04. Diagnóstico da COVID-19

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Diagnóstico da COVID-19

 

Marta Guimarães Cavalcanti

 

► INTRODUÇÃO

 

O SARS-CoV-2, agente etiológico da COVID-19, é um novo vírus da

família Coronaviridae que trouxe mudanças importantes no modo de

vida das populações humanas em todo o planeta. A COVID-19 teve

início na China continental, apresentando casos entre novembro e

dezembro de 2019, e foi declarada como pandemia pela Organização

Mundial da Saúde (OMS) em março de 2020. O rápido acometimento de

população não imune e a progressão para casos graves em grupos

afetados por outras comorbidades mostraram a necessidade do

diagnóstico acurado da infecção de modo a melhorar a tomada de

decisões tanto no âmbito individual quanto no comunitário.

A infecção pelo SARS-CoV-2 caracteriza-se por amplo espectro de

manifestações, incluindo quadros atípicos ou alterações pouco

específicas. Febre, tosse com ou sem alterações respiratórias, como

dispneia, e ausência ou presença de intensa fadiga são manifestações

frequentes. Podem estar também presentes congestão nasal, anosmia, dor

de garganta, mal-estar, mialgia e diarreia, associados ou não à síndrome

respiratória1,2. Desfechos como hospitalização, internação em unidade de

terapia intensiva (UTI) e morte associam-se a alguns fatores de risco, por

exemplo idade e comorbidades. Mas, a despeito da variabilidade do

quadro clínico, a infecção é predominantemente assintomática ou

oligossintomática na maior parte dos afetados não imunes ao SARS-

CoV-2. Em razão das apresentações clínicas tão distintas e dos sintomas

inespecíficos, o diagnóstico da COVID-19 é essencialmente

laboratorial1.

O método da reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa

(reverse transcriptase-polymerase chain reaction – RT-PCR) é

considerado o padrão-ouro no diagnóstico da infecção pelo SARS-CoV-

23. No momento, os testes para detecção de RNA viral são os

recomendados tanto para a confirmação da infecção pelo SARS-CoV-2,

em casos suspeitos na população geral e em trabalhadores da área de

saúde, como também para monitoramento e suspensão de medidas de

isolamento individual.

Recentemente introduzidos, os testes para diagnóstico imunológico

incluem métodos imunoenzimáticos, quimioluminescência e

imunocromatografia de fluxo lateral, os quais permitem a determinação

de exposição prévia, sendo então cogitados como ferramentas auxiliares

para controle de cura e vigilância epidemiológica.

 

► DESCRIÇÃO DA ESTRUTURA E DO GENOMA VIRAL

 

O SARS-CoV-2 possui estrutura viral composta de envelope externo, o

core (com RNA genômico), nucleoproteína e nucleocapsídeo (Figura 1).

No seu envelope externo, ancoram-se as seguintes proteínas: Spike (SP),

que promove a ligação com o receptor da célula hospedeira; Envelope

(EP), que é facilitadora da montagem da partícula viral e de sua

liberação da célula hospedeira; Membrana (MP), que faz parte da

estrutura da partícula viral. A Hemaglutinina esterase (HE) está presente

em algumas cepas de betacoronavirus e pode contribuir com a proteína S

durante a entrada na célula hospedeira. No nucleocapsídeo, a proteína N

permite a organização do genoma viral (RNA) (Figura 1A).

O genoma viral do SARS-CoV-2 é composto por RNA de fita simples

de aproximadamente 29 mil pares de bases. Tem de 6 a 11 ORP (open

reading frames). Cerda de dezesseis proteínas não estruturais (nsps) são

codificadas a partir da região genômica ORF 1, enquanto as demais

proteínas estruturais são expressas no restante das ORF (Figura 1B). Os

genes Rep 1a e 1b estão relacionados à replicação viral, enquanto as

regiões S, E, M e N codificam proteínas estruturais3.

 

Eliminação de RNA em compartimentos biológicos detectada por

RT-PCR em tempo real e resposta imune dependente de anticorpos por testes comerciais durante a evolução da COVID-

19

 

A detecção de partículas virais obtidas de secreção respiratória alta

(swab nasal) ocorre a partir do terceiro dia de doença, tendo o pico de

eliminação de 4 a 6 dias após início de sintomas e se estendendo por

mais de 3 semanas (de 8 a 37 dias)4,5. Entretanto, a eliminação de RNA

viral em vias respiratórias baixas (amostras de escarro) pode ser

detectável de 21 a 39 dias e, em amostras de fezes, por mais de 4

semanas (Figura 2)6,7. A janela de detecção de ácidos nucleicos estende-

se por um período médio de 12 a 19 dias após início de sintomas nas vias

respiratórias e de até 18 dias nas fezes8. A persistente eliminação de

RNA viral foi observada em pacientes que evoluíram para doença grave,

embora indivíduos assintomáticos ou com doença leve também possam

apresentar partículas virais detectáveis por longo tempo. Entretanto,

embora seja possível detectar a amplificação viral além de 3 semanas

após o início de sintomas, dados recentes mostram que a eliminação viral

persistente não se correlaciona com atividade replicativa, visto que

partículas virais ativas não são recuperáveis por isolamento após o oitavo

dia após início de sintomas9.

▷Figura 1 Estrutura viral. A) Capsídeo viral: projeções externas ao capsídeo proteico

(proteína Spike), dímero da hemaglutinina esterase (HE), proteína membrana (MP),

proteína de envelope (EP). Proteína do nucleocapsídeo (NP) e RNA estão

representados; B) regiões do genoma viral: Rep 1a e 1b, replicação; S, estrutural, E,

envelope; M, membrana; N, gene do nucleocapsídeo; Prom e ORF 1, 2 -6, regiões

promotora e open reading frame, respectivamente.

 

Em relação à resposta imune dependente de anticorpo, a IgM de fase

aguda pode surgir entre o 5° e o 7° dias do início de doença, porém esse

surgimento pode ser mais tardio (entre 10 e 30 dias, com pico no 28° dia

após início de sintomas). Por outro lado, a detecção de IgG pode ocorrer

entre 10 e 20 dia após início de sintomas3,8,10. A duração da resposta por

IgM e IgG ainda não está seguramente estabelecida em parte pela baixa

acurácia dos testes disponíveis.

▷Figura 2 Eliminação de partículas virais e resposta dependente de anticorpo na

infecção pelo SARS-CoV-2. Representação da duração provável da eliminação de

partículas virais (ensaio de detecção de ácidos nucleicos) em vias aéreas no período

pré-sintomático (pródromos) e após o início de sintomas. Seta delimita período de

eliminação de RNA viral e a sua consequente detecção por ensaios moleculares. A

resposta dependente de anticorpos está demonstrada por ensaio imunoenzimático.

Linha pontilhada corresponde ao limiar de detecção do teste molecular (RT-PCR em

tempo real).

* Janela de detecção de antígeno viral presumida.

 

► FERRAMENTAS DIAGNÓSTICAS ATUALMENTE EM USO

 

Testes baseados na detecção de ácidos nucleicos

 

Dos ensaios para detecção de RNA viral, o método da RT-PCR em

tempo-real tem sido o mais universalmente utilizado. A reatividade no

teste resulta da amplificação de algumas regiões genômicas com

sequências conservadas. Os testes ainda não são comerciais (in house),

por isso os laboratórios devem validar seus ensaios.

Atualmente, existem seis diferentes protocolos, sendo o desenvolvido

pela Charité Virology (Berlim, Alemanha) o adotado pela OMS como

referência, embora outros estejam disponíveis e podem ser usados, como o desenvolvido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC –

Atlanta, Estados Unidos)3.

Os alvos gênicos escolhidos no protocolo Charité são os genes E e

RdRP2, usados para triagem e confirmação diagnóstica, respectivamente.

Nos demais protocolos, outros alvos foram utilizados (Quadro 1)3. Este

último pode ser substituído pelo gene N2, por exemplo, para aumentar a

sensibilidade do teste11. A RT-PCR pode alcançar 100% de

especificidade e não tem reatividade cruzada com as demais espécies de

coronavírus, como HCoV-229E12. Entretanto, a sensibilidade desse

ensaio varia conforme a região-alvo amplificada, o tempo de infecção e

o espécime clínico testado, sendo 32% a 95% (Quadro 1)13-15. Além do

ensaio convencional, já existem plataformas do tipo point-of-care a

serem disponibilizadas.

 

Diagnóstico imunológico

 

O diagnóstico imunológico abrange a detecção de antígenos virais e

anticorpos das classes IgA, IgM e IgG (Quadro 1). Nesse momento,

estão disponíveis comercialmente os testes rápidos (imunocromatografia

de fluxo lateral nas plataformas de point-of-care) ou testes convencionais

do tipo ELISA (ensaio imunoenzimático). Entretanto, o maior entrave é

a baixa acurácia dos testes atualmente disponíveis, consequentemente, a

necessidade de validação deles16. A detecção de IgM e IgG pode ser

realizada por meio de testes imunocromatográficos de fluxo lateral (teste

rápido), ensaios ELISA convencional, quimioluminescência e outros17. A

dosagem de IgA também é possível de ser realizada por meio de ELISA.

A detecção de antígeno viral em plataforma do tipo point-of-care está

sendo validada em diferentes laboratórios, sendo sua sensibilidade pouco

inferior a do RT-PCR. No momento, a OMS ainda não indica o uso fora

de protocolos de pesquisa, embora incentive os estudos que se

proponham a determinar sua acurácia18.

 

► INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

 

Com base nos aspectos descritos, a escolha do teste diagnóstico

depende da sua confiabilidade. A performance dos testes, como os

ensaios para detecção de ácidos nucleicos, pode ser mudada, por exemplo, conforme o dia de doença em que a amostra foi coletada, o

espécime clínico usado, a técnica de coleta, do processamento da

amostra e outros. O aparecimento tardio e a curta duração de

imunoglobulinas de fase inicial aguda prejudicam o diagnóstico em

indivíduos sintomáticos com ausência de RNA viral detectável, por

exemplo. No Quadro 2, estão listadas as interpretações possíveis dos

testes atualmente disponíveis para o diagnóstico laboratorial da COVID-

19.

 

▷Quadro 1 Características dos testes diagnósticos da COVID-19

Ensaio para detecção de RNA viral (real time Imunodiagnóstico RT-PCR) (IgA, IgM, IgG)

Sensibilidade 32-95% IgA (S): 92,7%

(S) IgM (S): 85,4-87%

IgG (S):67-78%

Especificidade ≅ 100% IgA/IgM (E): 85.4-87%

(E) IgG (E):67-78%

Início de A partir 3° dia IgA/IgM: 5-7°dia

detecção IgG: 10-18°dia

(dia após

início de

sintomas)

Duração Via respiratórias altas: até 3 semanas IgA/IgM: ≅ 3 semanas (?)

detecção Baixas: > 5 semanas IgG: anos (?)

Fezes: > 4 semanas

Alvos de E, RdRP2, N1-3; ORF1 ab NP, E, ME, SP

detecção

Espécimes Swab nasofaringe, orofaringe Soro, sangue total, plasma

biológicos Escarro, lavado broncoalveolar

Fezes

Reatividade Ausência Vacinação prévia para influenza; DENV em

cruzada áreas endêmicas. Reatividade com outros

coronavírus humanos

Indicação do Diagnóstico de infecção ativa em indivíduos Vigilância epidemiológica

uso sintomáticos

Vantagens Teste confiável pp na janela de positividade. TR poderiam ser chave para tomada de

Sensibilidade aumentada com a utilização de decisão à beira do leito. Facilidade no mais de uma sequência -alvo do SARS-CoV- manuseio, análise e não requer treino 2. Plataforma de point-of-care em especializado desenvolvimento Ensaios ELISA convencionais são aplicáveis a

estudos populacionais Recuperação dos dados

de incidência em grupos de indivíduos

infectados/doentes, mas sem diagnóstico

confirmatório pelo ensaio detecção ácidos

nucleicos. Custo, em geral, é baixo

Limitações Acurácia do teste depende de variáveis como TR em geral tem a especificidade reduzida.

adequada coleta e armazenamento da Resultados limítrofes (indeterminados) podem

amostra, dia da infecção (janela de ter interpretação difícil. Atuais TR no mercado

positividade), validação interna. Não ainda têm baixa performance. Teste

amplificação pode não excluir infecção. convencional (ELISA) vem apresentando Ainda depende de profissionais qualificados acurácia mais baixa. Reatividade muito tardia

para realização. No momento, ausência de de resposta de fase aguda (IgM-dependente)

ensaios comerciais. Preço/teste pode limitar prejudica diagnóstico precoce em indivíduos

o uso para investigação de grandes cujas amostras não tinham amplificação viral

populações

 

▷Quadro 2 Interpretação (possível) dos resultados de testes diagnósticos

Dias após início de Testes diagnósticos Análise

sintomas

RT- IgA/IgM IgG

PCR

< 3 dias Reativo NR; NR; Indivíduo infectado assintomático ou período inicial de

NT* NT* sintomas

< 3 dias NR NR; NR; RT-PCR pode ser falso-negativo em fases iniciais

NT* NT*

> 4-10 dias Reativo Pos Neg Paciente em fase ativa (precoce) de infecção

> 10 dias Reativo Pos Pos Infecção recente

> 10 dias NR Pos Pos Indivíduo apresentou infecção/doença prévia;

convalescência; RT-PCR falso-negativo

> 21 dias Reativo Neg Pos Fase tardia de infecção

> 21 dias Reativo - - Detecção infecção persistente com eliminação de RNA nas

fezes

Após semanas Reativo - - Reativação? Reinfecção?

do final de sintomas

NR: não reagente; NT: não testado; * não indicado em vista da limitação do teste. Vide texto. Pos: positivo;

Neg: negativo.

 

► EMPREGO DOS TESTES DIAGNÓSTICOS PARA MANEJO DA COVID-19

 

O uso de ensaios moleculares e imunológicos ainda é objeto de

discussão quando se trata tanto do manejo individual quanto do

comunitário (Figura 3). A proposta para o uso de testes depende, em

última análise, da melhora da confiabilidade dos próprios testes e de sua

validação.

▷Figura 3 Fluxograma representando o uso dos testes diagnósticos da COVID-19.

 

RT-PCR rt: reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa em tempo real.

 

► REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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