6. Técnicas malacológicas

 

6.1 Coleta; remessa de exemplares vivos; fixação

e dissecção

COLETA

Os moluscos límnicos podem ser encontrados em vários tipos de coleções hídricas, tais como rios, riachos, lagoas, açudes, valas e alagados, preferindo geralmente águas tranqüilas ou de curso lento. Nesses ambientes devem ser procurados sob a vegetação aquática, no fundo do criadouro ou aderidos a pedras e a objetos flutuantes.

Material necessário para a coleta: pinças longas; conchas de

captura (Figura 1); pequenos sacos de tecidos ou recipientes plásticos para acondicionar os moluscos; luvas e botas de borracha; caderneta de campo, lápis e fita adesiva ou similar, para a identificação do material coletado. São também muito úteis no campo os coletes utilizados por pescadores, pois, como possuem muitos bolsos, facilitam tanto o transporte do equipamento de trabalho, como também o do material coletado.

FIGURA 1

 

A concha de captura consiste em um cabo de madeira com aproximadamente 1m de comprimento acoplado a uma peneira ou concha de metal perfurada. Uma boa concha de captura deve ter o espaço entre as malhas ou os furos em torno de 2mm, para que exemplares pequenos como Antillorbis e Drepanotrema, sejam também retidos.

A técnica consiste em raspar com a concha de captura a vegetação submersa e o fundo do criadouro, levá-la à superfície, lavando cuidadosamente o material recolhido e procurar pelos moluscos que, eventualmente, tenham ficado retidos. Pegar os exemplares com a pinça e colocá-los nos saquinhos de tecido umedecidos ou nos recipientes plásticos sem água e afixar a etiqueta de identificação para o transporte até o laboratório.

Repete-se várias vezes esta operação em diferentes pontos do criadouro, para se obter uma boa amostragem.

REMESSA DE MOLUSCOS VIVOS

Paraense recomenda a técnica que se segue para o transporte de moluscos vivos:

▪ Cortar uma faixa de gaze com uns 30 a 50cm de comprimento e 20cm de largura, molhar em água da torneira e espremer bem para retirar o excesso de água. Pode ser usado outro tipo de tecido, desde que se preste para a finalidade.

▪ Estender a faixa de gaze, apenas úmida, sobre uma superfície plana.

▪ Colocar uma fileira transversal de moluscos a uns 3cm da extremidade da gaze próxima ao operador, deixando um espaço de 1cm entre moluscos pequenos ou de 2cm entre moluscos grandes.

▪ Dobrar sobre a fileira de moluscos a extremidade da gaze próxima ao operador.

▪ Colocar adiante outra fileira de moluscos e dobrar sobre ela a parte da gaze, contendo a fileira anterior.

▪ Colocar adiante outra fileira de moluscos, dobrar a gaze sobre ela, e prosseguir até chegar próximo à extremidade mais distante da gaze, ou até esgotar a provisão de moluscos.

▪ Entre a última fileira de moluscos e a extremidade da gaze deve sobrar uma margem de tecido suficiente para dar pelo menos uma volta completa sobre o cilindro de gaze que se formou.

▪ Introduzir o cilindro de gaze úmida em um saco plástico de tamanho adequado, ou envolver o cilindro em uma folha de plástico, devendo ficar o cilindro bem protegido (envoltório de plástico bem fechado) para evitar o secamento da gaze.

▪ Colocar dentro do envoltório plástico, mas fora de contato com a gaze, uma etiqueta com os seguintes dados: localidade onde foi feita a coleta, tipo de criadouro (córrego, lagoa, brejo, vala de irrigação ou drenagem, etc), nome do coletor, data da coleta, e qualquer outra informação que seja considerada útil.

▪ Colocar o conjunto em recipiente resistente ao amassamento (caixa de madeira, lata, tubo de metal, etc), que não deve ser perfurado.

▪ Não submeter os moluscos à refrigeração, durante o manuseio ou durante o transporte.

▪ Durante o manuseio dos moluscos, evitar exposição a moscas, que depositam ovos, cujas larvas devoram os animais.

FIXAÇÃO

Para um bom estudo anatômico, os moluscos devem ser previamente anestesiados e fixados adequadamente. A técnica descrita a seguir, desenvolvida por Paraense, é utilizada na rotina de trabalho do Departamento de Malacologia do Instituto Oswaldo Cruz:

▪ Colocar os espécimes em recipiente com água limpa.

▪ Transferir aqueles que estiverem movimentando-se livremente

para outro recipiente com solução de nembutal a 0,05% em

água comum (0,1 de nembutal + 200ml de água), onde ficarão

durante a noite. Na manhã seguinte deverão estar bem

relaxados e imóveis. À falta de nembutal, pode ser usado outro

barbitúrico, desde que seja estabelecida a dose adequada.

▪ Imergir os espécimes, um a um ou reunidos em coador de

plástico ou metal (tipo coador de chá), em água aquecida a

70ºC, durante um tempo proporcional ao tamanho do exemplar

(cerca de 45 segundos para planorbídeos com cerca de 20mm

de/ diâmetro, ou outros moluscos de tamanho equivalente;

cerca de 30 segundos para planorbídeos pequenos, aucilídeos,

etc). Ter cuidado para não ultrapassar a temperatura adequada

(70 ºC) e o tempo de imersão, para evitar que o cozimento do

sangue e dos tecidos prejudique a dissecção.

▪ Imergir o animal morto em água fria e retirá-lo da concha,

segurando-o pela parte posterior da cabeça com uma pinça

adequada e puxando-o com suave tração a fim de desprender a

inserção do músculo columelar. À medida que se retira o

animal, a concha vai sendo ocupada pela água, dilui o resíduo

de sangue, evitando sua putrefação dentro da concha.

▪ Colocar o animal no fixador (líquido de Railliet-Henry,

modificado para animais de água doce):

Água destilada..... 930 ml

Cloreto de sódio..... 6 g

Formol neutralizado*..... 50 ml

Ácido acético glacial..... 20 ml

* Mantendo um pedaço de giz no frasco original

A quantidade de fixador não deve ser menor que dez vezes o volume do material a ser fixado. Deve-se trocar o fixador depois de 24 horas. Uma vez bem fixado o material, a quantidade de fixador pode ser reduzida para conservação ou remessa.

▪ Limpar a superfície das conchas com um pincel deb pelo

macio e deixá-las secar.

▪ Deixar as partes moles no fixador por pelo menos 24 horas

antes de dissecar. O material conserva-se indefinidamente no

fixador. Havendo urgência na dissecção, fazer a fixação na

estufa a 40º-45ºC durante 12 horas.

▪ Em espécimes de concha lamelada, ou de tamanho muito

pequeno, ou em drepanotremas com muitos giros, o animal

arrebenta facilmente quando se tenta extraí-lo da concha.

Nestes casos o animal, depois de imergido na água quente por

15-30 segundos, é colocado diretamente no fixador sem ser

retirado da concha. Devido à produção de CO2 resultante da

reação entre o ácido acético do fixador e o carbonato de cálcio

da concha, o fixador deve ser trocado várias vezes para evitar o

destapamento do frasco pela pressão do gás.

▪ Na impossibilidade de usar um relaxante adequado, proceder

como segue: tomar com uma pinça um espécime que esteja

movimentando-se livremente, com a cabeça e o pé bem

expostos, tendo muito cuidado para que não se retraia na

concha durante a manipulação. Mantendo a abertura da concha

para cima, imergir gradualmente o molusco em água quente,

como descrito no item 3. Manter a concha imersa na água

quente até quase ao nível da abertura durante os primeiros 15

segundos, submergindo inteiramente o espécime pelo tempo

restante. Prosseguir conforme as recomendações dos itens 4 a

8. Animais fixados sem prévio relaxamento apresentam

desvantagens para um bom estudo anatômico.

DISSECÇÃO

Material necessário: uma placa de Petri rasa, duas pinças com pontas bem finas e retas ou dois estiletes, um pincel com cerdas finas e macias e um bom microscópio estereoscópico.

A técnica de dissecção descrita a seguir é utilizada no Departamento de Malacologia do Instituto Oswaldo Cruz e foi desenvolvida por Paraense e Deslandes.

▪ Numa placa de Petri rasa, contendo um pouco de líquido

fixador, colocar o caramujo apoiado pelo lado direito, de modo

que o lado esquerdo, onde estão os gonoporos masculino e

feminino, fique para cima.

▪ Com a pinça vai-se despregando aos poucos a junção entre o

manto e o músculo columelar, sempre pelo lado esquerdo, até a

altura do estômago, onde o músculo termina.

▪ Feito isto, vira-se o animal sobre sua face esquerda, deixando

para cima a face direita e, cuidadosamente, separa-se a parte

anterior do manto, presa ao pescoço, deixando então todo o

manto preso apenas ao longo do lado direito do músculo

columelar. Desprega-se depois o lado direito, como se fez com

o esquerdo, obtendo-se então todo o manto destacado e os

órgãos paliais (coração, pulmão e tubo renal) em condições de

serem examinados.

▪ O gonoporo masculino se encontra logo abaixo do tentáculo

esquerdo, e o feminino se localiza posteriormente, sob o colar

do manto, próximo à abertura anal. O prepúcio e parte do

delicado duto deferente podem ser vistos, por transparência,

próximo ao gonoporo masculino. A dissecção do complexo

peniano inicia-se nesta região, retirando-se pele e músculos

cuidadosamente com a pinça, até que o prepúcio e duto

deferente fiquem completamente expostos.

▪ Em seguida secciona-se os músculos que prendem o prepúcio

à parede do corpo e com a pinça puxa-se cuidadosamente o

prepúcio e o duto deferente até que fiquem completamente

liberados.

▪ Depois, para facilitar a dissecção do restante do sistema

reprodutor, corta-se a cabeça-pé, o esôfago, o reto e todo o

músculo columelar, restando então na placa apenas o sistema

reprodutor e parte do sistema digestivo (estômago, intestino e

glândula digestiva).

▪ Com a pinça retira-se aos poucos as membranas, o muco e o

sangue que geralmente recobrem o sistema reprodutor. Para a

limpeza dos sistemas reprodutores é preciso redobrado cuidado

para que nada seja rompido. A limpeza é necessária para

visualizar pequenas estruturas de importância taxionômica,

como, por exemplo, bolsa e enrugamento vaginal.

▪ A glândula de albume encontra-se sobre o carrefour ou

encruzilhada genital e ligase ao oviduto por um pequeno canal,

que pode ser visto rebatendo-se o estômago, de forma que este

fique com a face ventral para cima.

▪ Após o carrefour seguem-se o delicado ovispermoduto, que se

dilata mais adiante, formando a vesícula seminal, e o ovoteste

ou glândula hermafrodita, que ocupa os giros mais internos da

concha. O ovispermoduto pode ser visto facilmente em seu

trajeto até a vesícula seminal, passando pela face ventral do

estômago e da glândula digestiva. Para dissecá-los basta ir

retirando aos poucos a glândula digestiva e o estômago. Tanto

a glândula digestiva quanto o ovoteste encontram-se recobertos

pelo manto, que deve ser retirado para facilitar a observação

das duas glândulas. Os divertículos do ovoteste são menores

do que aqueles da glândula digestiva e geralmente apresentam

cor branca-amarelada, contrastando com a coloração verde-

oliva dos divertículos da glândula digestiva.

• Quando se fizer necessário distinguir com clareza as

ramificações e o número exato de divertículos prostáticos e do

ovoteste, utiliza-se o lugol como corante. O sistema reprodutor

completo de Biomphalaria tenagophila.

PREPARAÇÃO DA RÁDULA

Colocar o saco bucal inteiro em um tubo de hemólise (8 x 75mm), contendo solução de hidróxido de sódio a 10% e lavá-lo ao aquecimento em banho-maria até se obter apenas a rádula e os maxilares. Retirar o tubo do banho-maria e derramar seu conteúdo numa placa de Petri. Em seguida lavar a rádula e os maxilares, transferindo-os para outra placa, contendo água. A montagem temporária é feita colocando-se a rádula e os maxilares em uma lâmina histológica com algumas gotas de glicerol, cobrindo-as com lamínula, afixada com esmalte de unhas. Não é necessário corar.