispensáveis. Indicamos, a seguir, alguns desses procedimentos.

1° – Durante a montagem do equipamento, deve-se assegurar que as superfícies de contato nas diferentes junções entre as partes estejam embebidas com a solução esterilizante. Os principais locais são:

corpo principal e porto;

corpo principal e chapéu externo;

anéis e luva;

anéis e punho;

corpo principal e filtros de ar.

2° – Recomenda-se uma segunda esterilização após 48 horas de ventilação da primeira.

3° – Em conseqüência do desgaste natural dos componentes plásticos do equipamento, com surgimento de microfissuras e também a possibilidade de acidentes não percebidos, recomenda-se que a cada 3 a 6 meses novas colônias sejam formadas em outros equipamentos. Tal procedimento permite que as unidades em uso possam ser novamente avaliadas quanto a sua integridade estrutural.

Após a limpeza e desinfecção do equipamento, deve-se iniciar o preparo dos materiais que serão introduzidos no isolador e que servirão tanto na manutenção dos animais quanto para a avaliação sanitária do ambiente de seu interior. Para tanto, o cilindro de esterilização deverá ser montado com os seguintes itens:

ração e maravalha: ambos colocados em sacos de algodão, de fácil manipulação e permeáveis ao vapor; toalhas para manter a limpeza da parede interna, possibilitando uma boa visão;

frascos/tubos de ensaio para coleta de material para testes de esterilidade;

swabs, meios de cultura para a realização dos testes; indicadores biológicos: tiras impregnadas com 106 esporos de Bacillus stearothermophylus (microorganismo resistente a altas temperaturas);

indicadores físico-químicos: fita com indicador de autoclave 3M e anidrido succínio em pó, que apresenta um ponto de fusão cuja temperatura é conhecida;

gaiolas e tampas, frascos de bebedouros. Com exceção dos bebedouros, os outros materiais podem também ser introduzidos após desinfecção química no porto de passagem.

Após o preparo, o cilindro deve ser autoclavado a uma temperatura de 125 °C por um período de 30 minutos.

Validação do Equipamento e Materiais

A ocupação do isolador somente poderá ser feita após a certificação de que o equipamento está pronto, tanto do ponto de vista físico (integridade quanto a rupturas no corpo principal e vazamentos provenientes de falhas na montagem, entre outros) quanto do ponto de vista sanitário. Tais cuidados são mais necessários quando o objetivo é a manutenção de animais germfree e gnotobióticos. Por essa razão, recomenda-se a coleta de amostras de swabs embebidos em meio de cultura de enriquecimento (BHI/TPB). A porção do equipamento a ser investigada é a superfície interna. Após o teste, o swab deverá ser semeado em caldo BHI, Tioglicolato e Sabouraud.

Paralelamente, deverão ser retiradas amostras da ração e maravalha que serão igualmente semeadas nos mesmos meios de cultivo (caldo BHI, Tioglicolato e Sabouraud).

As tiras contendo Bacillus stearothermophylus, introduzidas no preparo de materiais, também deverão ser retiradas e cultivadas a fim de se avaliar a eficiência do processo de esterilização.

Todas as amostras deverão ser incubadas à temperatura ambiente (25 °C), 37 °C e a 55 °C, de 5 a 7 dias.

 

A utilização de técnicas gnotobióticas na ciência

de animais de experimentação, na pesquisa e na

indústria

Centros de Bioterismo (Animais de Laboratório)

Conforme será observado em outros pontos, várias são as tecnologias originadas com o bioterismo e que são essenciais em centros dessa área.

Em centros de bioterismo, os isoladores são utilizados para realizar a preservação, manutenção de colônias de fundação de linhagens SPF, axênicas, gnotobióticas ou germfree, assegurando o padrão sanitário das colônias.

É indicado para a manutenção de animais provenientes de outras instituições em unidades isoladoras, visando ao estabelecimento de

quarentena, até a certificação do padrão sanitário dos animais (Fig.

2).

Auxílio na técnica de derivação cesariana para obtenção de animais livres de contaminações (Sebesteny & Lee, 1973). A histerectomia é adotada como técnica simples para eliminar a maioria dos patógenos de animais que apresentam transmissão horizontal, sendo realizada, em condições totalmente assépticas, em unidades isoladoras construídas especialmente para essa finalidade.

Figura 2 – Apresentação esquemática do uso de unidades

isoladoras em biotérios

 

Fonte: Manual para Técnicos em Bioterismo (1996).

 

Uso de técnicas gnotobióticas na derivação

cesariana como ferramenta para a

descontaminação de colônias

Em virtude da sua simplicidade, a derivação cesariana já há muito tempo é utilizada em centros de bioterismo dos países do primeiro mundo, bem como rotineiramente nas empresas produtoras de animais, como a Iffa Credo, Charles Rivers, Taconic, Olac, entre outras. Com essa técnica, é possível a eliminação da maioria dos patógenos de animais que apresentam transmissão horizontal, sendo, portanto, útil para obtenção de colônias SPF livres de vírus, bactérias e parasitas.

A técnica deve ser realizada em condições assépticas dentro de unidades isoladoras especialmente construídas para essa finalidade.

Uma maior eficiência é observada desde que a sua realização aconteça dentro das condições abaixo indicadas:

acasalamento programado das fêmeas receptoras SPF e doadoras convencionais, mediante sincronismo do ciclo estral; preparo do isolador de histerectomia especialmente construído para essa finalidade;

conexão entre o isolador de histerectomia e isolador com fêmea receptora;

sacrifício da fêmea doadora por deslocamento cervical; preparo do abdômen para retirada do útero; isolamento do cérvix e dos cornos uterinos por amarração e retirada asséptica do útero (nos casos em que a técnica esteja sendo realizada em equipamento apropriado, essa retirada deve ser feita no primeiro compartimento do isolador de histerectomia);

passagem do útero para o segundo compartimento do isolador de histerectomia através de um tanque de imersão com solução anti-séptica (amônia quaternária a 0,5% °C a 37 °C); retirada e reanimação dos neonatos;

transferência dos neonatos reanimados para o isolador com a fêmea receptora.

OBS.: a derivação cesariana deve ter início 12 horas antes do parto normal.

 

Por que utilizamos a derivação cesariana?

Infelizmente, o caráter epidemiológico em colônias fechadas (closed colony) é extremamente elevado. Por essa razão, a introdução de animais contaminados nas colônias desencadeará uma rápida disseminação e em pouco tempo acabarão por comprometê-las de diferentes maneiras.

Além dos prejuízos que serão impostos à comunidade usuária, os patógenos comprometerão também as colônias instaladas no próprio biotério.

Dentre os prejuízos que serão observados com os agentes mais comumente encontrados destacamos:

Interferência na reprodução diminuindo a fertilidade e causando a morte de animais:

Vírus de hepatite do camundongo (MHV)

Vírus Sendai

Vírus Sialodacrioadenite (Sdav) do rato

Alta mortalidade de neonatos, anormalidades nos hormônios sexuais, alterações patológicas no trato reprodutivo, infecção em embriões causando alta taxa de aborto:

Cryptosporidium sp

Rotavírus

Alteração de vários parâmetros reprodutivos: motilidade dos espermatozóides, implantação de embrião, ossificação do esqueleto do feto, alteração da citologia vaginal, prejuízos nos testes de fertilização in vitro, redução da fertilidade em até 50% e distúrbio na transferência de embriões, além de teratologia.

Mycoplasma pulmonis

Embora a placenta e o sistema imunológico da mãe constituam uma importante ‘barreira’, existem patógenos capazes de contaminar os animais ainda durante a gestação, quer por rompimento da barreira placentária, quer por serem residentes da cavidade uterina.

Dentre eles, destacamos:

Agentes que atravessam a barreira placentária:

Retrovírus murino (leucemia, tumor mamário) Vírus da coriomeningite linfocitária (LCM)

Vírus da ectromélia (poxvírus)

Parvovírus (Kilhan rat– KRV, toolan-H1, MVM) Clostridium piliforme

Infecção uterina (provavelmente sem passar a barreira placentária):

Pasteurella pneumotrópica

Salmonella sp

Mycoplasma pulmonis

Escherichia coli (fase progestacional)

A técnica de derivação cesariana realizada sistematicamente (e em alguns casos mais de uma vez em gerações sucessivas), mostra-se bastante eficiente na erradicação desses patógenos.

 

A utilização de unidades isoladoras em ensaios

experimentais

Atualmente, diversos modelos de isoladores são confeccionados e utilizados para fins de experimentação.

Nos países do primeiro mundo, a aplicação dessa tecnologia é bastante comum. Em alguns países em desenvolvimento, como o Brasil, a utilização desse equipamento na pesquisa tem se acentuado de maneira significativa. A principal razão para essa mudança é a segurança que o equipamento oferece.

Dentre as inúmeras aplicações que justificam sua utilização, podemos citar:

Os isoladores possibilitam a realização de experimentos com animais imunodeficientes como Scid, XID, NOD, Nude e outros, obtidos por meio de manipulação genética como o knockout, assegurando qualidade e reprodutibilidade aos resultados. Essa tecnologia oferece segurança ao estudo com agentes zoonóticos.

A produção de anticorpos em camundongos ou ratos tendo em vista a realização de Map Test (Mouse Antibody Production

Test) ou Rat Test (Rat Antibody Production Test). Esses testes consistem na inoculação de animais SPF, VAF (Virus Antibody Free) imunocompetentes, com amostras de material biológico específico. Após quatro semanas, avalia-se a produção de anticorpos contra agentes infecciosos que pudessem estar presentes nas amostras. A técnica somente pode ser realizada em isoladores onde as condições são controladas, impedindo a ocorrência de interferências na produção dessas moléculas.

A Aplicação de Unidades Isoladoras na Indústria

Com o advento dos isoladores, não apenas os laboratórios de pesquisa ou os centros de bioterismo se beneficiaram. Na indústria farmacêutica, por exemplo, os isoladores são utilizados em diversas etapas, estendendo-se desde a pesquisa de um novo fármaco até o seu envase. Além disso, o preparo de soluções, os testes de esterilidade e a manipulação de drogas tóxicas, entre outras rotinas, são realizados com o auxílio dessa tecnologia.

Nos países desenvolvidos, as indústrias farmacêuticas investem milhões de dólares em isoladores, uma vez que é imprescindível a qualidade dos processos na aprovação de novos princípios ativos. Atualmente, o nível de exigência dos processos instalados nessas indústrias estimulou o surgimento de empresas cuja atividade principal é desenvolver novos modelos de isoladores.

Entretanto, não é apenas na produção de fármacos que essa tecnologia se faz presente. A indústria eletrônica, por exemplo, também se beneficia da segurança oriunda das unidades isoladoras. Para elas, a produção e o armazenamento de componentes microeletrônicos, de forma que os mesmos fiquem protegidos da interferência de poeiras tóxicas, é um importante fator de qualidade no processo de fabricação.

Tillett (1999) descreveu o uso dos isoladores na indústria como uma alternativa para manter a sala limpa, pois é possível o preparo de produtos com níveis de riscos 2 e 3. O equipamento utilizado em produtos com nível de risco 2 apresentava paredes rígidas em acrílico e policarbonato. O equipamento para manipulação de produtos com nível de risco 3, por envolver a manipulação de patógenos perigosos e agentes citotóxicos, possuía um desenho capaz de prevenir a contaminação cruzada entre o operador e os produtos, bem como entre estes e o meio ambiente externo.

 

Aplicação das técnicas gnotobióticas e dos

isoladores em humanos: imunodeficiência e

cirurgias

O comprometimento imunológico descrito como ‘deficiência imune severa combinada’ ou Scid (Severe Combined Imune Deficiency) é uma síndrome rara, congênita, que resulta na ausência da imunidade por células B e T. A doença foi identificada pela primeira vez em crianças, por volta de 1950 (Glanzmann & Riniker, 1950; Hitzig et al., 1958). Os portadores dessa síndrome morriam antes de completarem um ano de idade.

Embora alguns pacientes Scid possam ser tratados através de transplante de medula óssea, quase sempre os doentes são notavelmente susceptíveis a infecções por uma série de agentes, e a maioria só sobrevive quando completamente isolados do ambiente exterior. Essa condição ímpar somente pode ser oferecida com unidades isoladoras, tais como a descrita por Travnicek et al. (1977). O equipamento idealizado por esse autor possibilitou a manutenção de um bebê em condições estéreis e controladas após a realização da cesariana.

Travnicek & Mandel (1987) relataram um caso com pressuposição de imunodeficiência anterior ao nascimento. A partir dessas considerações, foi possível realizar a cesariana em isolador com condições totalmente assépticas. Durante um mês, o bebê foi mantido no equipamento e nesse período foi possível investigar sua condição imunológica e realizar a colonização com bactérias de linhagens selecionadas, preparando-o para a repopulação da microbiota.

Tanto as experiências quanto as tecnologias realizadas em gnotobiologia têm beneficiado o homem de diferentes maneiras. Um exemplo é a influência nos cuidados com nascimentos prematuros e com neonatos de alto risco, observado na pediatria contemporânea.

Pacientes são mantidos em unidades isoladoras para prevenção de infecções pós-operatórias, tratamento de queimaduras e de sistema imunológico imunossuprimido (Cohn Jr. & Heneghan, 1991), além de tratamento de pacientes com leucemia aguda (Trexler, Spears & Gaya, 1975).

Em cirurgias ortopédicas, o isolador desempenha um importante papel na prevenção de infecções pós-operatórias (Zucman & Benichou, 1978).

Hirsch, Renier & Pierre-Kahn (1978) mostraram a eficiência do isolador em cirurgias e a redução das infecções em pacientes que estavam em tratamento de hidrocefalia. Essa eficiência foi atribuída à eliminação de agentes contaminantes provenientes do ar (airborn) e à manipulação asséptica.

Trexler, Emond & Evans (1977) descreveram o uso de isoladores de plástico com pressão negativa para a manutenção de pacientes com suspeitas de infecções de risco como lassa, marburg e vírus ebola. Com esse equipamento, pacientes foram mantidos por 32 dias, assegurando a integridade do ambiente hospitalar e eliminando os riscos para a equipe médica.

Doença como a leucemia é freqüentemente acompanhada pela imunodeficiência clínica, após o transplante de medula óssea. Pacientes mantidos em isoladores e sob sistema de barreiras apresentam menor incidência de doença GVHD (enxerto versus hospedeiro) após o transplante (Mahmoud et al., 1984).

 

A influência da gnotobiologia na infra-estrutura

em pesquisa para o desenvolvimento de novos

modelos De certa forma, os isoladores permitem a manipulação do sistema imunológico, uma vez que, experimentalmente, camundongos imunodeficientes Scid/Scid (homozigotos) são utilizados como receptores de células derivadas do sistema imunológico do homem. Esses camundongos não possuem linfócitos T e B, embora tenham células hematopoéticas normais. Quando os camundongos CB17 Scid/Scid são inoculados com linfócitos humanos, os linfócitos sobrevivem e funcionam durante vários meses no animal, produzindo anticorpos e células T imunes. Esse sistema imunológico humano pode ser testado quanto a sua capacidade de compor resposta a uma vacina em experimentação, por exemplo, contra o HIV

Entretanto, os camundongos Scid somente podem ser criados no interior de unidades isoladoras. É uma condição estrita, pois em ambiente aberto, mesmo que sanitariamente controlado, esses modelos podem reverter para a forma Scid leaky, imunologicamente anormal e descaracterizada por apresentar baixo título de imunoglobulinas. Portanto, os equipamentos asseguram que os animais manipulados possam permitir o estudo de doenças como a AIDS sob condições definidas e adequadas, bem como endossam qualificação de protocolos terapêuticos em condições apropriadas e isentas de riscos para o homem.

A introdução de genes exógenos em organismos vem sendo progressivamente utilizada em diversas áreas da biologia dos mamíferos. A maior parte desse trabalho tem sido realizada com camundongos, embora os mesmos princípios sejam aplicáveis a outros animais, como porcos, coelhos, ovelhas. Por essa razão, os camundongos transgênicos são animais modificados, possibilitam a expressão de genes in vivo e devem ser isolados de outros de forma a se evitar a disseminação genética na natureza oriunda, por exemplo, da fuga do animal manipulado. Outro caso no qual o animal geneticamente modificado é residente obrigatório desses equipamentos é na produção de animais knockouts. Estes têm, em sua maioria, comprometimento do sistema imune e, por isso, necessitam de tratamento diferenciado para que seu uso seja viável, quer seja para programas de reprodução, quer seja para a experimentação.

Em países desenvolvidos, é comum a utilização desses equipamentos e de suas tecnologias. Porém, em países da América Latina como o Brasil, a carência de programas que promovam a divulgação de seu uso é notória. Apenas algumas instituições e centros de pesquisa presentes na região Sudeste do País os utilizam e mantêm programas de formação de recursos humanos especializados em sua operação.

 

Outros equipamentos originados a partir dessas

tecnologias

Nos países desenvolvidos, é muito grande a utilização de equipamentos oriundos da otimização das condições de ambiente.

Essas novas tecnologias não apenas reduzem os custos da construção ou da adequação física para biotérios de porte médio, mas principalmente permitem a instalação de biotérios experimentais com excelente nível de segurança e dentro das necessidades de cada espécie animal.

Em países como França, Alemanha, Inglaterra e Estados Unidos é comum considerar esses equipamentos nos projetos de pesquisa ou de adequação física de biotérios de centros de pesquisa ou de produção animal.

Dentre esses equipamentos, destacam-se as estantes ou armários

ventilados (Fig. 3).

Figura 3 – Estantes ventiladas para camundongos e ratos. Área

instalada no Instituto de Pesquisas Energéticas (Ipen-SP)

 

Foto: Alesco Indústria e Comércio Ltda.

Estantes ou Armários Ventilados

Atualmente, existem vários tipos de estantes que podem ser adotadas para a manutenção dos animais utilizados em experimentação, como camundongos, ratos, coelhos e outros.

Assim como os isoladores, as estantes ventiladas aumentam a segurança sanitária, reduzindo o risco de infecções que poderiam interferir nas pesquisas. São adequadas para laboratórios em função da otimização do espaço aliada ao manejo simples dos animais. É possível a manutenção de camundongos e ratos na mesma estante, pois o equipamento possui compartimentos independentes.

Normalmente, esse equipamento é confeccionado em material resistente às exigências das rotinas e tem capacidade para alojar uma razoável quantidade de animais. O sistema de ‘insuflamento’ do equipamento possibilita o deslocamento de ar nos diversos níveis sobre as gaiolas, portanto a retirada de amônia e CO é contínua. 2 Assim, há eliminação dos odores provenientes das excretas dos animais, bem como dos poluentes por eles gerados.

No Brasil, diversas instituições de pesquisa possuem esses equipamentos, demonstrando que o uso dessa tecnologia tem crescido nos últimos anos, em virtude, sobretudo, da praticidade do equipamento, mas também graças à conscientização, por parte da comunidade, da influência das condições ambientais na obtenção de resultados reprodutíveis e universais.

Microisoladores ou Top Filters

Existem divergências para a definição e utilização desses equipamentos. A experiência nos permite inserir a observação de que a manutenção de colônias de camundongos e ratos em isoladores pressupõe uso contínuo e prolongado com total segurança. Nesse contexto, os microisoladores ou top filters não oferecem a mesma proteção aos animais. Os microisoladores ou top filters são utilizados para a manutenção de ensaios experimentais (sem risco de zoonoses). Procedimentos especiais devem ser adotados, tais como troca de gaiolas em fluxo laminar, entre outros.

 

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