Sinalização purinérgica na infecção pelo vírus da dengue

Sinalização purinérgica na

 

infecção pelo vírus da dengue

 

Luciana Rocha Costa, Bruna de Barros Penteado, Fabiana Fonseca Zanoelo, Jeandre Augusto dos Santos Jaques

 

Introdução

 

A dengue consiste em uma doença infecciosa causada por um vírus pertencente ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, que possui quatro sorotipos diferentes – DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 – (Brasil, 2015) e que pode manifestar-se de forma assintomática ou sintomática.

Para eliminação de patógenos intracelulares, como o vírus da dengue (DENV), os nucleotídeos extracelulares, como o ATP e os seus produtos de hidrólise, podem agir como sinais de alerta para o reconhecimento e combate da infecção, constituindo um componente importante da resposta imune inata. Além disso, o ATP extracelular ao ativar o receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) provoca a diminuição da proteína viral NS1, necessária para a replicação do vírus (Coutinho-Silva; Ojcius, 2012; Corrêa et al., 2016).

 

Dengue

 

A dengue, que é uma doença infecciosa causada por um vírus da família Flaviviridae, possui genoma codificado na forma de RNA.

Durante o processo de replicação viral, ocorre a produção de uma poliproteína precursora, que é processada dando origem a proteínas estruturais formadoras do vírion, como o envelope (E), a membrana (prM/M) e o nucleocapsídeo (NC), constituído por um complexo de uma cópia do RNA de fita simples com múltiplas cópias da proteína do capsídeo (BYK) (Gamarnik, 2016).

O vírus é formado também por sete proteínas não estruturais identificadas como NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5.

Dentre as proteínas virais, as que mais influenciam na infecção e na virulência do DENV são: a proteína E, por ser responsável por facilitar a endocitose nas células do hospedeiro; a proteína NS1, devido a sua capacidade de inibir ou contornar a via clássica do sistema complemento; e as não estruturais. A NS2B, por existir indícios de que atua como cofator ativador da NS3, a qual, por sua vez, atua como protease, hidrolisando as junções NS2A-NS2B, NS2B-NS3, NS3-NS4A e NS4B-NS5, para que a replicação e a maturação do vírus possam ocorrer, fazendo com que esta enzima seja um potencial alvo para drogas antivirais (Byk; Gamarnik, 2016; Xie et. al., 2017). A proteína NS2A atua na montagem do vírus, auxiliando na produção de partículas virais que constituem sua membrana (Leung et. al., 2008). A proteína viral NS4A induz o rearranjo da membrana da célula infectada e participa como um dos componentes do complexo de replicação (Lee et al., 2015). Já a proteína NS4B apresenta uma estrutura N-terminal (peptídeo 2k), que guia a proteína localizada no retículo endoplasmático. Quando a NS4B está ligada ao retículo endoplasmático, o peptídeo 2k se desprende, funcionando como um sinal para que o complexo NS2B/NS3 seja ativado (Xie et al., 2017). Por fim, a NS5 apresenta atividade de polimerase de RNA dependente de RNA (RdRp), influencia diretamente a replicação, a amplificação e, e a carga viral. A atuação dessas proteínas influencia na virulência do DENV e nos sintomas que a doença pode manifestar (Xie et. al., 2017).

Dessa forma, a dengue pode se manifestar de forma assintomática ou sintomática. Na sua forma sintomática, provoca uma doença sistêmica com espectro clínico amplo, que possui três fases clínicas:

febril, crítica e de recuperação (Figura 1). Na fase febril, o indivíduo apresenta aumento na viremia entre o 1º e 2º dia de infecção, e febre geralmente alta (39°C a 40°C) de início abrupto, com duração de dois a sete dias, podendo ser acompanhada por cefaleia, mialgias, artralgias, dor retro orbitária, exantema, vômitos e diarreia. A fase crítica pode ocorrer após a diminuição da febre, com a crescente produção de imunoglobulinas como IgG e IgM pelo organismo e o surgimento dos sinais de alarme: dor abdominal intensa; vômitos persistentes; acúmulo de líquidos; hipotensão postural; hepatomegalia; sangramento de mucosa; letargia; aumento progressivo do hematócrito; e plaquetopenia. Já na fase de recuperação, ocorre a reabsorção gradual do plasma extravasado com melhora progressiva do quadro (OMS, 2009; Brasil, 2016a).

Figura 1: Fases clínicas da dengue

 

Fonte: OMS (2009) – adaptada.

 

Importância epidemiológica

 

O Brasil enfrenta epidemias de dengue desde 1986 (Valle; Pimenta; Aguiar, 2016), sendo que atualmente os quatro sorotipos do vírus circulam no país.

O vetor da doença é o mosquito Aedes aegypti (Brasil, 2016b), que também transmite outras duas arboviroses – zika e chikungunya –, que possuem extrema importância para a saúde pública, pois apresentam sintomas semelhantes e levam a uma situação preocupante pelo crescente número de casos graves e óbitos nos últimos dez anos (Brasil, 2016a).

Além disso, tem-se verificado um aumento da incidência das formas mais graves e atípicas destas doenças, como registros de manifestações neurológicas e microcefalias. Destaca-se, então, a importância dessas doenças como um caso de emergência na saúde pública nacional e internacional (Brasil, 2016b).

No Brasil, o padrão epidemiológico tem se diversificado com o passar do tempo, sendo que inicialmente a sua forma clássica atingia principalmente adultos jovens, porém a partir de 2007 foi verificado o aumento da incidência das formas graves, principalmente em crianças. Acredita-se que fatores como a circulação simultânea dos quatro sorotipos virais e a dificuldade no controle da proliferação do vetor sejam cruciais para o cenário de transmissão endêmica e epidêmica instalado em grande parte do país. Além disso, a dengue ocorre principalmente entre os meses de outubro a maio, demonstrando comportamento sazonal (Brasil, 2015).

 

Fisiopatologia

 

A mortalidade da dengue está relacionada com as alterações celulares observadas na doença, o que demonstra a necessidade de intervenção terapêutica com o objetivo de reduzir a mortalidade (Oliveira et al., 2009).

As manifestações hemorrágicas, por exemplo, ocorrem devido a alterações vasculares e a plaquetopenia. Essas hemorragias estão associadas à coagulopatia de consumo (coagulação intravascular disseminada) e a uma possível hipovolemia prolongada (Brasil, 2016a). Outras alterações hematológicas observadas são a leucopenia e a presença de linfócitos atípicos. Pode-se observar também a redução da contagem absoluta de linfócitos T CD8 e CD4, tanto durante a fase aguda da doença quanto em período de recuperação, sendo que os linfócitos atípicos compreendem formas intermediárias de ativação devido a estímulos antigênicos virais (Oliveira et al., 2009).

A plaquetopenia que ocorre na dengue pode relacionar-se com a interação indireta com o vírus, visto que as plaquetas têm a sua funcionalidade alterada devido à exposição aos mediadores secretados em resposta a infecção, como inteleucina 1 (IL-1) e fator de necrose tumoral (TNF) (Oliveira, 2012).

Os pacientes infectados pelo DENV geralmente apresentam leucopenia e plaquetopenia associadas à hemorragia. Contudo, alguns pacientes apresentam hemorragia mesmo na ausência de plaquetopenia (Oliveira et al., 2009), o que sugere que outros fatores podem estar relacionados à manifestação hemorrágica da dengue, como o comprometimento vascular, a disfunção plaquetária e os distúrbios da coagulação sanguínea.

Para o DENV ser internalizado na plaqueta, ele se liga à DC-SIGN (Dendritic cell–specific intercellular adhesion molecule-3–grabbing nonintegrin) e ao proteoglicano de heparan sulfato (HSP). Em seguida, seu genoma (+) ssRNA é liberado para o citosol e traduzido pelos ribossomos do retículo endoplasmático rugoso através da síntese de uma poliproteína precursora, que sofre proteólise e gera as proteínas

que constituirão novos vírus (Figura 2). O antígeno NS1, uma destas proteínas, que se encontra na superfície viral, é reconhecido pelo sistema imune e induz a produção de anticorpos que apresentam reatividade cruzada com plaquetas, o que pode contribuir com o processo de plaquetopenia. A poliproteína também pode agir como um modelo de replicação para NS5. As mitocôndrias facilitam a replicação e a tradução, juntamente com os remanescentes do complexo de Golgi, tornando possível a montagem dos vírions (Simon; Sutherland; Pryzdial, 2015).

Figura 2: Replicação e tradução do RNA do dengue vírus em

plaquetas

 

Fonte: Simon, Sutherland e Pryzdial (2015) – adaptada.

* HSP, proteoglicano de heparan sulfato; DC-SIGN, receptor de

lecitina de células dendríticas; ssRNA, RNA viral de fita simples.

Existem alguns parâmetros que são utilizados como marcadores precoces da gravidade da infecção pelo DENV, como a atividade aumentada da enzima lactato desidrogenase (LDH) e da enzima creatina quinase (CK), e os níveis elevados de proteína C-reativa (PCR) e redução na albumina sérica. O aumento da atividade enzimática dos marcadores pode indicar um aumento na lise celular, e a PCR pode sinalizar uma infecção ou processo inflamatório agudo. Já a hipoalbuminemia é decorrente do extravasamento de plasma, que ocorre devido ao aumento da permeabilidade vascular com a liberação de mediadores vasoativos pelos monócitos infectados (Villar-Centeno et al., 2013).

O endotélio forma a barreira primária do sistema circulatório; assim, a disfunção em suas células durante uma doença aguda pode afetar a permeabilidade vascular e causar extravasamento plasmático. No caso da dengue, vários fatores podem ocasionar esse quadro, como a apoptose de células endoteliais, e a expressão exacerbada de quimiocinas, como a proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) por monócitos (Lee et al., 2006).

Durante a fase aguda da dengue, os pacientes apresentam um aumento nos níveis plasmáticos de TNF, de interferon gama (IFN-γ) e do fator de inibição de migração de macrófagos (MIF). Em crianças infectadas pelo vírus e com manifestações hepáticas, ocorre um aumento nos níveis plasmáticos de IL-10, previamente relacionado a manifestações hemorrágicas em adultos, e também de interferon gama induzido por proteína 10 (CXCL10/IP-10) (Ferreira et al., 2015).

No decorrer da infecção pelo DENV, a elevação do TNF pode estar associada à gravidade da doença, o IFN-γ e a interleucina 1 (IL-1) contribuem para o aumento da permeabilidade capilar, e a interleucina 6 (IL-6) se eleva em casos de dengue hemorrágica e choque (Corrêa et

al., 2016), como mostra a Figura 3.

Na fase aguda da dengue, os linfócitos T ativados produzem citocinas que possuem como função a eliminação do vírus, sendo que, após a infecção, grande parte desses linfócitos sofre apoptose (Torrentes-Carvalho et al., 2014).

Durante a infecção de monócitos pelo DENV, ocorrem interações complexas com a célula hospedeira, desencadeando a ativação de fatores de transcrição, que induzem a expressão de citocinas pró-inflamatórias como TNF. Essas interações induzem não apenas a resposta pró-inflamatória, que influencia a progressão e a gravidade da doença, mas também a ativação de caspases e o aumento na expressão do receptor Fas desencadeando a cascata de sinalização da apoptose. A infecção pelo DENV poderia também ativar o fator de transcrição IRF-3, relacionado ao aumento de citocinas, como interferon tipo I, que atuaria inibindo a replicação viral (Torrentes-Carvalho et al., 2009).

Figura 3: Fluxograma do envolvimento de citocinas na

fisiopatologia da dengue

 

Fonte: autores (2019).

* IFN-γ: interferon gama; IL-1: interleucina 1; IL-6: interleucina 6;

IL-10: interleucina 10; MCP-1: proteína quimiotática de monócitos

1; MIF: fator de inibição de migração de macrófagos; TNF: fator de

necrose tumoral.

Quando comparada a outras patologias infecciosas virais com quadro clínico semelhante, a dengue apresenta como um bom indicador para o diagnóstico diferencial a presença de no mínimo 10% de linfócitos atípicos no sangue periférico (Oliveira et al., 2009).

 

Sinalização purinérgica

 

Através da ativação de receptores purinérgicos, os nucleotídeos extracelulares modulam várias funções teciduais como desenvolvimento celular, fluxo sanguíneo, secreção, inflamação e atividade imune. Os efeitos desses nucleotídeos parecem se sobressair quando atuam em conjunto com fatores de crescimento vascular, citocinas, moléculas de adesão e óxido nítrico (NO) (Robson; Sévigny; Zimmermann, 2006).

Durante o processo de eliminação de patógenos intracelulares, os nucleotídeos extracelulares, como o ATP e os seus produtos, agem como sinais de alerta no reconhecimento e controle de patógenos, constituindo um componente importante da resposta imune inata. O P2X7R de células do sistema imune, ativado pelo ATP, induz respostas pró-inflamatórias que envolvem a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e NO. Em cultura de células infectadas pelo DENV2, o ATP extracelular provoca, através da ativação do P2X7R, a redução dos níveis plasmáticos da proteína NS1, que é fundamental para o

processo de replicação viral, como se verifica na Figura 4. (Coutinho-Silva; Ojcius, 2012; Corrêa et al., 2016).

Figura 4: Fluxograma da influência do ATP extracelular na

infecção por DENV

 

Fonte: autores (2019).

* NO: óxido nítrico; NS1: proteína não-estrutural 1; P2X7R:

receptor P2X7; ROS: espécies reativas de oxigênio.

Os receptores purinérgicos são expressos em vários terminais nervosos (centrais e periféricos) e células sanguíneas (Burnstock; Brown, 1981). Nos vasos sanguíneos em condições fisiológicas, o ATP liberado de nervos simpáticos perivasculares excita o músculo liso por meio de receptores P2X, provocando vasoconstrição, enquanto que o ATP liberado das células endoteliais age nos receptores P2Y e em alguns receptores P2X, induzindo a liberação de NO que promove a

vasodilatação, como mostra a Figura 5. (Burnstock, 2006; Yegutkin, 2008).

Figura 5: Fluxograma dos efeitos da sinalização purinérgica

sobre o tônus vascular e a agregação plaquetária

 

Fonte: autores (2019).

O nucleotídeo ADP, liberado devido à lise e ativação plaquetária, é um dos mediadores do processo de agregação das plaquetas, pois promove através da ligação com receptores P2Y12 causa a ativação da

integrina αIIbβ3 e do fator de Von Willebrand. (Figura 5) (Falcão et al., 2013). Além de ser consideradas os principais mediadores da hemostasia e da geração de trombina, as plaquetas também possuem funções associadas à imunidade inata e adaptativa, como a produção e liberação de moléculas pró-inflamatórias (Semple; Italiano Jr.; Freedman, 2011). Em situações de injúria celular, como a infecção pelo DENV, essas funções plaquetárias promovem a ativação de células da resposta imune e o desequilíbrio da hemostasia.

Durante a infecção pelo DENV2, as vias de sinalização celular podem estar envolvidas na modulação da barreira endotelial através de alterações na expressão da enzima ecto-5’-nucleotidase (E-5’-NT; CD73). Experimentalmente, em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas pelo DENV2 ocorre um aumento da expressão de E-5’-NT até 72 h, mediado por interferon do tipo I. Após 72h, a redução da expressão da enzima está relacionada com a redução da função da barreira endotelial. Todas essas evidências são corroboradas pela função da enzima E-5’-NT, que catalisa a hidrólise do nucleotídeo AMP e gera como produto o nucleosídeo adenosina, que através de receptores purinérgicos do tipo P1, mantém a função de barreira das células endoteliais. Portanto, a redução da expressão da E-5’-NT e, consequentemente, a redução dos níveis de adenosina, pode contribuir para a progressão da infecção pelo vírus, o que torna possível o prolongamento da hipersensibilidade, além de favorecer o desenvolvimento de dengue hemorrágica (Patkar; Giaya; Libraty, 2013).

 

Considerações finais

 

O conhecimento acerca dos efeitos que os patógenos exercem sobre o sistema purinérgico do hospedeiro e a compreensão de seus mecanismos de defesa, que dependem da sinalização iniciada através da ativação de receptores purinérgicos durante o combate à infeção, é de grande valor para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas dirigidas ao sistema purinérgico (Coutinho-Silva; Ojcius, 2012).

Alguns estudos trazem informações valiosas acerca das alterações que ocorrem durante a infecção pelo DENV, como a redução dos níveis de proteínas virais importantes para a virulência através da ativação do P2X7R pelo ATP; e as alterações que ocorrem, durante a infecção pelo DENV2, na expressão da enzima E-5’-NT e, consequentemente, dos níveis de adenosina, importante para a regulação da função endotelial. Contudo, embora algumas características tenham sido desvendadas, ainda existe uma grande carência de estudos que investiguem o perfil do sistema purinérgico em infecções causadas pelo DENV. Existe uma lacuna ainda maior com relação às outras arboviroses veiculadas pelo Aedes aegypti, como a zika e a chikungunya. Apesar de não serem doenças novas, todas se encontram no quadro das doenças negligenciadas.

Estudos investigativos da atividade e expressão das enzimas que regulam os níveis plasmáticos de nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, os quais, através de receptores purinérgicos, regulam o tônus vascular, a resposta imune e outras funções importantes alteradas durante infecção pelo vírus da dengue, certamente, contribuirão para montar mais peças deste quebra-cabeça.

Portanto, ainda existe um horizonte a ser desbravado para compreender de forma mais completa a influência do sistema purinérgico durante a infecção pelo vírus da dengue.

 

Referências

 

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