1 Relações Hídricas

a transpiração intimamente ligada à anatomia da folha (Figura 1.20). A multicamada de ceras conhecida como cutícula, que cobre a epiderme das folhas, funciona como uma barreira bastante efetiva à saída de água, tanto líquida quanto na forma de vapor, protegendo as células de uma eventual dessecação letal. Essa proteção é variável entre as espécies dependendo da

espessura da cutícula (Figura 1.21 B). No entanto, a continuidade da epiderme imposta pela cutícula é interrompida por pequenos poros que fazem parte do complexo estomático. Cada poro é circundado por duas células especializadas, as células-guardas, que funcionam como válvulas, operadas pela turgescência, que controlam o tamanho da abertura do poro

(Figura 1.21).

O interior da folha é composto por células do mesofilo fotossintético apresentando um sistema interconectado de espaços intercelulares, que pode atingir até 70% do volume das folhas, em alguns casos ocupados por superfícies úmidas, de onde a água evapora, e por ar. Geralmente, os estômatos são mais abundantes na superfície inferior das folhas, localizando-se de modo que, quando abertos, a rota para as trocas gasosas (principalmente dióxido de carbono, oxigênio e vapor de água) entre os espaços internos das folhas e a atmosfera circundante seja facilitada. Por causa dessa relação, esse espaço é referido como espaço subestomático.

Na transpiração estão envolvidas a evaporação de água das paredes úmidas das células para o ar circundante dos espaços intercelulares e a passagem dos espaços subestomáticos para a atmosfera externa da folha. Acredita-se que grande parte da água evapore da superfície interna das células do mesofilo que rodeiam os espaços de ar subestomáticos.

O caminho pelo qual o vapor de água escapa após a evaporação (espaço subestomático) é relativamente simples. Ele se difunde por meio dos espaços intercelulares e para fora, pelos estômatos. Essa difusão é conhecida como transpiração estomática, responsável por 90 a 95% da água perdida pelas folhas, ou seja, existe uma alta correlação entre a condutância estomática e a transpiração. Para Dalbergia miscolobium, observou-se um coeficiente de correlação de 0,91 entre esses dois parâmetros (Sassaki et al., 1997). A difusão de vapor de água pode ocorrer também pelas células da epiderme e da cutícula (transpiração cuticular), um caminho com resistência alta e variável entre as espécies, dependendo da espessura da cutícula. Além disso, em ambientes muito úmidos, a cutícula pode sofrer rearranjos e se tornar mais permeável, como mencionado anteriormente. É necessário destacar a importância da difusão como processo que controla a transpiração, visto que o movimento é dirigido pelo gradiente de concentração de vapor de água ou gradiente de pressão de vapor entre as superfícies onde a água está evaporando e a atmosfera.

 

Força que dirige a transpiração

A difusão é muito mais rápida em um gás que em um líquido, o que torna esse processo adequado para mover vapor de água pela fase gasosa da folha. Embora tenha sido estabelecido que o movimento de água no sistema solo–planta–atmosfera é determinado por um gradiente de potencial de água, para a transpiração, em que ocorre difusão na forma de vapor, é melhor pensar em gradiente de concentração de vapor de água (ΔCva) ou gradiente de pressão de vapor (Δe), que são equivalentes. A pressão de vapor da água (e) é medida em quilopascal (KPa) e é proporcional à concentração de vapor de água (Cva), que pode ser expressa em mol m–3.

Figura 1.20 Representação do limbo foliar em seção transversal. Notar a cutícula cobrindo as superfícies externas, as resistências à saída da água (resistência estomática e da camada de ar limítrofe) e o extenso espaço intercelular com acesso ao ar do ambiente pelos estômatos. Observar também as conexões plasmodesmáticas entre as células da epiderme e as células dos parênquimas (aquelas dispostas entre as partes superior e inferior da epiderme) e a ausência de cloroplastos nas células da epiderme.

 

Figura 1.21 Vista frontal da epiderme da face inferior de folhas de Heliocarpus americanus (A) e Hevea brasiliensis (B). ce: célula da epiderme; c: cutícula; cs: célula subsidiária; cg: célula-guarda; pe: poro estomático. Imagens cedidas por C. M. Pisicchio e M. E. Medri.

 

A pressão de vapor da água é aquela exercida pelas moléculas de água na forma de vapor contra a superfície do fluido que está evaporando e sobre a parede da câmara onde a evaporação está ocorrendo. O vapor de água difundirá de uma região de maior pressão de vapor ou de maior concentração para outra de menor.

A transpiração nas folhas dependerá do gradiente de pressão de vapor ou de concentração de vapor de água entre os espaços de ar da folha e o ar externo, bem como das resistências (r) à difusão durante o percurso. Esse conceito de transpiração é análogo ao fluxo de elétrons em um circuito elétrico, ou seja, análogo à lei de Ohm, em que as resistências estão

associadas a cada parte do caminho (ver Figura 1.20).

Já na evaporação, o escape do vapor de água é controlado simplesmente por uma resistência chamada de resistência da camada de ar adjacente ou camada de ar limítrofe à superfície evaporante (ra); no caso da transpiração, somam-se a esta as resistências da própria folha (rf). Entre as rf, a principal é a resistência dos poros estomáticos (rs), que é variável, uma vez que o estômato pode estar totalmente aberto, parcialmente aberto ou fechado. Assim, transpiração (T) expressa em mol m–2 s–1 pode ser relacionada com as resistências (r) expressas em s m–1 pela seguinte equação, considerando nesse caso o ΔCva expresso em mol m–3:

 

Em que Cva(folha) é a concentração de vapor de água dentro da folha e Cva a concentração de vapor de água no ar fora da folha. (ar)

Em princípio, supõe-se que, na transpiração, o espaço de ar subestomático da folha seja normalmente saturado ou muito próximo da saturação de vapor de água. Isso porque as células do mesofilo que circundam os espaços de ar apresentam uma grande área de superfície de exposição para a evaporação da água. Contudo, a atmosfera que circunda a folha dificilmente está saturada de água; ao contrário, frequentemente tem um conteúdo de água muito baixo. Logo, essa diferença na concentração de vapor de água entre os espaços de ar internos da folha e o ar que a circunda é a força que dirige a transpiração.

Tanto a pressão de vapor de água quanto a concentração de vapor são fortemente dependentes da umidade relativa (UR) e da temperatura. A umidade relativa pode ser definida como a concentração de vapor de água (Cva) expressa como uma fração da concentração máxima de vapor de água (saturação, Cva(sat)). A porcentagem, comumente usada para expressar a umidade relativa, quando atinge 50%, por definição tem a metade da concentração de vapor de água que teria se estivesse saturada de vapor.

A umidade relativa pode ser definida também como a razão entre a quantidade máxima de vapor de água que pode ser retido pelo ar a uma dada temperatura. Segundo essa definição, a umidade relativa é influenciada pela temperatura, e, em consequência, a pressão de vapor e a concentração de vapor da água também. Isso porque a capacidade de retenção de água aumenta bastante com a temperatura – por exemplo, a 10°C a concentração de vapor de água em ar saturado é 0,522 mol m–1, a 20°C é 0,961 mol m–1 e a 30°C é 1,28 mol m–1. A umidade e a temperatura podem, então, modificar a magnitude do gradiente de concentração de vapor de água entre a folha e a atmosfera, influenciando a taxa de transpiração.

Além da umidade relativa e da temperatura, um terceiro fator importante que interfere na taxa de transpiração é o vento, que está diretamente relacionado com a resistência da camada de ar limítrofe (ra). Essa resistência ocorre em razão da camada irrestrita de ar úmido adjacente à superfície da folha, que, com o aumento de sua espessura, modifica a extensão efetiva do caminho da difusão do vapor de água para a atmosfera. A maior extensão do caminho da difusão diminuirá a taxa de difusão e, nesse caso, a transpiração.

A espessura da camada de ar limítrofe é determinada primariamente pela velocidade do vento. Quando o ar que circunda a folha está parado, a espessura da camada de ar limítrofe pode aumentar, elevando a resistência e diminuindo a transpiração. Nessa condição, mesmo se os estômatos estiverem com boa abertura, a transpiração será prejudicada. Com o aumento da velocidade do vento, a espessa camada é retirada, favorecendo assim a transpiração, em virtude do decréscimo da resistência, ou seja, do caminho a ser percorrido na difusão.

 

Por que a transpiração?

Argumenta-se que a transpiração é benéfica às plantas porque causa o resfriamento das folhas, a ascensão da seiva e o aumento na absorção de nutrientes. Embora o resfriamento seja benéfico, folhas sob sol pleno raramente são lesadas por temperatura elevada quando a transpiração é reduzida, situação que pode ocorrer por murchamento temporário, provocando o fechamento dos estômatos.

A transpiração aumenta a velocidade do movimento da seiva no xilema, mas experimentos têm mostrado que é improvável que isso seja essencial. A transpiração meramente aumenta a velocidade e a quantidade de água em movimento até o alto de uma planta, mas não existem evidências de que essa maior taxa seja benéfica.

Absorção e translocação de nutrientes são provavelmente aumentadas por taxa de transpiração elevada; todavia, muitas plantas se desenvolvem bem na sombra e em habitats úmidos, onde a transpiração é baixa. Além disso, em experimentos utilizando-se elementos marcados com radioatividade, tem-se mostrado que os nutrientes continuam circulando na planta, mesmo na ausência da transpiração.

Somando-se a impossibilidade de entender claramente os benefícios da transpiração, com frequência esse processo resulta em estresse de água e lesões por dessecação. Isso ocorre especialmente sob condições de elevada temperatura e baixa umidade do ar e do solo. Aparentemente, a evolução da estrutura das folhas parece ter favorecido o processamento interno da fotossíntese, possibilitando a entrada e a difusão rápida de dióxido de carbono pelos estômatos abertos, em detrimento de uma diminuição da taxa transpiratória. Exceção deve ser lembrada para plantas de habitat muito seco. Assim, a alta taxa de transpiração é o resultado inevitável da evolução dos estômatos e, consequentemente, das folhas, para absorção de dióxido de carbono para a fotossíntese. Os estômatos permitem que dióxido de carbono da atmosfera se difunda para dentro dos espaços intercelulares dos tecidos fotossintéticos, onde se dissolve na fase aquosa, possibilitando que ocorra a redução fotossintética.

Nesse sentido, as plantas terrestres estão adaptadas a absorver o máximo possível de dióxido de carbono da atmosfera e limitar também ao máximo a perda de água. Não há como as plantas excluírem a perda de água sem, simultaneamente, dificultarem a entrada de dióxido de carbono na folha. A solução desse dilema para as plantas é a regulação temporal da abertura estomática, fechando-a à noite quando não fotossintetizam, evitando perda desnecessária de água. Pela manhã, desde que não haja limitações de água para a planta, é vantajoso para ela abrir os estômatos e permitir a entrada de dióxido de carbono, mesmo que isso envolva perda de água por transpiração estomática.

Em situação de estresse hídrico moderado, a abertura estomática será a máxima possível, sem que haja uma desidratação letal da planta, mas ainda capaz de fixar dióxido de carbono. Se o estresse persistir, a planta manterá os estômatos fechados. Com o fechamento estomático, as plantas podem manter certo turgor (maior potencial de água), o que é uma importante característica de tolerância à seca. Isso foi observado em estudos com Vigna unguiculata (feijão-caupi), espécie cultivada em regiões secas do Brasil (Pimentel e Hébert, 1999).

A capacidade da planta de limitar a perda de água e, ao mesmo tempo, permitir suficiente absorção de dióxido de carbono pode ser expressa pela eficiência no uso da água. Esse parâmetro é definido como a quantidade de dióxido de carbono (CO2) assimilado pela fotossíntese, dividido pela quantidade de água transpirada pela planta (mols de CO fixado/mols de 2 água transpirada).

Considerando os três tipos de plantas quanto ao metabolismo

fotossintético (ver Capítulo 5), as plantas C3 têm uma eficiência no uso da água em torno de 0,002, as C de 0,004 e as plantas MAC (também 4 denominadas de CAM, crassulacean acid metabolism) de 0,02. Neste último grupo, encontram-se as plantas mais adaptadas à condição de seca, fixando CO2 predominantemente à noite.

 

Fisiologia dos estômatos

Na equação 1.12, o numerador (Cva – Cva ) e a resistência da camada (folha) (ar) de ar limítrofe (ra) são parâmetros controlados fisicamente, sem nenhum envolvimento biológico, enquanto a resistência da folha (rf), decorrente principalmente do movimento de abertura e fechamento dos poros estomáticos, é controlada biologicamente. A rf regula a saída de água e a entrada de CO 2 para a fotossíntese, dependendo da resposta do movimento estomático a diferentes fatores bióticos e abióticos. Logo, a taxa fotossintética e, como consequência, o crescimento e desenvolvimento vegetativo e reprodutivo das plantas são dependentes dos movimentos de abertura e fechamento dos estômatos. É importante, então, um conhecimento mais detalhado das características dos estômatos e dos mecanismos de controle da abertura e fechamento a partir dos movimentos das células-guardas.

Caracterização geral dos estômatos

Os estômatos são encontrados em angiospermas, gimnospermas, pteridófitas e briófitas. Nas angiospermas e gimnospermas, podem ser observados em caules verdes, flores e frutos. A maioria dos estômatos encontra-se nas folhas, com alta funcionalidade. A frequência e a distribuição dos estômatos dependem principalmente da espécie, posição da folha e condições de crescimento. Normalmente, as folhas apresentam de 30 a 400 estômatos por mm2 de superfície, mas existem espécies com até mais de 1.000 mm–2. Nicotiana tabacum (fumo), por exemplo, pode apresentar até 1.200 mm–2.

Com exceção principalmente das monocotiledôneas herbáceas, que apresentam aproximadamente a mesma quantidade de estômatos na face abaxial (inferior) e adaxial (superior) da folha, na maioria das espécies os estômatos encontram-se em maior quantidade na face abaxial (dicotiledôneas herbáceas) ou mesmo exclusivamente localizada nessa face (dicotiledôneas lenhosas). Em plantas aquáticas com folhas flutuantes, os estômatos encontram-se apenas na face adaxial.

A abertura dos estômatos é exercida por mudanças na forma de um par de células, as células-guardas, que margeiam os poros. Em muitas plantas, as células-guardas são circundadas por células diferenciadas das células da epiderme da folha; as células subsidiárias, que auxiliam as células-guardas

no controle do poro estomático (ver Figura 1.21 A). As células-guardas, células subsidiárias e o poro são coletivamente chamados de complexo estomático ou aparelho estomático.

A principal característica que distingue o complexo estomático é o par de células-guardas que funciona como uma válvula operada hidraulicamente. A mudança de forma das células-guardas como consequência da absorção e perda de água leva a alterações no tamanho do poro. Quando as células-guardas estão túrgidas, os estômatos encontram-se abertos, e, quando flácidas, os estômatos estão fechados.

O maior interesse no movimento estomático deve-se à regulação das trocas gasosas e ao consequente efeito sobre a fotossíntese e produtividade. Mais de 90% do CO2 e do vapor de água trocados entre a planta e o ambiente ocorrem por meio dos estômatos.

Existem dois tipos básicos de células-guardas. O mais comum é o tipo elíptico, reniforme, e o outro é do tipo gramináceo, restrito a espécies de gramíneas e outras monocotiledôneas, como as palmeiras. Nesse segundo

grupo, o par de células-guardas tem formato de haltere (Figura 1.22). Uma das características mais preponderantes da organização dessas células está na estrutura da parede celular. A porção da parede que circunda o poro (parede ventral) é espessada, podendo atingir até 5 μm de espessura, diferentemente das células típicas da epiderme, que apresentam paredes de 1 a 2 μm. A parede dorsal, que está em contato com as células subsidiárias,

é mais fina (Figura 1.22). Associado ao espessamento parcial da parede, encontra-se o alinhamento de suas microfibrilas de celulose, estas dispostas radialmente aos poros no caso dos estômatos elípticos, ou obliquamente ao eixo da parede espessada nas extremidades das células-guardas, no caso do

tipo gramináceo (Figura 1.22). Essas características resultam em uma curvatura das células-guardas quando túrgidas, levando à abertura estomática.

O poro de um estômato típico totalmente aberto mede cerca de 5 a 15 μm de largura por cerca de 20 μm de comprimento. O somatório das áreas dos poros quando abertos perfaz cerca de 0,5 a 2% da área total da folha.

Quando as células-guardas se desenvolvem, câmaras subestomáticas ou cavidades subestomáticas formam-se no mesofilo foliar adjacente ao complexo estomático. Essas câmaras agem como reservatórios de gases que

se estendem no interior do mesofilo (ver Figura 1.20), maximizando assim a difusão de CO para tecidos fotossintéticos, aumentando ao mesmo tempo o 2

caminho de difusão do vapor de água do mesofilo para o poro estomático. Desse modo, a câmara subestomática reduz a perda de água dos tecidos fotossintéticos.

Outra característica interessante do complexo estomático é que nele não se observam plasmodesmas entre as células-guardas e as células da

epiderme e do mesofilo (ver Figura 1.20). Plasmodesmas são ligações (pontes) citoplasmáticas microscópicas, interconectando células adjacentes, funcionando como um caminho para transportes entre as células. Essas estruturas são comuns entre o mesofilo e o tecido epidérmico. A ausência dessas estruturas indica fortemente que a passagem de metabólitos das células-guardas para as células do mesofilo ou da epiderme pode não ser direta, e vice-versa.

Análises das células-guardas evidenciam também que elas diferem das outras células da epiderme na abundância de organelas. A diferença mais evidente em uma angiosperma típica é que, enquanto as células da epiderme são desprovidas ou têm poucos cloroplastos, as células-guardas são dotadas

dessa organela em maior quantidade (ver Figura 1.20), embora seja inferior à encontrada nas células do mesofilo. Os plastídios das células-guardas são ricos em grãos de amido; entretanto, se uma comparação for feita entre inclusões de amido das células-guardas em estômatos mantidos no claro (abertos) e no escuro (fechados), será observado que o amido se acumula no escuro e diminui na luz – o contrário do que ocorre em tecidos fotossintéticos pertencentes ao mesofilo, como parênquima paliçádico e

esponjoso (ver Figura 1.20).

Figura 1.22 Estômatos apresentando células-guardas dos tipos elíptico (à esquerda) e gramináceo (à direita). Observa-se, nas células-guardas dos estômatos abertos, a orientação das microfibrilas de celulose, importantes para o movimento de abertura. As setas em cada estômato indicam a direção da expansão/extensão das células-guardas, durante a abertura estomática.

 

Nas células-guardas, as mitocôndrias são bem desenvolvidas e em maior número que nas células do mesofilo. Quando os estômatos se acham abertos, as células-guardas apresentam intensa ciclose, indicando intensa atividade respiratória. Em relação às células epidérmicas, outras diferenças características das células-guardas são a presença de inclusões de óleo e a ausência de cristais e de pigmentos, como antocianina, abundantes nas células epidérmicas de algumas espécies.

O conhecimento das características do complexo estomático e, particularmente, das células-guardas é essencial para o entendimento do funcionamento dos estômatos. Muitas das hipóteses para explicar o comportamento estomático têm sido baseadas na observação estrutural das células-guardas. As células-guardas podem ser consideradas “ilhas metabólicas” sem conexão direta (i. e., plasmodesmas) com os tecidos adjacentes. Desse modo, qualquer resposta estomática rápida deve originar-se do próprio metabolismo das células-guardas em resposta ao ambiente próximo a elas, causando alterações de turgescência e movimentos de abertura ou fechamento.

 

Mecanismos reguladores do movimento estomático A abertura dos estômatos se dá em decorrência da absorção osmótica de água pelas células-guardas, trazendo como consequência um aumento da pressão de turgor (potencial de pressão, ψ ). Em vista das propriedades p elásticas de suas paredes, as células-guardas podem, de modo reversível, aumentar seu volume de 40 a 100%, dependendo da espécie. A deformação da parede das células-guardas imposta pelo aumento de volume representa o aspecto central do movimento estomático. O fechamento estomático ocorre em resposta à saída de água das células-guardas, com diminuição da pressão de turgor e o consequente relaxamento de suas paredes.

Para entender melhor o que controla a abertura e o fechamento dos estômatos, é necessário conhecer o que regula as propriedades osmóticas das células-guardas. Ao longo dos anos, vários mecanismos têm sido propostos para explicar as mudanças no potencial osmótico (ψπ) das células-guardas. No século 20, esses mecanismos foram relativamente bem estudados, indicando que várias áreas da ciência de plantas estão envolvidas, como a fotobiologia, relações iônicas das células e mecanismos hormonais.

Já em 1856, o botânico H. von Mohl propôs que a mudança de turgor das células-guardas seria responsável pelos movimentos dos estômatos. Em 1908, E. Lloyd sugeriu que a mudança de turgor dessas células seria dependente da interconversão de amido em açúcares solúveis, conhecida como a hipótese amido–açúcar do movimento estomático.

Conforme já descrito, os cloroplastos das células-guardas dispõem de grãos de amido que diminuem sua quantidade durante a abertura e a aumentam durante o fechamento estomático. O amido é um polímero de glicose, insolúvel em água, de alta massa molecular, que não contribui para o ψπ das células. Segundo a hipótese do amido–açúcar, a hidrólise do amido em açúcares solúveis faz com que o ψ das células-guardas se torne mais π negativo, diminuindo o potencial de água (ψ); com isso, essas células absorvem água por osmose, tornam-se túrgidas e os estômatos se abrem.

A hipótese do amido–açúcar foi amplamente aceita até 1943, quando S. Iamamura verificou a existência de um fluxo de potássio nas células-guardas, o que foi posteriormente confirmado em estudos envolvendo técnicas mais refinadas de quantificação desse cátion. A partir de então, tem sido consistentemente mais aceito que os íons seriam os principais responsáveis pela osmorregulação das células-guardas, sobretudo o potássio, diminuindo a importância anteriormente creditada à hipótese amido–açúcar.

Segundo essa teoria, a osmorregulação das células-guardas se originaria da entrada de íons potássio (K+) e cloreto (Cl–) e da síntese de malato2– dentro dessas células, considerados importantes solutos osmoticamente

ativos nas células-guardas (Figuras 1.23 e 1.24). O conteúdo de K+ é elevado nas células-guardas, quando os estômatos estão abertos, e diminui

quando fechados; a magnitude da elevação varia entre as espécies (Figura

1.25). Durante a abertura, quantidades de K+ movem-se das células subsidiárias e epidérmicas para dentro das células-guardas.

O fluxo de K+ para o interior das células-guardas é possibilitado pela ativação, com gasto de ATP, de uma bomba de prótons H+-ATPase

localizada na membrana plasmática (Figura 1.24). Essa afirmação tem sido evidenciada pelo uso de fusicocina (uma toxina produzida por um fungo parasita), conhecida por estimular a extrusão de prótons pela bomba, que estimula a abertura estomática. As plantas infectadas morrem por desidratação. Além disso, vanadato, que inibe a bomba de prótons, inibe a abertura estomática.

A extrusão de prótons que ocorre pela atividade da H+-ATPase leva a uma diferença de potencial elétrico por meio da membrana plasmática das células-guardas; essa diferença pode atingir até 64 mV. Com a saída de prótons, há também um gradiente de pH de cerca de 0,5 a 1 unidade. Acredita-se que a hiperpolarização da membrana plasmática das células-guardas gerada pela bomba de prótons é o que possibilita a absorção de íons potássio, por causar a abertura de canais de entrada desse íon regulados por

voltagem (Figura 1.24).

Além do K+, o Cl– e o malato2– aumentam nas células-guardas iluminadas, contribuindo para a abertura dos estômatos, e diminuem com os

estômatos fechados (Figuras 1.24 e 1.26). Esses ânions contribuem para a neutralidade elétrica das células-guardas, visto o acúmulo de K+ (carga positiva) nessas células. O balanceamento é estabelecido parcialmente tanto pela entrada de íons Cl– quanto pela produção, no citosol das células-guardas, de ânions orgânicos como o malato2– com dois grupos COO–. A contribuição relativa do Cl– e do malato2– para o balanceamento de cargas é variável entre as espécies.

De modo semelhante ao que ocorre com o K+, o Cl– é absorvido pelas células-guardas durante a abertura estomática e expelido durante o fechamento. O malato2– é sintetizado no citoplasma das células-guardas, em uma via metabólica que usa esqueletos de carbono gerados na hidrólise do

amido (ver Figuras 1.23 e 1.24). Tem sido observado, em estômatos abertos, que os níveis de malato2– nas células-guardas podem aumentar até seis vezes. A diminuição do conteúdo de malato2– dessas células durante o fechamento estomático possivelmente se deve à sua conversão em amido, à utilização desse ânion orgânico como substrato para a respiração e/ou à liberação para o apoplasto.

Figura 1.23 Acúmulo, no vacúolo, de potássio, cloreto, malato e sacarose, moléculas que provocam queda no potencial osmótico das células-guardas, causando absorção de água por essas células e, consequentemente, abertura estomática (osmorregulação). Existem três caminhos osmorregulatórios distintos nas células-guardas: 1) absorção de potássio e cloreto dependente da ativação de uma bomba de prótons (ATPase) da membrana e síntese de malato a partir da quebra do amido; 2) síntese de sacarose a partir da quebra do amido; 3) síntese de sacarose a partir da fixação do CO pela fotossíntese. RuBP: ribulose-2 1-5-bifosfato; Fru-6-P: frutose-6-fosfato; DHAP: di-hidroxiacetona-3-fosfato; 3-PGA: 3-fosfoglicerato; Glu: glicose; Glu-6-P: glicose-6-fosfato; Glu-1-P: glicose-1-fosfato; PEP: fosfoenol-piruvato. Adaptada de Talbott e Zeiger (1998).

Figura 1.24 Esquema representativo da regulação da abertura estomática induzida pela luz. Imagens de C. M. Pisicchio.

 

Assim como o K+, o fluxo de Cl– depende indiretamente da bomba de prótons H+-ATPase. Para esse ânion, acredita-se que a bomba de prótons facilite sua absorção pela entrada compartilhada dos íons Cl–H+, em virtude da ativação na membrana plasmática de transportadores simporte (ver

Capítulo 2), e não por abertura de canais (ver Figura 1.24).

Em resumo, o acúmulo de K+, Cl– e malato2– nos vacúolos das células-guardas torna o ψπ mais negativo, diminuindo o ψ. A consequente absorção de água aumenta o turgor (ψ ) dessas células e ocorre a abertura dos p

estômatos (ver Figuras 1.23 e 1.24).

Considerando as hipóteses apresentadas, nota-se que a abertura estomática representa um processo que demanda gasto de energia. As presenças de cloroplastos, mitocôndrias, enzimas respiratórias e proteínas-cinase nas células-guardas indicam a necessidade de produção de ATP nessas células. Análises sobre a geração de energia pelas células-guardas evidenciam que estas são dotadas de total capacidade de produzir, principalmente pela respiração, mas também pela fotossíntese, toda energia necessária para a abertura estomática (Assmann e Zeiger, 1987).

 

Figura 1.25 Conteúdo de potássio em células-guardas de estômatos abertos e fechados de Commelina comunis (A) e Vicia faba (B). Adaptada de MacRobbie (1987).

Figura 1.26 Esquema representativo da regulação do fechamento estomático induzido pelo déficit hídrico e pelo aumento do ABA e do CO . Imagens de C. M. Pisicchio. 2

 

Apesar de, nas últimas décadas, ter havido grande ênfase para o papel do K+, Cl– e malato2– na osmorregulação das células-guardas, mais recentemente vêm sendo retomados os estudos sobre o papel da sacarose. Estudos de acompanhamento diário do movimento estomático em folhas intactas de Vicia faba têm mostrado que o conteúdo de K+ nas células-guardas aumenta em paralelo com a abertura no amanhecer, mas decresce no início da tarde, quando a abertura continua a ocorrer. O conteúdo de sacarose das células-guardas aumenta lentamente durante a manhã, tornando-se, no início da tarde, um soluto osmoticamente ativo importante

para a manutenção da abertura (ver Figura 1.24), bem como importante fonte de energia para a produção de ATP na respiração. Além disso, o fechamento estomático no fim do dia ocorre simultaneamente com um decréscimo no conteúdo de sacarose das células-guardas (Talbott e Zeiger, 1998). A sacarose pode vir também de fora das células-guardas e contribuir para a queda do potencial osmótico. A importância da existência de fases osmorregulatórias distintas, uma dominada pelo K+ (abertura pela manhã) e outra pela sacarose (abertura à tarde), não é ainda bem compreendida.

Também existem evidências de que acúmulo de sacarose no espaço apoplástico, em torno das células-guardas, desempenha um papel importante durante o fechamento dos estômatos (Kang et al., 2007). No entanto, de modo geral, o fechamento estomático não tem despertado a mesma atenção que o movimento de abertura, embora geralmente se considere que os estômatos são levados ao fechamento por um processo inverso ao da abertura. Ocorre perda de solutos pelas células-guardas, resultando em um aumento do ψπ (menos negativo), fazendo com que saia água dessas células e diminua a pressão de turgor. Em razão de a velocidade do fechamento estomático ser alta, sugeriu-se que outras bombas metabólicas específicas seriam responsáveis pela extrusão ativa de íons durante o fechamento (MacRobbie, 1987), o que tem sido corroborado pelas observações do envolvimento de proteínas-cinase na regulação do trânsito de íons na membrana plasmática, assim como na abertura estomática.

Há cerca de 30 anos, tem-se reconhecido que íons de cálcio (Ca2+) podem controlar a abertura do poro estomático. A adição de Ca2+ a soluções em que se encontram incubados fragmentos de epiderme isolados de folhas pode estimular o fechamento ou inibir sua abertura (Mansfield et al., 1990). A presença do Ca2+ inibe a turgescência induzida pelo K+, Cl– e malato2– em protoplastos de células-guardas (células cujas paredes foram removidas). Evidências experimentais têm indicado que certos sinais para o fechamento

estomático, como o hormônio vegetal ácido abscísico (ABA) (ver Capítulo

12), estimulam a absorção de Ca2+ para dentro do citoplasma das células-

guardas (ver Figura 1.26).

Postula-se que, estimulada pelo ABA, a entrada de Ca2+ nas células-guardas provocaria uma cadeia de eventos na qual se inclui a abertura de canais de ânions que permitiria a saída de Cl– e malato2–. Essa perda de ânions favoreceria a despolarização da membrana, abrindo canais de saída de K+ das células-guardas. A perda desses solutos pelas células-guardas levaria ao aumento do ψπ e, consequentemente, do ψ, fazendo com que ela

perca água, diminuindo o turgor e fechando os estômatos (ver Figura 1.26).

A fosforilação de proteínas desempenha um importante papel na modulação da atividade dos canais de entrada de K+ nas células-guardas. O Ca2+ pode interferir na atividade desses canais, indiretamente, como ativador de proteínas fosfatases que inibem a atividade dos canais. Tratamento com inibidores de uma proteína fosfatase dependente de Ca2+ manteve a atividade de canais de potássio, mesmo com elevado nível de Ca2+ no citoplasma de células-guardas de Vicia faba (Luan et al., 1993). Assim, os íons Ca2+ podem provocar o fechamento estomático ou inibir a abertura, tanto pela inibição da abertura de canais de efluxo de Cl– e malato2– e inativação da bomba de prótons H+-ATPase quanto pela inibição

indireta dos canais de entrada de K+, via ativação de fosfatases (ver Figura

1.26).

 

Controle do movimento estomático

Fatores ambientais, como nível de água, temperatura, qualidade e intensidade de luz e concentração intracelular de dióxido de carbono, controlam o movimento de abertura e fechamento dos estômatos. Esses fatores funcionam como sinais que são percebidos pelas células-guardas e integrados dentro de uma resposta estomática bem definida. Se folhas mantidas no escuro são iluminadas, a luz percebida pelas células-guardas desencadeia uma série de respostas, resultando na abertura do poro estomático tornando possível a entrada do CO 2 e a realização da fotossíntese. Quando o nível de dióxido de carbono no interior da folha for alto, os estômatos se fecham parcialmente, preservando assim o nível de água e permitindo a realização da fotossíntese. Um dos principais fatores limitantes para o emprego da chamada “adubação com CO 2” deve-se justamente ao fechamento estomático induzido pelo aumento da concentração desse gás imposto artificialmente ao ambiente.

 

Água e temperatura

Visto que a abertura estomática só acontece quando as células-guardas se encontram túrgidas, qualquer alteração na hidratação das plantas afetará o movimento dos estômatos. Quando acontece de as células-guardas perderem mais água para a atmosfera do que sua capacidade de absorver das células vizinhas, há um decréscimo na turgidez dessas células, provocando o fechamento estomático; é o chamado fechamento hidropassivo.

Além disso, as células-guardas podem perceber certa deficiência de água do mesofilo, antes mesmo de ocorrer alguma diminuição de sua turgidez, e fechar os estômatos, mecanismo esse mediado pelo ABA. Essa resposta ao estresse hídrico é chamada de fechamento hidroativo. O estresse moderado de água nas folhas leva à síntese de ABA, o qual, chegando às células-guardas, sinaliza a ocorrência de um estresse hídrico nas proximidades, induzindo o fechamento dos estômatos. Alguns minutos após o início do fechamento, a síntese de ABA também aumenta nas células-guardas. Tal sinalização pelo ABA pode originar-se nas próprias raízes, “informando” sobre a existência de um estresse hídrico no solo.

O início da resposta do fechamento hidroativo, aparentemente, é mediado por ABA, oriundo do mesofilo ou de outras partes da planta, como as raízes, adiantando assim uma redução na perda de água. Entretanto, o fechamento prolongado poderá ser sustentado pela manutenção da síntese desse hormônio nas células-guardas em resposta ao estresse de água (ver

Figura 1.26).

A temperatura influencia indiretamente o movimento estomático. Isso ocorre porque tal movimento se encontra acoplado ao metabolismo das células-guardas; qualquer fator que afete o metabolismo afetará também o movimento dos estômatos. Sabe-se que a elevação da temperatura aumenta a atividade de qualquer célula até um ponto ótimo, após o qual ocorre um declínio. O aumento da temperatura resulta em aumento da respiração em maior grau que a fotossíntese. Essa resposta pode levar a um aumento concomitante da concentração intracelular de CO2, e este desencadear o fechamento estomático. O papel do CO no movimento estomático será 2 discutido a seguir.

 

Dióxido de carbono e luz

A luz é o sinal ambiental mais proeminente no controle dos movimentos estomáticos. Os efeitos da luz e do CO2 estão intimamente ligados, porque a concentração de CO se altera como uma função da taxa fotossintética. O 2

real mecanismo pelo qual o CO2 regula o movimento estomático não é totalmente entendido. Evidências experimentais têm indicado que os estímulos do fechamento estomático provocados pelo CO resultam do 2 aumento da sensibilidade dos mecanismos de fechamento estomático ao Ca2+ intracelular. O fechamento estomático induzido por CO 2 é fortemente inibido em condições que previnem elevações na concentração de Ca2+ nas células-guardas (Hubbard et al., 2012) – comportamento semelhante ao

papel do ABA nesse processo (ver Figura 1.26).

A importância de estudos envolvendo o CO2 pode ser visualizada, por exemplo, na necessidade de uma avaliação do impacto do aumento global da concentração desse gás na atmosfera, sobre as plantas na Terra. Mansfield et al. (1990) propuseram que as células-guardas respondem ao CO 2 de duas maneiras diretamente opostas:

• As células-guardas podem ficar mais túrgidas com o aumento da

concentração de CO , porque esse gás favorece a formação de malato 2

• As células-guardas podem diminuir o turgor com o aumento da

concentração de CO2. Isso pode envolver a modulação da

fotofosforilação e/ou fosforilação oxidativa nas células-guardas pelo

CO , conhecida como hipótese de Zeiger (Zeiger et al., 1987). 2

O que se tem notado é que as respostas ao CO2 são variáveis e parecem relacionar-se com a história da planta e, também, as condições do ambiente. No escuro, o fechamento das células-guardas pode ser atribuído ao acúmulo de CO respiratório dentro da folha. 2

Estudos desenvolvidos com estômatos em epidermes destacadas, mantidas em ambientes com concentração de CO 2 constante, têm mostrado uma resposta específica dos estômatos à luz. Com base em análises fotobióticas e metabólicas, tem-se observado que a resposta à luz é a expressão integrada de dois sistemas de fotorreceptores distintos, um dependendo da fotossíntese nas células-guardas e o outro dirigido por uma

resposta específica à luz azul (ver Figura 1.24).

A resposta da abertura estomática à luz branca é parcialmente inibida por DCMU (diclorofenildimetilureia), um inibidor do transporte de elétrons da fotossíntese. Esses resultados indicam que a fotossíntese nas células-guardas é um caminho osmorregulador importante por produzir sacarose

(ver Figura 1.24). No entanto, a observação de que a inibição é parcial sugere um componente não fotossintético envolvido com a resposta estomática à luz.

Uma evidência suficientemente consistente de que a luz tem um efeito direto e independente da fotossíntese sobre o movimento estomático foi obtida com experimentos em que se utilizou luz vermelha até a saturação da resposta fotossintética. Após essa saturação, baixos fluxos de luz azul foram adicionados quando se observou substancial incremento na abertura dos estômatos. Além disso, estudos com protoplastos isolados de células-guardas têm mostrado que estes se tornam túrgidos em resposta à luz azul, indicando que esse tipo de luz é percebido dentro das próprias células-guardas. A importância da luz azul na estimulação da abertura estomática foi evidenciada em plantas de orquídea do gênero Paphiopedilum, cujas células-guardas são destituídas de cloroplastos, portanto não respondem à abertura dependente da fotossíntese.

A resposta dos estômatos à luz vermelha é provavelmente indireta, mediada pelos não muitos cloroplastos das células-guardas, onde ocorre a fotossíntese. A resposta ao espectro de ação da luz azul é direta. Em plantas, têm sido identificados três tipos de fotorreceptores de luz azul: as proteínas criptocromos e fototropinas e o pigmento carotenoide zeaxantina. Os criptocromos e as fototropinas estão envolvidos na inibição do alongamento caulinar e no fototropismo, respectivamente. Já a zeaxantina é que funciona como pigmento receptor da luz azul nas células-guardas, provocando abertura estomática. Evidências importantes sobre isso são: o espectro de ação da luz azul para a abertura estomática é muito semelhante ao espectro de absorção de luz da zeaxantina; a inibição por ditiotreitol (DTT), bloqueador da síntese de zeaxantina, inibe a abertura estomática estimulada pela luz azul. Além da zeaxantina, tem sido observado que as fototropinas funcionam como receptor de luz azul nas células-guardas e

estão envolvidas na abertura estomática (ver Figura 1.24; Stoelzle et al., 2003; Marten et al., 2007).

A luz azul controla a atividade da bomba de prótons H+-ATPase, por um caminho envolvendo a zeaxantina ou as fototropinas. Essas moléculas absorvem luz azul, provocando, possivelmente, uma cadeia de eventos que leva à ligação de proteínas 14-3-3 (família de proteínas que se liga às proteínas sinalizadoras, p. ex., H+-ATPase; o nome 14-3-3 diz respeito ao padrão de migração dessas proteínas em gel de eletroforese) diretamente à bomba de prótons H+-ATPase, ativando-a, levando à abertura dos estômatos

(ver Figura 1.24; Kinoshita e Shimazaki, 1999).

Diversos estudos têm registrado que a luz azul, além de ativar a bomba de prótons H+-ATPase da membrana plasmática das células-guardas, estimula a biossíntese de malato. Quando irradiadas com luz vermelha, ocorre acúmulo de sacarose sintetizada na fotossíntese das células-guardas (Talbott e Zeiger, 1998), e, se baixos fluxos de luz azul são adicionados à luz vermelha, as células-guardas passam a acumular K+, Cl– e malato2– (ver

Figuras 1.23 e 1.24).

A resposta à luz azul em condições naturais é importante para a abertura dos estômatos antes do amanhecer. Frequentemente se observa abertura estomática antes do nascer do sol, quando a radiação é bem menor que a requerida pela fotossíntese. De um ponto de vista ecofisiológico, a resposta à luz azul anteciparia a necessidade de CO2 atmosférico, favorecendo a abertura estomática, preparando-se para uma fotossíntese ativa.

Existem evidências de que a inibição da abertura estomática induzida pelo aumento de Ca2+ no citoplasma, provocado pelo ABA, é maior em estômatos irradiados com luz azul, não apresentando nenhum efeito sobre a abertura estimulada pela luz vermelha (Parvathi e Raghavendra, 1997). Tal constatação está de acordo com as observações de que, além das aberturas de canais de saída de Cl–, malato2– e K+ das membranas das células-guardas, mencionadas anteriormente, o ABA, por meio do aumento nas concentrações de Ca2+ citosólico, interfere na atividade das bombas de prótons H+-ATPase, que é uma resposta ligada ao papel da luz azul (ver

Figura 1.26 e Capítulo 12).

Desse modo, o ABA pode tanto inibir a abertura quanto provocar o fechamento estomático. Quando, indiretamente, esse hormônio provoca a inibição da bomba de prótons H+-ATPase e dificulta a hiperpolarização da membrana, isso faz com que não haja aberturas de canais de influxo de K+ e inibe a abertura estomática. Quando, indiretamente, promove a ativação de canais de saída de Cl– e malato2–, que leva à despolarização da membrana e à ativação de canais de efluxo de K+, provoca o fechamento estomático (ver

Figura 1.26).

Em síntese, pautando-se nos resultados e sugestões mencionados pode-se inferir, com relativa segurança, que K+, Cl–, malato2– e sacarose estão envolvidos na redução do ψ das células-guardas, favorecendo, por conseguinte, a turgescência destas. O K+, o Cl– e o malato2– acumulam-se nas células-guardas estimulados pela luz azul. No entanto, o acúmulo dessas substâncias pode deixar de ocorrer se houver um aumento no nível de ABA, que se dá em situação de estresse de água. Contudo, a sacarose aumenta seus níveis nas células-guardas estimulada pela luz vermelha, a partir da fixação do CO 2 fotossintético e importada do apoplasto, não apresentando sensibilidade ao ABA. Mas caso ocorra um estresse hídrico, os estômatos deverão fechar-se parcialmente, dificultando a entrada de CO . 2 O bloqueio à entrada de CO2 limitará a taxa fotossintética, prejudicando o crescimento e o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo das plantas e, consequentemente, a produção agrícola e a manutenção da qualidade de muitos ecossistemas naturais.

 

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