26. Criopreservação de embriões murinos em biotérios

26. Criopreservação de embriões

murinos em biotérios

 

Luiz Augusto Corrêa Passos; Ana Maria Aparecida Guaraldo; Delma Pegolo Alves; Luiz Afonso Pires; Thiago Marinho Santana; Thiago Henrique Cimadon Dini

 

Introdução

O desenvolvimento científico e tecnológico influi diretamente na qualidade de vida da população humana. Novas técnicas, pesquisas e tendências são assimiladas diariamente pela sociedade, tornando-se, rapidamente, eventos corriqueiros. Na verdade, estamos de tal modo acostumados com certos avanços que sequer pensamos no quão difícil era, há alguns anos, executar certas tarefas, curar certos males ou mesmo escrever um texto de fácil entendimento.

Particularmente nas ciências biomédicas, os avanços nos propiciaram um melhor entendimento da natureza da qual fazemos parte. Palavras como DNA, clonagem, ecossistema e genoma já fazem parte do vocabulário de pessoas que não estão envolvidas com a execução direta da ciência, mas que são diretamente influenciadas por ela. O sucesso da pesquisa científica não pode ser negado. O fato de hoje confiarmos nos serviços médicos, abandonando técnicas de curandeirismo, e dispormos de um arsenal cada vez mais completo de vacinas, drogas e técnicas cirúrgicas se deve a esse avanço tecnológico. Entretanto, um resultado científico somente é válido se possuir reprodutibilidade.

Com isso, fez-se necessário o surgimento de um outro ramo da ciência, capaz de fornecer modelos animais adequados às necessidades dos pesquisadores e que, acima de tudo, pudessem garantir tal reprodutibilidade. Além disso, com o surgimento desse novo ramo e de modelos animais, a interferência nos resultados foi sendo sistematicamente reduzida, garantindo um dinamismo cada vez maior à pesquisa científica.

Assim, o estabelecimento da ciência e tecnologia em animais de laboratório possibilitou a padronização dos modelos tanto do ponto de vista de seus aspectos biológicos e de saúde quanto das condições de ambiente, nas quais os mesmos devem ser mantidos. Entre essas novas exigências, destacam-se a adequação do espaço físico, a qualidade do modelo animal e o controle dos materiais em insumos necessários à manutenção das colônias. Como conseqüência dessa padronização sanitária, genética e ambiental, passamos a observar uma redução no número de animais utilizados, assegurando a universalidade e a reprodutibilidade experimentais, bem como o desenvolvimento de novas tecnologias

(Fig. 1).

Figura 1 – Algumas das conseqüências da padronização dos

modelos animais

 

Entre as tecnologias desenvolvidas, destaca-se a criopreservação de embriões murinos, assunto que será discutido no decorrer deste capítulo.

 

Histórico da manipulação de embriões

No fim do século XIX, cientistas interessados no estudo de aspectos relacionados à reprodução e ao desenvolvimento de organismos superiores iniciaram os primeiros ensaios com a finalidade de estabelecer metodologias que permitissem a manipulação de embriões. Inicialmente, o coelho foi o modelo experimental adotado, tendo em vista suas características biológicas favoráveis, como o tamanho relativamente grande do ovo (o que facilitava a manipulação) e a ovulação induzida pelo acasalamento, fato de elevada conveniência para a definição precisa da idade dos embriões.

Entretanto, os resultados obtidos não foram totalmente satisfatórios. As dificuldades relativas à compreensão das necessidades nutricionais e as limitações impostas pelas características físico-químicas dos meios de coleta e cultivo até então utilizados consistiam em barreiras técnicas a serem rompidas.

No princípio do século XX, juntamente com o desenvolvimento da química fina responsável pela obtenção de reagentes livres de impurezas, que poderiam ser críticas do ponto de vista toxicológico, a embriologia passou por progressos significativos com profundos reflexos no sucesso de coleta e cultivo de embriões no estágio de pré-implantação.

Assim, apenas na década de 40 do século XX, com Hammond, o cultivo de embriões pôde ser conduzido de maneira sistemática até a fase de ‘blastocisto’. Todavia, estágios de desenvolvimento mais precoces ainda careciam de ajustes na formulação dos meios. Conseqüentemente, tornou-se impossível que os embriões se enquadrassem em índices de qualidade, possibilitando maiores avanços, embora certas barreiras técnicas tivessem sido rompidas (vias de acesso para implante, instrumental básico adequado etc.).

Finalmente, em meados da década de 50, Withen propôs uma nova formulação, que passaria a ser utilizada tanto na coleta quanto no cultivo de embriões. Essa nova formulação se mostrou bastante eficiente, ampliando significativamente o número de embriões implantados com sucesso. Posteriormente, outros fatores relacionados à importância das condições de cultivo para o sucesso do implante seriam apontadas por Anne MacLaren.

Com isso, estavam solucionados os aspectos básicos, porém essenciais, das etapas de coleta, congelamento, descongelamento e implante de embriões. A década de 60 foi de grande importância para tal desenvolvimento. Esforços foram realizados de forma a esclarecer tanto as necessidades nutricionais dos embriões quanto os mecanismos envolvidos na cinética da água em células submetidas a temperaturas abaixo de zero, e sua influência na viabilidade dos embriões congelados.

Agorajá é possível o estabelecimento de bancos de embriões – local onde podem ser armazenadas grandes quantidades de linhagens (elevado estoque potencial) por um período indeterminado –, nos quais estes podem estar protegidos tanto de contaminações sanitárias quanto de uma deriva genética.

Quadro 1 – Histórico resumido da embriologia experimental

 

Quadro 1 – Histórico resumido da embriologia experimental

(continuação)

 

Criopreservação e tecnologia de manipulação de

embriões

Importância e Aspectos Básicos

A criopreservação de embriões, tanto em biotérios quanto em instituições de pesquisa, é uma poderosa ferramenta. Por meio da manipulação de embriões (em todos os seus níveis), pode-se interferir em diversos protocolos experimentais, sendo que em alguns deles esta tecnologia é absolutamente indispensável. Além desses aspectos, em nosso dia-a-dia nos deparamos, sem nos darmos conta, com outros benefícios advindos dessa tecnologia. Vejamos alguns exemplos:

Testes de Toxicidade (Efeitos Embriotóxicos)

Consiste na utilização de embriões para a observação do caráter toxicológico de diferentes drogas. Um exemplo é seu emprego no teste de produtos (novos ou não) que serão utilizados na agricultura.

Caracterização Toxicológica de Fármacos (Teratogênicos)

Certas drogas podem alterar o desenvolvimento normal de organismos. Tais drogas são chamadas ‘teratogênicas’ e a importância de seu reconhecimento se evidencia ainda mais quando de seu uso em gestantes. Utilizando a tecnologia de manipulação de embriões, pode-se prevenir efeitos indesejáveis de uma droga, primeiramente no embrião e, posteriormente, no próprio feto.

Medicina Humana Aliada à Reprodução

Ensaios com embriões, utilizando diferentes protocolos, podem auxiliar em programas de reprodução humana como a fertilização in vitro, bem como na análise embrionária de distúrbios fetais, entre outros.

 

A tecnologia de manipulação de embriões aliada

à produção de transgênicos e quimeras

Algumas Considerações Históricas Na década de 60 do século XX, Kristof Tarkowski utilizou blastômeros para a quebra da zona pelúcida, visando ao desenvolvimento da primeira quimera. Beatrice Mintz propôs um novo processo e obteve sucesso na digestão da zona pelúcida de um embrião. Finalmente, Gardner conseguiu injetar células isoladas de embriões doadores em blastocistos hospedeiros (quimera).

RudolfJaenich e Beatrice Mintz, na década de 70, executaram a primeira introdução direta de material genético em embriões de camundongos, munindo-se do DNA do vírus SV-40. Paralelamente, ocorreu a diversificação no uso das quimeras, sendo que essa utilização se estendia a estudos imunológicos, padrões de pigmentação, diferenciação sexual e estudos de diferenciação celular, entre outros.

A década de 80 foi marcada pela microinjeção de gene clonado (no caso o gene tk do vírus da herpes simplex) em fibroblasto cultivado, possibilitando, assim, a manipulação de material para introdução posterior e influenciando na concepção do transgênico. Ainda nesse período, Gordon executou a microinjeção do gene clonado em pró-núcleo de embriões de uma célula, aproximando-se da transgênese como estabelecida atualmente.

Matéria-Prima para o Desenvolvimento de Modelos Especiais

A abordagem da utilização de tecnologias de manipulação de embriões em pesquisa é deveras ampla. Com elas, podem ser manipulados desde embriões de uma célula até indivíduos em estágio de blastocisto, permitindo, dessa forma, a produção de transgênicos, knockouts e quimeras, entre outros.

A ‘transgenia’ é uma ferramenta científica que possibilita a criação de novos modelos. Esse processo se dá tanto pela microinjeção de

fragmentos de DNA em um dos pró-núcleos (Fig. 2) quanto pela produção de quimeras formadas a partir da incorporação de células de uma outra linhagem no blastocisto, de uma linhagem receptora. As células em questão pertencem à massa celular interna (MCI) de um embrião da linhagem doadora e serão introduzidas na blastocele do embrião receptor. Após serem incorporadas, as características da linhagem doadora serão manifestadas na linhagem receptora. Assim sendo, indivíduos originados por essa técnica terão informações genéticas das duas linhagens. É possível, portanto, que o animal apresente em seu tecido somático heranças de duas

origens genéticas diferentes (Fig. 3).

Há ainda uma técnica que consiste na fusão das duas técnicas anteriores para a obtenção de transgênicos. Por meio dessa técnica os animais quiméricos serão selecionados após a diferenciação celular, sendo o enfoque principal destinado àqueles cuja característica desejada esteja presente nas células reprodutivas

(gametas) (Fig. 4).

Figura 2 – Desenho da transgênese por microinjeção

Figura 3 – Confecção da quimera

Figura 4 – Confecção de uma quimera utilizando a transgênese para

a obtenção de animais com células germinativas geneticamente

alteradas

 

A Tecnologia de Manipulação de Embriões e a

Produção de Modelos Animais Geneticamente

Modificados: quimeras, transgênicos e

knockouts

A instalação de laboratórios de manipulação de embriões em Centros produtores de modelos animais, além de possibilitar importantes vantagens como o banco de embriões (perpetuação dos padrões sanitários e genéticos originais dos animais) e a descontaminação para agentes de transmissão vertical (como no caso de alguns vírus), também se mostra essencial nas etapas de produção de animais de laboratório geneticamente modificados.

Esses animais geneticamente modificados podem nos fornecer modelos especiais para pesquisas específicas, permitindo, por exemplo, que se estude os efeitos funcionais do produto de um gene específico. Isso é possível uma vez que um camundongo transgênico pode apresentar diferentes características, como super expressar o gene em um tecido específico (permitindo a sua análise in vivo), ou até mesmo impedir que um determinado gene se expresse constituindo-se em um modelo knockout para um outro.

Nessa parte do capítulo, iremos discutir objetivamente a aplicação da tecnologia de manipulação de embriões na obtenção de modelos.

Para se criar um camundongo transgênico, uma seqüência de DNA, diferente daquela já existente na célula, é introduzida. Esta ‘nova’ seqüência é conhecida como estrangeira, e pode ser de diferentes origens.

A introdução pode ser realizada por diferentes métodos, dependendo dos objetivos. A mais divulgada e conhecida é a utilização de um micromanipulador que permite uma microinjeção

em um dos pronúcleos de óvulos fertilizados (ovos). (Fig. 2).

Após essa injeção, os ovos são implantados em ovidutos de fêmeas receptoras pseudoprenhas, de forma que se desenvolva uma gestação normal. Normalmente, a taxa de sucesso é muito baixa, mesmo com a injeção de algumas centenas de cópias de um determinado gene. A literatura registra o índice máximo de 25% dos animais nascidos serem transgênicos para as cópias inseridas.

As cópias do transgene, na quase totalidade das vezes, são inseridas em sítios aleatórios de cromossomos e transmitidas como uma herança mendeliana simples. O fato da integração usualmente ocorrer antes da replicação do DNA permite que cerca de 75% dos neonatos transgênicos portem o transgene em todas as suas células, incluindo as células germinativas (reprodutoras). Dessa forma, os camundongos ‘fundadores’, que carregam o transgene em heterozigose, podem ser programadamente acasalados, segundo a conveniência dos pesquisadores.

Talvez a maior contribuição dos animais transgênicos seja o fato de que a tecnologia de transgênese permite que se estude a expressão de genes em um tecido específico. Isto é factível, uma vez que se pode ligar seqüências codificadoras do gene, que se pretende estudar, a seqüências regulatórias responsáveis por sua expressão em um tecido (do órgão a ser pesquisado).

Atualmente, os transgenes podem também ser expressos segundo um estímulo externo causado, por exemplo, por uma droga ou por hormônios. Nesse caso, utilizam-se promotores capazes de responder a esses agentes.

Outro método muito poderoso na produção de modelos animais geneticamente modificados é a manipulação de genes visando à produção de animais knockouts (os animais recebem esse nome em virtude de terem um gene inativado, ‘nocauteado’).

O animal knockout possui um gene alterado intencionalmente, de forma que ele não funcione (em decorrência a uma disruptura), ou é o produto de sua expressão que está muito diferente e por esta razão também não funciona (alteração na sequência do gene – mutação). Em ambos os casos, o animal não apresentará um padrão de normalidade para o gene, permitindo estudos mais detalhados de sua função in vivo. Uma técnica muito utilizada na produção de animais knockout é a recombinação homóloga.

Recombinação Homóloga

Por meio dessa técnica, a integração de uma determinada seqüência introduzida na célula passa a ser parcialmente dirigida. Isso é possível sempre que se conheça a seqüência de bases do gene que se quer inativar na célula receptora. Para tanto, a seqüência do DNA que será introduzida sofre modificações em laboratório (conhecidas como construção), que permitem sua recombinação, por homologia, à seqüência presente no gene-alvo endógeno, podendo substituí-lo.

Os materiais utilizados, nesse protocolo, são as células-tronco (ou células embrionárias pluripotentes, também conhecidas como stem cells), normalmente extraídas de embriões na fase de blastocisto. Essas células são manipuladas para a inserção da seqüência de DNA, e uma das metodologias muito utilizada é a eletroporação. O eletroporador é um aparelho que abre minúsculos poros na membrana celular, permitindo a entrada do fragmento de DNA. Após a introdução do DNA, as células tratadas são selecionadas com o intuito de separar aquelas que sofreram recombinação homóloga.

O pesquisador Mario Capecchi e seus colaboradores, da Universidade de Utah, nos Estados Unidos, descreveram, em 1986, um método bastante eficiente e ainda muito utilizado para a identificação e seleção das células recombinantes. Esse método é conhecido como ‘dupla seleção’ e se fundamenta na expressão de genes repórter dentro e ao lado da construção gênica.

O método se baseia no fato da construção apresentar seqüências homólogas àquelas presentes no genoma receptor nos dois lados do gene que se quer inativar (por exemplo, o gene ‘K’). Dentro das seqüências homólogas, é ligada ao gene ‘K’ e também a um gene que dá resistência ao antibiótico, a neomicina (gene ‘Neo’).

No lado de fora dessa região, que contém as seqüências de homologia e também o gene ‘Neo’, é colocado um outro gene, o gene da timidina quinase (gene ‘tk’). Após a transfecção em um eletroporador (conforme escrito acima), as células são cultivadas em meio de cultura. Nesse meio, é colocado o antibiótico neomicina (ou um análogo dele, o G418) para que as células possam ser selecionadas. Das células colocadas no meio, apenas aquelas que integraram o gene ‘Neo’ de forma estável em seu genoma sobreviverão, pois serão resistentes ao antibiótico. As demais células morrerão. Esse processo é conhecido como ‘seleção positiva’.

As células sobreviventes são então cultivadas em outro meio que contém uma droga denominada ganciclovir, cuja função é matar as células nas quais o gene ‘tk’ está se expressando. Esse processo é conhecido como ‘seleção negativa’, e se baseia no fato de que quando a recombinação ocorreu ao acaso (e por esta razão não é homóloga), o gene ‘tk’ permaneceu ligado ao gene ‘K’, e as células puderam, então, ser selecionadas.

As células que sofreram recombinação homóloga perdem o gene ‘tk’, pois ele não está na região de homología. As células sem o gene ‘tk’ não morrem na presença de ganciclovir, podendo ser cultivadas, antes de serem introduzidas, no embrião (quimérico) que

será implantado nas fêmeas receptoras pseudoprenhes (Fig. 5).

Figura 5 – Esquema para a produção de modelos por recombinação

homóloga

Banco de embriões

Reposição Imediata das Linhagens

O banco de embriões já é uma realidade em alguns biotérios e, dada a sua simplicidade, deveria ser de uso rotineiro em todas as instituições. Com essa ferramenta, pode-se oferecer toda a segurança às colônias, uma vez que possibilita a reposição imediata das linhagens.

As colônias de fundação estão sujeitas a acidentes que não podem ser totalmente evitados, mesmo com programas de prevenção. Assim sendo, faz-se necessária uma técnica que permita a sua reposição. Na década de 80, no The Jackson Laboratory, localizado em Bar Harbor, Maine, nos Estados Unidos, um incêndio acabou por dizimar uma grande parte das matrizes lá existentes. Porém, devido a um banco de embriões completo e funcional, os pesquisadores puderam restabelecer as colônias sem maiores conseqüências para o funcionamento do centro.

Além do prejuízo decorrente da perda de matrizes, os acidentes em biotérios podem comprometer as atividades de pesquisa que utilizam os modelos fornecidos por eles, gerando graves conseqüências. Por essa razão, a reposição imediata das colônias é muitas vezes a única alternativa para minimizar tais efeitos negativos. Com o auxílio de um banco de embriões funcional e operante, é possível o repovoamento rápido e eficiente das colônias.

Perpetuação de Padrões Genéticos e Sanitários

Uma outra grande vantagem no estabelecimento de um banco de embriões é a perpetuação dos padrões sanitários e genéticos. Através desse banco, linhagens podem ser conservadas em nitrogênio líquido, preservando, assim, suas características originais sem que haja perigo de interferência por contaminações genéticas ou sanitárias.

A contaminação genética ocorre por meio da propagação de um gene não original dentro de uma linhagem mantida no biotério. Isso pode ser conseqüência de falhas humanas ou materiais, que permitem o escape de um animal de sua gaiola e sua entrada em outra com animais de linhagem diferente. A ocorrência da cópula irá certamente definir uma progênie geneticamente contaminada. Isso é ainda mais grave nos casos em que duas linhagens de constituição genética diferente, mas de mesma aparência (fenótipo), são mantidas juntas em uma mesma sala. Nesse caso, a progênie não poderá ser diferenciada pela coloração e, portanto, a contaminação terá grande chance de se incorporar na colônia, descaracterizando-a. Do mesmo modo, uma contaminação sanitária (por vírus, fungos, bactérias, protozoários, por exemplo) também irá causar a descaracterização da linhagem.

Ambas as contaminações comprometem a reprodutibilidade e a universalidade experimentais. A universalidade define a propriedade de um resultado obtido ser válido em qualquer centro de pesquisa, desde que realizado com o mesmo modelo animal e nas mesmas condições. Já a reprodutibilidade representa a garantia de que o resultado experimental será o mesmo se repetido em épocas diferentes, utilizando o mesmo modelo nas mesmas condições. O advento do banco de embriões viabilizou essas metas.

Estoque Potencial de Linhagens

A manutenção de diversas linhagens em um biotério é, muitas vezes, um desejo justificável da comunidade científica, uma vez que permite o desenvolvimento de vários ensaios experimentais. Entretanto, isso é muito caro e exige a adoção de diversas outras providências, tais como capacitação de recursos humanos, além da adequação dos espaços físicos (algumas vezes por exigência técnica da própria linhagem) e dos insumos básicos para a manutenção dos animais. Os embriões do banco não possuem tamanhas necessidades, bastando-lhes um suprimento de nitrogênio líquido para que permaneçam congelados.

Assim, o estabelecimento do banco permite ao biotério a manutenção de um grande número de linhagens a baixo custo. Além disso, pode-se otimizar a programação de entrega de animais à comunidade usuária. Certas linhagens, por permanecerem durante muito tempo sem solicitação de uso, são criopreservadas, podendo ser descongeladas e reimplantadas no centro, caso haja a necessidade.

 

Descontaminação

Auxílio à Técnica de Derivação Cesariana

A técnica de derivação cesariana vem sendo amplamente utilizada como forma de suporte a programas de erradicação de patógenos em colônias contaminadas de camundongos e ratos. Também

chamada de histerectomia (Fig. 6), é um procedimento bastante simples, porém de relativa eficiência, uma vez que nos casos de contaminação por patógenos de transmissão vertical (como alguns vírus e micoplasma, por exemplo), o sucesso na eliminação total do agente pode ser comprometido. Isso ocorre porque alguns patógenos atravessam a barreira placentária e contaminam o feto ainda em desenvolvimento no útero materno.

Quando associada a programas de coleta, lavagem e transferência de embriões, o número de casos bem-sucedidos de descontaminação por esses agentes aumenta significativamente. A zona pelúcida do embrião é uma barreira de proteção deveras eficiente e, durante a execução do protocolo, as repetidas lavagens, as quais os embriões são submetidos, retiram por arraste os contaminantes aderidos a ela.

Assim, a obtenção de colônias virus-free e axênicas é assegurada com a execução de uma ou duas histerectomias, seguida de acasalamentos programados para a coleta e transferência de embriões em fêmeas receptoras, comprovadamente livres de patógenos.

Figura 6 – A técnica de histerectomia ou derivação cesariana

 

Transporte Facilitado

Pode-se, com o apoio dessa tecnologia, transportar com segurança e facilidade um grande número de embriões de diferentes linhagens e espécies de animais reduzindo-se, portanto, custos e problemas relacionados ao transporte de animais em maior volume ou de grande porte.

Redução de Custo das Colônias de Fundação

Em centros que produzem animais sanitária e geneticamente certificados, o custo da manutenção das colônias de fundação é muito elevado. Esse fato é decorrente dos cuidados necessários para a manutenção desses animais (acasalamentos, isolamento, alimentação, controle de qualidade etc.). Por meio do estabelecimento do banco de embriões, o número de casais necessários nas colônias de fundação é drasticamente reduzido, acarretando uma redução nos custos dessas matrizes.

Treinamento de Pessoal Finalmente, uma consideração cabível é a importante contribuição dessa tecnologia para a equipe de técnicos. O contato com esse trabalho, aparentemente sofisticado, tem efeito estimulante sobre a equipe, que se sente muito valorizada.

 

Principais etapas da tecnologia de

criopreservação

O estabelecimento de uma rotina para o congelamento de embriões acontece em várias etapas e apresenta diferentes necessidades. Para melhor compreensão, nós as separamos em duas partes.

Parte 1

Necessidades Gerais (preparo dos materiais, drogas e animais)

Para a realização da técnica, é indispensável o preparo de

alguns itens. Dentre eles destacam-se os seguintes materiais:

meios de coleta e cultivo (Brinster, PB1, M16, Whiten etc.) machos vasectomizados

fêmeas doadoras (superovulação e acasalamento normal); hormônios (estimulante de folículos e luteinizante) drogas e anestésicos

materiais cirúrgicos

Parte 2

Coleta de Embriões

Os embriões são a matéria-prima utilizada para a formação do

banco. Sua obtenção é o princípio de todo o processo e exige

os seguintes materiais:

preparo do meio de coleta (podem ser utilizados diferentes meios, como PB1 e Han F10)

preparo dos capilares de manipulação

seringa e agulha para a lavagem do oviduto placas de Petri descartáveis

tesouras de ponta romba e fina

pinças

fêmeas doadoras (acasaladas de forma programada com ou sem superovulação)

Congelamento

A etapa de congelamento dos embriões é, a despeito da

simplicidade, extremamente crítica. A qualidade do meio

utilizado, associada ao preparo dos materiais, determina o

sucesso no congelamento, preservando a viabilidade dos

embriões. Nessa etapa, a atenção deve ser para os seguintes

materiais:

preparo dos meios de congelamento. Esses meios são obtidos a partir da solubilização de substâncias crioprotetoras no meio de coleta (podem ser utilizadas diferentes substâncias para a proteção dos embriões, como DMSO, propileno glicol etc.);

preparo de micro capilares de manipulação; preparo dos minitubos para acondicionamento dos embriões em meio a solução crioprotetora (existem diversos modelos disponíveis; é fundamental que possam ser rotulados);

disposição dos embriões nos minitubos e transferência destes para o banho refrigerado;

transferência dos minitubos para os reservatórios (contêineres) com nitrogênio líquido.

Descongelamento

De certa forma, juntamente com o cultivo, esta etapa monitora

as anteriores. No descongelamento, os embriões receberam um

tratamento que permitira o retorno a mesma situação biológica

que se encontravam logo após a sua retirada do interior do

oviduto da fêmea doadora. Esse tratamento consiste na

colocação de um mesmo volume de um meio, sem crioprotetor

(isotônico), ao meio recém-extraído do minitubo e que contém

os embriões. Esse procedimento visa a diluir o crioprotetor,

pois, na temperatura ambiente, o mesmo é tóxico e

compromete a viabilidade dos embriões. Após três diluições

seriadas, os embriões podem ser transferidos para um meio de

cultivo isotônico.

retirada dos minitubos do reservatório: para descongelamento dos embriões;

deposição dos embriões em meio de cultura (reidratação); cultivo de embriões em estufa de CO , pelo período de 12h 2 a 14h, na temperatura de 37 °C e percentual de 4,5% de CO . 2

observação dos embriões descongelados; transferência de embriões para as fêmeas receptoras pseudoprenhes.

Implante

Após o descongelamento, o cultivo ou mesmo quando se

deseja realizar uma transferência a fresco para

descontaminação, os embriões deverão ser introduzidos na

fêmea receptora preparada para recebê-los. Este preparo é a

indução de uma pseudoprenhez na fêmea receptora, obtida a

partir de sua colocação junto a um macho vasectomizado. Isto

possibilita que a fêmea desenvolva uma fisiologia similar àquela

observada na gestação normal, garantindo aos embriões um

ambiente próximo ao observado nesse tipo de gestação. O local

onde os embriões serão introduzidos é o mesmo de onde eles

foram retirados: o oviduto. Nessa etapa da técnica, devem ser

adotadas as seguintes providências:

anestesia da fêmea receptora (preferencialmente híbrida) previamente acasalada com o macho vasectomizado; incisão para a exposição do corno uterino, com posterior apresentação do oviduto;

ruptura da bolsa ovariana e introdução dos embriões via infundibulum;

retorno do corno uterino e do oviduto à cavidade peritonial; suturas no peritônio e pele;

acompanhamento pós-cirúrgico e posterior detecção de prenhez.

OBS.: Os processos anteriormente citados fazem parte de um protocolo que deve ser fielmente seguido, sob pena de não se evitar fatores de interferência, que podem comprometer a eficácia da técnica.

 

O detalhamento das etapas utilizando como

exemplo o camundongo

Preparo de Machos Vasectomizados

Para descrever o processo de vasectomia, inicialmente devemos apresentar os materiais utilizados. Empregaremos o camundongo como modelo.

INSTRUMENTAL CIRÚRGICO – composto de tesoura de ponta romba, tesoura de ponta fina, pinças relojoeiro e de ponta romba, bisturi, tesouras porta-agulha, agulhas para sutura, linha de algodão para sutura, linha absorvível para sutura do peritônio, agulhas e seringas para anestesia; SUBSTÂNCIA ANESTÉSICA – pode variar de acordo com a espécie animal com a qual se está trabalhando. Para camundongos, utiliza-se preferencialmente o Avertin (2-2-2-tribromoetanol diluído em álcool amyl terciário); MATERIAL PARA CAUTERIZAÇÃODO DEFERENTE – composto por uma pinça relojoeiro e uma lamparina; MATERIAL PÓS-OPERATÓRIO – consiste de uma fonte de calor (podendo ser uma lâmpada incandescente) e de uma caixa individual, para o animal, com comida e água. A cama utilizada deverá ser de papel ou material similar para o

aumentar o conforto do animal e reduzir o estresse pós-cirúrgico.

Desse modo, munindo-se do material acima citado, pode-se partir para a cirurgia. Inicialmente, administra-se o anestésico no animal via intraperitonial, a fim de sedá-lo. Faz-se então uma incisão no abdômen, a aproximadamente 1 cm acima do pênis. Utilizando as pinças de ponta romba, resgata-se o ducto deferente e, com a pinça relojoeiro, previamente aquecida, procede-se com a cauterização. O testículo é então forçado a retornar à posição anatômica, fazendo-se uma pequena pressão com os dedos indicadores sobre o abdômen, de forma a permitir que o testículo retorne à bolsa escrotal. O mesmo procedimento é utilizado no outro deferente. Finalmente, sutura-se o peritônio e a pele, e o animal é transferido para uma gaiola próxima a uma fonte de calor. O camundongo é então acompanhado em seu pós-operatório pelo período mínimo de dois

dias (Fig. 7).

Figura 7 – Desenho esquemático da cauterização do deferente

 

Preparo da Fêmea Doadora A fêmea doadora de embriões geralmente é oriunda das colônias de fundação e por esta razão apresenta um custo elevado. A otimização de seu acasalamento é, portanto, bastante desejável. Para atingir um grau máximo de aproveitamento reprodutivo, são utilizados hormônios sexuais que induzem a fêmea a um ciclo exógeno.

Sob o efeito dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), um número bastante elevado de óvulos é produzido e liberado para estarem disponíveis à fecundação. Normalmente, a dose de 5 UI é suficiente para a produção de um elevado número de embriões. Entretanto, em virtude da constituição genética do camundongo (linhagem), certos ajustes se fazem necessários.

Essa etapa do processo (estimulação da fêmea via hormônios), também chamada superovulação, é apresentada na figura seguinte.

Figura 8 – Etapas do processo de superovulação

 

(*) No caso de ratos, a confirmação da cópula se dá pela procura de

espermatozóides em lavagem da vagina da fêmea com solução

PBS e observação em microscópio.

Coleta de Embriões Após o processo de superovulação, a fêmea é colocada na presença do macho para que a cópula se processe e os embriões possam ser coletados. Diferentes estágios de desenvolvimento embrionário podem ser utilizados. Porém, os mais utilizados, tanto para congelamento quanto para o implante, são os embriões de 2 a 8 células. Esses estágios são conhecidos como pré-implantação e estão ainda no interior do oviduto, migrando em direção ao útero

onde a gestação se desenvolveria (Figs. 9 e 10).

Figura 9 – Estágios de pré-implantação na embriogênese de

camundongo

Figura 10 – Estágios de desenvolvimento de embriões no oviduto

 

Para a coleta dos embriões presentes no interior do oviduto, são necessários os seguintes materiais:

INSTRUMENTAL CIRÚRGICO – tesouras ponta romba e ponta fina, pinças ponta romba e relojoeiro, seringa e agulhas especiais para a lavagem do oviduto a partir do infundíbulo com injeção de meio de cultura;

INSTRUMENTAL DE COLETA – capilares de manipulação, placas de Petri estéreis, meio de coleta.

A técnica de coleta (Fig. 11) acontece como se segue:

sacrifício da fêmea normalmente executado por deslocamento cervical, uma vez que esse método é rápido e indolor, além de não causar maiores danos aos embriões. Certas drogas, uma vez presentes na circulação, podem atravessar a barreira placentária e causar danos aos embriões, comprometendo a sua viabilidade;

abertura da pele e do peritônio para o resgate dos cornos uterinos, em cuja extremidade se encontra o oviduto;

retirada do oviduto com um tesoura de ponta fina; lavagem do oviduto com o meio de coleta.

Figura 11 – Diagrama esquemático das etapas de coleta

 

Terminado o processo acima descrito, os embriões coletados são avaliados quanto as suas características morfológicas e separados para um dos três procedimentos: transferência a fresco, congelamento e cultivo de embriões.

Transferência a Fresco

É a técnica recomendada para substituir a histerectomia tanto para a obtenção de animais axênicos quanto para a descontaminação de colônias comprometidas.

Em ambos os casos, os embriões coletados são transferidos para diferentes placas com meio de coleta. Essa transferência é seriada, constituindo-se de passagens sucessivas de uma placa a outra. A técnica permite que a superfície do embrião (zona pelúcida), seja ‘lavada’, retirando-se, por ‘arraste mecânico’, patógenos que estejam em sua superfície. Após a terceira passagem, e uma vez ‘limpos’, os mesmos são recolhidos e implantados em fêmeas receptoras isentas de patógenos.

Cultivo de Embriões

O cultivo é feito por meio da seleção de embriões e da sua posterior transferência para uma placa contendo meio apropriado. A placa com os embriões é colocada em uma estufa de CO com os 2 seguintes parâmetros de ambiente:

4% a 5% de CO 2

temperatura de 37 °C

umidade relativa de 90%

Os embriões serão observados por um período de 12 a 14 horas para que seu desenvolvimento possa ser acompanhado. Desse modo, pode-se obter a certificação das rotinas adotadas, da qualidade dos meios de cultura etc. Pode-se também fazer análises dos ajustes na técnica de acordo com as exigências das diferentes linhagens.

Um dos maiores indicadores da eficiência da rotina utilizada é a porcentagem de embriões que conseguem se desenvolver. Entretanto, para essa análise, devem ser utilizados embriões de 2 ou 4 células, preferencialmente oriundos de linhagens, cujos resultados anteriores sejam bem estabelecidos e sirvam como controle.

Congelamento de Embriões (Fig. 12)

Os embriões coletados são submetidos ao processo de congelamento para que possam ser estocados em botijões com nitrogênio líquido (contêineres), constituindo assim o banco de embriões. Como já foi discutido, os representantes das linhagens estarão com sua condição original preservada, ou seja, livres de patógenos, contaminações ou de deriva genética. Em condições normais de estocagem, o nitrogênio líquido do botijão atinge uma temperatura de –196 °C. Nessa temperatura, qualquer atividade metabólica do embrião ou de eventuais patógenos é cessada, fazendo com que o banco seja o local mais seguro para a proteção das linhagens.

Para que o congelamento de embriões seja bem-sucedido, é necessário que o meio utilizado os desidrate gradualmente, evitando que a água em seu interior se cristalize (devido as suas pontes de hidrogênio), o que poderia causar a ruptura da zona pelúcida e, conseqüentemente, sua morte. Assim sendo, no processo de congelamento, o embrião é colocado em um meio levemente hipertônico, o qual promoverá uma retirada parcial da água de seu interior em decorrência da diferença no potencial osmótico (a membrana é semipermeável) entre o meio intra e extracelular. A substância adicionada ao meio de cultura do embrião para que esse fenômeno ocorra é chamada de substância crioprotetora.

Diferentes substâncias crioprotetoras podem ser utilizadas, dependendo da espécie animal com que se está trabalhando. Para embriões bovinos, por exemplo, o crioprotetor ideal é o glicerol. Já para embriões humanos e de camundongos, o mais utilizado é o propileno glicol.

Há, basicamente, duas metodologias de congelamento. A primeira delas compreende o congelamento rápido com a colocação dos minitubos nos quais os embriões estão acondicionados em contato direto com o nitrogênio líquido. Esse processo é conhecido como ‘vitrificação’. Porém, apesar de apresentar bons resultados no caso de embriões bovinos, a vitrificação pode causar danos a embriões cujas características lhes conferem uma menor resistência (em murinos, por exemplo). Assim, pode-se utilizar uma segunda metodologia, conhecida como ‘congelamento gradual’, que proporcionará melhores resultados.

No congelamento gradual, também conhecido como por etapas, embriões cuja zona pelúcida é menos resistente terão tempo de perder temperatura sem que ocorra uma ruptura de sua cápsula. Na verdade, no processo gradual, ocorre a perda de água por parte do embrião juntamente com o decréscimo de sua temperatura. Uma vez coletados os embriões, o material necessário para o congelamento gradual é o seguinte:

MATERIAL DE MANIPULAÇÃO – consiste de capilares de manipulação de embriões (confeccionados por meio do alongamento de pipetas Pasteur previamente aquecidas, de modo a formar um capilar de vidro com diâmetro aproximado de 120 micrômetros), placas de Petri (plásticas descartáveis); MATERIAL DE ACONDICIONAMENTO – minitubos próprios para guardar os embriões, botijão com nitrogênio líquido, magazines para o armazenamento de minitubos no interior do botijão;

MATERIAL QUÍMICO – solução crioprotetora (de concentração conhecida) adequada à espécie utilizada; MATERIAL DE CONGELAMENTO – banho refrigerado com controle de temperatura. Os banhos devem ser programáveis e permitir um decréscimo controlado.

O processo de congelamento em etapas (Gráfico 1) inicia-se com a adição da solução crioprotetora ao meio e este ao minitubo. A partir daí, os embriões são retirados da placa contendo meio de cultura e, com o auxílio de um capilar, colocados no interior do minitubo. Este, então, é levado ao banho refrigerado que executará a diminuição gradual da temperatura. Logo, o minitubo estará congelado e poderá então ser colocado no reser vatório de nitrogênio líquido, onde poderá ser mantido por tempo indeterminado, desde que o nível de nitrogênio seja periodicamente acompanhado e completado quando necessário.

Gráfico 1 – Temperatura em razão do tempo no congelamento

gradual

 

Figura 12 – Esquema da rotina de congelamento de embriões

realizada em criopreservação para a formação do banco de

embriões

 

Descongelamento de Embriões O processo de descongelamento deve ser realizado com cuidados, para não danificar os embriões. O crioprotetor deve ser retirado para que o embrião seja hidratado novamente. Porém, essa reidratação deve acontecer também de uma forma gradual, com o intuito de se evitar que o embrião absorva água em excesso e se rompa.

Para tanto, retira-se o minitubo do reservatório de nitrogênio líquido, esperando até seu descongelamento total (pode-se utilizar uma simples fricção manual para acelerar o processo). Coloca-se o conteúdo do minitubo em uma placa estéril. Finalmente, inicia-se a diluição do crioprotetor em meio de cultura para a restauração do

potencial osmótico original do embrião (Fig. 13).

Executado o descongelamento, os embriões poderão ser cultivados ou diretamente implantados em fêmeas receptoras programadas, como será descrito a seguir.

Figura 13 – Procedimento para descongelamento de embriões

 

Implante de Embriões

Uma das possibilidades de utilização dos embriões descongelados é o implante. Por meio dele, uma fêmea receptora pseudoprenhe recebe embriões de uma doadora.

A pseudoprenhez é alcançada com a colocação da fêmea receptora para que acasale com um macho vasectomizado, conforme já descrito acima. Esse procedimento promove alterações fisiológicas que aumentam o sucesso da técnica.

O implante é um processo cirúrgico bastante delicado e exige os seguintes materiais:

material cirúrgico – pinças relojoeiro e de ponta romba, tesouras de pontas romba e fina, tesoura porta-agulha, agulha para sutura, linha de algodão para sutura da pele, bisturi, agulha e seringa para administração de anestésico, gaze e filtros de papel;

substância anestésica – preferencialmente deve-se utilizar para camundongos o 2-2-2-tribromoetanol (Avertim) diluído em álcool isoamil terciário, injetado intraperitonialmente; material para manipulação e implante de embriões – placas de Petri plásticas estéreis e descartáveis, capilar de implante (que deve ser mais curto e delgado do que o utilizado para a manipulação);

material pós-operatório – fonte de calor (lâmpada incandescente) para o pós-operatório. Acompanhamento da prenhez.

Para a execução do implante (Fig. 14), anestesia-se a fêmea e, então, se faz uma pequena incisão dorsal na altura correspondente aos rins. Utilizando a pinça de ponta romba, após a abertura do peritônio, resgata-se o oviduto, puxando-o pela gordura adjacente. Com as pinças relojoeiro, rompe-se cuidadosamente a bolsa ovariana, expondo o ovário e o infundíbulo. Introduz-se o capilar de implante no início do oviduto (infundíbulo), e se injeta os embriões. Após a devolução da estrutura a sua posição anatômica inicial, a pele deve então ser suturada. O animal é mantido sob observação em separado de outros para a detecção da prenhez.

A técnica do implante precisa é o passo final para o repovoamento de uma colônia de animais que tenha sido exterminada ou contaminada por um patógeno qualquer. Assim, os embriões a serem implantados devem, antes, passar por um processo de análise e seleção, de modo a diminuir insucessos.

Além disso, deve-se observar se o embrião a ser implantado apresenta características condizentes com seu estágio de desenvolvimento. A aparência da zona pelúcida, a posição e o tamanho dos blastômeros e a presença ou não de atividade celular são excelentes indicadores de qualidade embrionária.

Figura 14 – O procedimento de implante de embriões em

camundongos

 

Principais fatores limitantes da criopreservação

Por se tratar de um processo que exige precisão e delicadeza, a criopreservação de embriões está sujeita a fatores de interferência. Os mais importantes são:

qualidade dos meios utilizados – deve-se ter um forte controle sobre os meios de cultura e coleta. Assim, a qualidade dos reagentes utilizados é determinante para o sucesso de qualquer técnica que envolva a manipulação direta de embriões. É necessário também um conhecimento das características químicas e biológicas dos meios (pH, osmolaridade, temperatura de acondicionamento etc.);

estocagem – os meios devem ser preferencialmente recém-preparados. Nos casos em que isso não é possível, os mesmos deverão ser conservados em freezer e em frascos estéreis. Entretanto, sempre se deve considerar a sua ‘idade’ como um fator de interferência;

adequação do meio – o meio de cultura deve ser adequado a espécie de embriões a serem cultivados, bem como ao seu estágio de desenvolvimento. Quando não há conhecimento prévio da eficácia do meio, recomenda-se a execução de ensaios e testes;

idade das fêmeas – fêmeas doadoras e receptoras podem ser utilizadas em diferentes idades, dependendo da linhagem ou espécie. Deve-se, porém, ter um conhecimento da fisiologia do animal com que se está trabalhando para adequar a idade à sua utilização;

condições de superovulação – fatores como peso e estresse devem ser considerados no momento da superovulação. A superovulação é uma etapa muito crítica para o sucesso da técnica. Sua resposta é diferente entre espécies e muitas vezes dentro da mesma espécie. Como exemplo destacamos a variação no número de embriões, observada entre camundongos isogênicos, porém de linhagens diferentes; escolha do crioprotetor – como já foi dito anteriormente, diferentes espécies respondem de maneiras particulares à ação de um determinado crioprotetor. Cuidados devem ser tomados e protocolos já existentes devem ser consultados; metodologia – tanto no congelamento quanto no descongelamento, a metodologia aplicada é fundamental para a determinação da viabilidade embrionária. Alguns embriões respondem melhor a certas técnicas de congelamento que

outros. Assim sendo, deve-se pesquisar em bibliografias adequadas qual é a melhor metodologia a ser aplicada à espécie que se deseja criopreservar;

via de implantação – o embrião tem um caminho natural no interior do trato reprodutivo da fêmea. Assim, o local onde o mesmo será implantado dependerá de seu estágio de desenvolvimento. As duas possibilidades são: implante no oviduto ou diretamente no útero;

fêmeas receptoras – algumas linhagens respondem melhor ao implante de embriões do que outras. Logo, a seleção das linhagens mais propícias a receber embriões é desejável. Via de regra, a utilização de fêmeas híbridas reduz a interferência do background genético, aumentando sensivelmente o número de sucessos.

 

A manipulação de embriões e o futuro

O futuro da manipulação de embriões é bastante promissor, em todos os aspectos. Por se tratar de um ramo da ciência em pleno desenvolvimento, novas tecnologias vão surgindo a cada dia, e com elas surgem também novas perguntas que exigem respostas.

Atualmente, a manipulação de embriões está amplamente difundida em diversos ramos da economia, como a pecuária, a indústria farmacêutica e nas clínicas de reprodução humana. Com o advento de novas descobertas e tecnologias, a tendência de uma maior propagação e utilização dos processos de criopreservação e de manipulação embrionária é inegável. Ainda assim, há muito o que ser descoberto na área.

A utilização de embriões para a criação de modelos experimentais transgênicos ganha força a cada dia, sendo que o mesmo pode-se dizer no que tange aos processos de clonagem, fertilização etc. Deste modo, o futuro reserva muitos avanços aos bioteristas que escolhem esta área. Porém, deve-se possuir a ética e o discernimento necessários a fim de julgar o impacto das descobertas vindouras para a humanidade.

A ciência é a ferramenta maior de avanços para o ser humano. É a maior geradora de conhecimento de nossa civilização. Porém, esta mesma ciência que salva também pode ser usada para destruir. Será que todos aqueles que estudaram as propriedades do átomo imaginavam que um dia esse conhecimento seria utilizado para a destruição em massa de seres humanos? Daí a necessidade de um julgamento lúcido e ético acerca das necessidades de nosso mundo.

A manipulação de embriões pode ser utilizada um dia para salvar espécies ameaçadas de extinção, para a multiplicação de rebanhos a fim de suprir o crescente aumento populacional e até mesmo para curar doenças. Porém, é necessário ética. Caso contrário, podemos correr o risco de novamente a ciência criar algo do qual posteriormente se arrependerá.

 

Bibliografia

DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Técnicos em Bioterismo. 2ed. São Paulo: Winner Graph, 1996.

GREEN, M. Genetic Variants and Strains of The Laboratory Mouse. Stuttgart/New York: Ed. Gustav Fischer Verlag, 1979.

HAFEZ E. S. E. Reprodução Animal. Michigan: Manole Ltda., 1982. v. I e II.

HEDRICH, H. J. & Reetz, I. C. Cryopreservation of rat embryos. In: Genetic Monitoring of Inbred Strains of Rats. Stuttgart/New York: Ed. Gustav Fischer Verlag, 1990.

HOGAN, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo – a laboratory manual nd . 2 ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

KAWASE, Y. et al. Application of the piezo-micromanipulator for injection of embryo stem cells into mouse blastocysts. Contemporary Topics, 40(2), 2001.

NAKAGATA, N. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Experimental Animal, 44(1):1-8, 1995.

REETZ, C. et al. Rederivation of inbed strains of mice by means of embryo transfer. Laboratory Animal Science, 38(6):696-701, 1988.

SILVER, L. M. Mouse Genetics — concepts and applications. New York: Oxford University Press, 1995.

SZTEIN, J. M. et al. Mouse sperm cryopreservation protocol. Cryobiology, 35:46-52, 1997.

UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals th . 6 ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.

WOO, M. PraticalNotes on Oocytes Embryo—recovery culture, transfer, fertilization in vitro and storage. MRC Experimental Embriology and Teratology Unit, St. George's Hospital Medical School, London, England, s.d.