Aspectos históricos sobre o estudo dos receptores purinérgicos no Brasil

Aspectos históricos sobre o

 

estudo dos receptores

 

purinérgicos no brasil

 

Robson Coutinho-Silva, Roberto Paes de Carvalho

 

Estudo dos receptores para

adenosina

 

Adenosina e AMP cíclico na retina: como

começou essa história?

 

Em 1978, Fernando Garcia de Mello, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (UFRJ), foi convidado a apresentar seu trabalho em reunião da Academia de Ciências do Vaticano, na época dirigida por Carlos Chagas Filho. Foi uma reunião importante, com a presença de vários ganhadores do Prêmio Nobel, incluindo Rita Levi-Montalcini, descobridora do fator de crescimento de nervo (NGF), e Marshall Nirenberg, descobridor do código genético, com quem Fernando havia trabalhado no National Institutes of Health, Estados Unidos. Fernando apresentou seu trabalho com dados novos sobre dopamina e produção de AMP cíclico durante o desenvolvimento da retina. Após sua apresentação, um dos convidados que estavam na audiência, Dr. Geoffrey Burnstock, descobridor do chamado sistema purinérgico, perguntou se Fernando havia experimentado aplicar adenosina em sua preparação de retina. Os trabalhos apresentados na reunião foram publicados nos “Scripta Varia” da Academia (De Mello, 1980), acompanhado das perguntas da plateia, inclusive a pergunta singela de Burnstock. Após a volta de Fernando ao laboratório, ele e seu aluno de iniciação científica (IC) Roberto Paes de Carvalho realizaram os experimentos com retinas de embriões de galinha, os quais demonstraram, pela primeira vez, a existência de receptores de adenosina acoplados à produção de AMP cíclico na retina. Roberto lembra-se de que ficou emocionado quando os resultados saíram a partir de contagens no cintilador e ficou muito estimulado a prosseguir este novo projeto, especialmente em estudar a ontogênese do efeito da adenosina e a caracterização dos receptores envolvidos. Uma surpresa para eles foi a diferença do nível basal de AMP cíclico quando usavam diferentes inibidores de fosfodiesterase, o IBMX e o RO-201724, com o nível cerca de 3 vezes mais alto quando utilizavam RO-201724. Fernando trouxe uma informação nova na época: o IBMX era um antagonista de receptores de adenosina, além de ser inibidor de fosfodiesterase. Realizaram então experimentos mostrando que tanto o IBMX quanto a adenosina deaminase, uma enzima que catalisa a conversão de adenosina em inosina, eram capazes de diminuir o nível basal de AMP cíclico em retinas incubadas com RO20-1724. Isso evidenciava o fato de que o nível mais alto obtido com o RO20-1724 era devido à liberação de adenosina pelo tecido e subsequente ativação de receptores acoplados positivamente à adenilil ciclase.

Verificaram também que, na presença de RO20-1724 e adenosina deaminase, a incubação com o análogo de adenosina 2-cloroadenosina, resistente à ação da adenosina deaminase, era capaz de aumentar o nível de AMP cíclico. Mostraram que o efeito da adenosina aparecia somente por volta do dia 13 de desenvolvimento do embrião (E13), um período marcado por intensa formação de sinapses na retina. O acúmulo de AMP cíclico aumentava em idades subsequentes e atingia um máximo por volta de E17. Depois desse período, o acúmulo diminuía progressivamente e era bem menor no período pós-eclosão. Como Fernando tinha caracterizado anteriormente o acúmulo de AMP cíclico induzido por dopamina na retina, neste estudo também procuraram verificar se o efeito da adenosina era mediado pela liberação de dopamina, especialmente porque o efeito da adenosina aparecia em período do desenvolvimento em que ocorria a formação de sinapses. Utilizando antagonistas de receptores dopaminérgicos, mostraram que o efeito da adenosina era independente da dopamina. Assim, o estudo da ontogênese do efeito da dopamina e o da adenosina mostrou que eles têm um perfil de desenvolvimento diferente, estando o da dopamina já presente em E7 e o da adenosina somente sendo observado em E13.

O grupo mostrou que a adenosina promovia acúmulo de AMP cíclico em culturas de retina do mesmo modo que a dopamina. Nessas culturas, incubação prolongada com dopamina ou adenosina induzia a um decréscimo do acúmulo de AMP cíclico quando eram lavadas e estimuladas com cada uma das substâncias. Essa foi uma das primeiras demonstrações claras de que esses sistemas podiam sofrer um processo de “down-regulation” de receptores, o que levou à publicação do trabalho no PNAS, em 1982, intitulado Regulation of dopamine and adenosine-dependent adenylate cyclase systems of chicken embryo retina cells in culture. A autoria foi de Maria Christina de Mello, Ana Ventura, Willian Klein, Fernando de Mello e Roberto Paes de Carvalho (De Mello et al., 1982). O trabalho sobre a adenosina e o acúmulo de AMP cíclico durante o desenvolvimento da retina, com o título Adenosine-elicited accumulation of adenosine 3’-5’ – cyclic-monophosphate in the chick embryo retina, foi publicado no Journal of Neurochemistry no mesmo ano de 1982, em coautoria de Roberto Paes de Carvalho e Fernando de Mello (Paes de; De Mello, 1982).

 

Interação adenosina-dopamina

 

Devido à existência de dois sistemas de sinalização na retina acoplados à produção de AMP cíclico, o dependente de adenosina e o dependente de dopamina, o grupo estudou a interação entre eles. A adição conjunta de dopamina e adenosina em concentrações saturantes ou sub-saturantes não levava a um aumento aditivo de AMP cíclico, como era de se esperar caso os dois sistemas fossem independentes. Na época, existia na literatura trabalhos mostrando a existência de um receptor de adenosina acoplado negativamente à adenilil ciclase, denominado receptor A1. Uma pergunta do grupo foi se os receptores A1 também estariam expressos na retina, produzindo inibição da produção de AMP cíclico. Mostraram, então, que adenosina inibia a produção de AMP cíclico estimulada por dopamina em estágio embrionário precoce, em que não há estímulo por este nucleosídeo. Em seguida, caracterizaram esse efeito como mediado por receptores A1, baseados em critérios farmacológicos, especialmente a ordem de potência de diferentes análogos. Uma inibição máxima de 70% do estímulo com dopamina era observada, indicando a existência de uma população de receptores de dopamina (30%) que não seria modulada via receptores A1.

Outro achado interessante foi que a adenosina não inibia o estímulo por apomorfina, um agonista parcial de dopamina, em nenhuma fase do desenvolvimento embrionário, inclusive no período pós-eclosão. O estímulo por apomorfina era cerca de 30% daquele observado para a dopamina e constante durante o desenvolvimento, sendo semelhante ao da dopamina no período pós-eclosão. Os resultados sugeriram a existência de duas populações diferentes de receptores de dopamina durante o desenvolvimento da retina: uma população presente em idades precoces do desenvolvimento (D1E), que produz aumento grande de AMP cíclico e que pode ser modulada por receptores A1; e outra, estimulada também por apomorfina, com expressão constante durante o desenvolvimento, que não era modulável por receptores A1 (D1). Uma evidência para esse modelo foi a ausência de inibição por dopamina ou apomorfina em retinas do período pós-eclosão, indicando que D1E desaparecia nesse período.

Esse trabalho, que mostrava a existência dos receptores A1 na retina e sua caracterização farmacológica e desenvolvimento, foi publicado, em 1985, no Journal of Neurochemistry com o título Expression of A1 adenosine receptors modulating dopamine-dependent cyclic AMP accumulation in the chick embryo retina, por Roberto Paes de Carvalho e Fernando G. de Mello (Paes de; De Mello, 1985). Uma pergunta gerada por esse trabalho era qual a função desempenhada pelos receptores D1E. Outra pergunta questionava se os receptores A1 realmente não eram mais expressos no período pós-eclosão ou continuavam a existir, mas não mais acoplados à inibição da adenilil ciclase. Para tentar responder à primeira pergunta sobre receptores D1E, Fernando e Christina de Mello trabalharam por um período de 2 anos (1985-1987) no laboratório do Dr. William Klein da Northwestern University, Estados Unidos. Mostraram que a dopamina inibia crescimento de neuritos e motilidade de cones de crescimento em neurônios de retina através de receptores D1 acoplados à produção de AMP cíclico, evidenciando, pela primeira vez, um efeito da dopamina em idades precoces do desenvolvimento do sistema nervoso. Esse trabalho foi publicado por Karen L. Lankford, Fernando G. de Mello e William Klein em 1988 (Lankford et al, 1988).

Enquanto isso, o já professor na UFF Roberto Paes de Carvalho utilizou a técnica de “binding” (ligação) para ter uma evidência mais direta do desenvolvimento e expressão dos receptores A1 na retina. Roberto utilizou o análogo ciclohexiladenosina (CHA) marcado com trítio e conseguiu detectar sua ligação a receptores A1. Foi mostrado que esse análogo, que também inibia a produção de AMP cíclico induzida por dopamina, apresentava ligação homogênea e a uma única classe de sítios tanto em homogeneizados de retinas pós-eclosão quanto em E12. A ontogênese dos receptores mostrou sua presença desde E10, crescendo até E17 e decrescendo no período pós-eclosão. No entanto, para sua surpresa, o nível de receptores no período pós-eclosão ainda era muito alto, apesar de não ser mais detectada a inibição por adenosina do acúmulo de AMP cíclico induzido por dopamina nesse período. Isso indicava que os receptores estavam presentes, mas não acoplados à adenil-ciclase ou à atividade dessa enzima estimulada por dopamina.

Experimentos foram feitos no período pós-eclosão, quando se observou que CHA era capaz de inibir a produção de AMP cíclico induzida por forskolina, um estimulador direto da adenilil ciclase, e não por dopamina. Além disso, experimentos de binding utilizando GppNHp, um análogo não hidrolisável de GTP, em diversas idades embrionárias, mostraram que os receptores A1 estão acoplados a proteínas G em todos os períodos do desenvolvimento da retina, inclusive no pós-eclosão. Portanto, os dados indicaram que os receptores A1 continuavam expressos no período pós-eclosão, mas não mais acoplados à modulação do efeito da dopamina, e reforçaram a hipótese da existência de D1E. Esse trabalho foi publicado, em 1990, no Journal of Neuroscience Research, com o título Development of A1 adenosine receptors in the chick embryo retina (Paes de, 1990).

 

Localização de receptores A1, transportadores

de adenosina e da própria adenosina na retina:

uma saga americana

 

Um projeto que Roberto Paes de Carvalho desenvolveu em seu pós-doutorado nos Estados Unidos, aproveitando a “expertise” dos laboratórios de Solomon Snyder e Ruben Adler na Universidade Johns Hopkins, foi a análise autorradiográfica e imunocitoquímica da adenosina e seus receptores e transportadores durante o desenvolvimento da retina. Para localizar os receptores e transportadores, utilizaram a técnica de autorradiografia e conseguiram evidenciar os receptores A1 nas regiões plexiformes da retina desde E12 até o período pós-eclosão em quantidades crescentes, como observado nos experimentos anteriores de binding. Conseguiram também detectar a expressão de transportadores de adenosina que já estão presentes na retina desde E8 com uma distribuição dispersa em toda a extensão da retina, que nesta idade ainda não apresenta camadas plexiformes bem distinguíveis. De modo interessante, os transportadores passam a ser localizados preferencialmente nas regiões plexiformes a partir de E12 e até o período pós-eclosão. Utilizando um anticorpo contra adenosina, mostraram que o nucleosídeo não está presente em retinas E8, mas em E15 e no período pós-eclosão em células localizadas na camada nuclear interna, na posição das células amácrinas, e na camada de células ganglionares e também nos fotorreceptores. Esse trabalho, intitulado Developmental regulation of adenosine A1 receptors, uptake sites and endogenous adenosine in the chick retina, foi publicado por Roberto na revista Developmental Brain Research, em 1992, em colaboração com Karen Braas, Ruben Adler e Solomon Snyder (De Carvalho et al., 1992).

A saga americana continua: estudos

adenosinérgicos nas culturas do Ruben

 

As culturas purificadas de neurônios de retina usadas no laboratório de Ruben Adler propiciaram a realização de estudos de captação e liberação de adenosina através de cintilação líquida e autorradiografia. Os resultados mostraram que os neurônios em cultura captavam adenosina de maneira dependente de tempo e concentração, o que podia ser inibido pelos bloqueadores do transporte NBI ou dipiridamol. A autorradiografia e a imunocitoquímica revelaram que fotorreceptores e cerca da metade dos outros neurônios captavam adenosina ou apresentavam o nucleosídeo endógeno. A adenosina tritiada captada pelas células também podia ser liberada por exposição a concentrações despolarizantes de potássio. Muito interessante foi o fato de tal liberação ter sido completamente bloqueada por inibidor de canais de cálcio dependentes de voltagem, revelando uma liberação cálcio-dependente de adenosina e indicando um mecanismo clássico vesicular de liberação. A análise por HPLC do material liberado revelou uma maior proporção de inosina (70%), com níveis menores de hipoxantina, adenosina e nucleotídeos. Esse trabalho foi publicado, em 1990, no Journal of Neurochemistry, com o título Analysis of adenosine immunoreactivity, uptake and release in purified cultures of developing chick embryo retinal neurons and photoreceptors. Seus autores foram Roberto Paes de Carvalho, Karen Braas, Solomon Snyder e Ruben Adler (Paes de et al., 1990).

 

Continuando a liberar adenosina no Brasil

 

De volta ao Brasil, Roberto e seu grupo estudaram o efeito de neurotransmissores, em especial o glutamato, sobre a liberação de purinas nas culturas purificadas. Houve muitas dificuldades para realizar esses experimentos devido às condições adversas para realizar culturas e por não haver na época alunos de pós-graduação em dedicação integral ao projeto na UFF. Apesar disso, um importante trabalho para o grupo, cujo título era Activation of glutamate receptors promotes a calcium-dependent and transporter-mediated release of purines in cultured avian retinal cells: Possible involvement of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, foi publicado no Neurochemistry International, em 2005, em coautoria com os alunos de IC Bruno Vieira Dias, Rochele Alberto Martins, Mariana Rodrigues Pereira, Camila Cabral Portugal e Claudia Lanfredi (Paes de Carvalho et al., 2005). Eles mostraram, neste estudo, que o glutamato promovia liberação de purinas através da ativação de receptores NMDA ou AMPA/Kainato. Também foram analisados os componentes metabólicos captados e liberados em condições basais ou estimuladas por glutamato. Enquanto 85% da radioatividade permanecia como adenosina no meio extracelular em 15 minutos de exposição às células, mais de 95% da radioatividade intracelular correspondia a nucleotídeos, evidenciando uma intensa atividade de adenosina cinase. De modo interessante, a análise do material liberado revelou que a maior parte da radioatividade correspondia à inosina, de modo semelhante ao observado na liberação de purinas por altas concentrações de potássio em culturas purificadas como descrito anteriormente. Outros resultados muito importantes também foram reportados no estudo. A liberação induzida por glutamato ou kainato foi completamente inibida em ausência de cálcio no meio extracelular, mostrando que a liberação era dependente de cálcio. No entanto, a liberação foi bloqueada por NBI, inibidor do transporte de adenosina.

Esses resultados pareceram inicialmente contraditórios, uma vez que a liberação dependente de cálcio é comumente relacionada com a liberação vesicular de neurotransmissores. Mas uma possibilidade seria que a liberação fosse mediada pelo transportador e que este seria regulado por algum evento dependente de cálcio. De fato, observaram uma inibição completa e concentração-dependente da liberação induzida por NMDA ou kainato e também da captação de adenosina por KN62, KN93 ou um peptídeo meristoilado inibidor específico da CAMKII. De modo interessante, tais compostos foram eficazes em inibir a captação de adenosina, mas não a de GABA ou colina, indicando a especificidade do efeito. Além disso, não foram observados efeitos dos inibidores sobre o metabolismo da adenosina, sugerindo sua atuação direta ou indireta sobre o transporte de adenosina. Em conclusão, esses resultados sugeriram que o processo de liberação de purinas por glutamato em culturas de retina era mediado por ativação de receptores NMDA ou AMPA/Kainato, influxo de cálcio e ativação da CAMKII. Essa ativação, direta ou indiretamente, era capaz de induzir a liberação de purinas através do transportador.

 

Estudo da captação de adenosina em neurônios

e células gliais da retina em cultura

 

A presença de células gliais nas culturas levantou a questão de quanto dos efeitos seria na glia. No caso da adenosina, investigavam se os receptores e transportadores eram expressos na glia ou quais efeitos teria a ativação desses receptores na glia. Em 2011, foi publicado o trabalho Differential adenosine uptake in mixed neuronal/glial or purified glial cultures of avian retinal cells: Modulation by adenosine metabolism and the ERK cascade na Biochemical and Biophysical Research Communications, de autoria de Alexandre dos Santos Rodrigues, Jainne Martins Ferreira e Roberto Paes de Carvalho (Dos Santos Rodrigues et al., 2011).

Nesse trabalho, utilizando culturas mistas e culturas purificadas de glia de retina, os autores observaram que a captação de adenosina ocorria na glia. Os dados indicaram a existência de diferentes tipos de transportadores nas culturas como ENT1, sensível à inibição por NBI, e também o ENT2, insensível ao NBI. A captação também foi inibida pela incubação prévia da adenosina tritiada com adenosina deaminase, indicando que é específica para adenosina. Além disso, iodotubercidina, inibidor de adenosina cinase, inibiu a captação mostrando a importância do metabolismo como uma força de direcionamento para este tipo de transporte equilibrativo.

Outro resultado interessante registrado nesse artigo foi a inibição do transporte por inibidores seletivos da via das MAP kinases (especificamente da MEK), que não tiveram efeito no metabolismo intracelular da adenosina, mostrando que essa via de sinalização está envolvida direta ou indiretamente na atividade do transportador, de modo semelhante ao observado anteriormente para a CAMK II.

 

Voltando um pouco no tempo: Regulação da

sobrevivência neuronal por adenosina

 

Por volta do ano de 1994, foram feitos experimentos utilizando culturas purificadas de neurônios e culturas mistas de retina tratadas prolongadamente com adenosina para verificar se ocorria efeito nos receptores de adenosina e na liberação de adenosina. As culturas mistas normalmente têm seu meio trocado em virtude da alta densidade de células, mas as culturas purificadas não. Quando, inadvertidamente, trocou-se o meio das culturas purificadas e não das mistas, observou-se que as purificadas apresentavam intensa morte celular, mas que isso não ocorria nas culturas tratadas com adenosina, sugerindo um papel neuroprotetor da adenosina sobre o evento de morte celular induzido pela troca de meio.

Esse trabalho foi continuado por Gabriel Andrade Maia, aluno de IC da Medicina, e, mais tarde, pela mestranda Jainne Martins Ferreira. Verificou-se que a troca do meio induzia uma morte celular de cerca de 50% dos neurônios, inclusive de fotorreceptores. Um efeito de morte semelhante ocorria pela incubação com adenosina deaminase, sem troca de meio, um efeito bloqueado por EHNA, um inibidor da enzima, sugerindo que adenosina atuava como um fator trófico para os neurônios. Essa sugestão foi também corroborada pela descoberta de que o NBI, bloqueador da captação de adenosina, promovia efeito neuroprotetor semelhante à adenosina.

Outro achado importante foi a necessidade de uma pré-incubação de, pelo menos, 24 horas antes da troca de meio para obter-se o resultado neuroprotetor, sugerindo que algum evento de longa duração, por exemplo, a síntese de proteínas, era importante para desencadear a neuroproteção. O receptor de adenosina envolvido no fenômeno era o A2A, pois o agonista CGS21680, mas não o agonista A1 CHA, promovia o mesmo efeito. O análogo permeável de AMPc 8-Bromo AMP cíclico tinha o mesmo efeito protetor, corroborando o achado de que o receptor A2A, acoplado positivamente à adenilil ciclase, é o receptor envolvido. A troca por um meio condicionado obtido de uma cultura irmã, em contraposição ao meio fresco utilizado nos experimentos anteriores, não induzia morte celular, sugerindo que fatores presentes nesse meio eram suficientes para promover a neuroproteção.

Esse trabalho, cuja autoria era de Roberto Paes de Carvalho, Gabriel Maia e Jainne Ferreira, foi publicado, em 2003, na Neurochemical research, com o título Adenosine Regulates the Survival of Avian Retinal Neurons and Photoreceptors in Culture (Paes de Carvalho et al., 2003).

 

Excitotoxicidade do glutamato também é

bloqueada por adenosina

 

Em 1998, Jainne Martins Ferreira iniciou experimentos com glutamato e neuroproteção por adenosina. Em culturas purificadas de neurônios, mostrou que a adição de glutamato promovia uma grande morte celular, que podia ser fortemente atenuada por adenosina. O trabalho foi publicado na revista Brain Research, em 2001, com o título Long-term activation of adenosine A receptors blocks glutamate excitotoxicity in cultures of avian retinal neurons, com autoria de Jainne M. Ferreira e Roberto Paes de Carvalho (Ferreira; Paes de Carvalho, 2001).

Inicialmente, mostrou-se que a toxicidade do glutamato nas culturas podia ser inibida tanto por MK801, bloqueador do canal NMDA, como por DNQX, antagonista AMPA/kainato. No entanto, o efeito do Kainato também era fortemente inibido por MK801, evidenciando um efeito preponderante via receptor NMDA. O efeito tóxico do glutamato era máximo em 24 horas e em concentrações na faixa de 50 µM. A pré-incubação das culturas por 48 horas com adenosina e EHNA, inibidor de adenosina deaminase, ou com NBI bloqueou a morte celular induzida por glutamato ou kainato. Os análogos permeáveis de AMP cíclico 8-bromo e Sp-AMP cíclico tiveram efeito semelhante, assim como os agonistas A2A CGS 21680 e DPMA, mas não o agonista A1 CHA. Os resultados mostraram que a ativação crônica dos receptores A2A bloqueava a excitotoxicidade do glutamato de modo semelhante ao que ocorria com a troca do meio.

 

Adenosina tem vida dupla dependendo da fase

do desenvolvimento

 

Culturas purificadas de neurônios são realizadas a partir de retinas de embriões em E8 e contém cerca de 30% de fotorreceptores e o restante de outros neurônios de diferentes polaridades. Ruben Adler e colaboradores mostraram que, quando as culturas eram realizadas a partir de retina de E6, a proporção de fotorreceptores crescia para cerca de 80/90%. Esses resultados foram interpretados através de um modelo chamado default pathway em que a via predominante de diferenciação das células da retina era em direção a fotorreceptores e a diferenciação para outras células dependeria de fatores instrutores que seriam produzidos e liberados no correr do desenvolvimento (Adler; Hatlee, 1989). Portanto, a diminuição do número de fotorreceptores nas culturas em E8 quando comparadas com culturas E6 ocorreria devido à exposição das células aos diferentes fatores antes de serem semeadas nas culturas.

Estudos com as culturas E6 foram feitos com o intuito inicial de verificar se diferentes neurotransmissores teriam efeito instrutor nesse modelo. Surpreendentemente, quando se adicionava adenosina ou agonistas A2A nas culturas E6 no primeiro dia de cultura, observou-se uma intensa morte celular, ao contrário do descrito anteriormente para as culturas E8 em que a ativação do receptor A2A promovia sobrevivência celular. De modo interessante, o efeito de morte é mediado por PKC e não por PKA, e, enquanto a ativação do receptor A2A inibia a fosforilação da CREB em culturas E6 via PKC, essa ativação induzia aumento da fosforilação da CREB em culturas E8 via PKA. Estudos “in vivo” foram também realizados nas idades correspondentes do desenvolvimento embrionário. A injeção “in ovo” do agonista A2A induziu desfosforilação da CREB e morte celular na retina E9 quando injetado em E6, principalmente na camada de células ganglionares.

O contrário, isto é, aumento da fosforilação da CREB, foi observado em retinas E11 quando o ovo injetado continha o embrião em E8.

Esses resultados foram publicados no Journal of Neurochemistry, em 2011, com o título Developmental regulation of neuronal survival by adenosine in the in vitro and in vivo avian retina depends on a shift of signaling pathways leading to CREB phosphorylation or dephosphorylation, de autoria de Renato Socodato, Rafael Brito, Karin Calaza e Roberto Paes de Carvalho (Socodato et al., 2011).

 

Regulação da expressão dos receptores A1: uma

outra história

 

Como relatado anteriormente, os receptores A1 de adenosina são expressos na retina desde fases precoces do desenvolvimento embrionário modulando negativamente a atividade da adenilil ciclase. No entanto, esses receptores não pareciam ser expressos nas culturas densas em mocamada, pois não era detectada inibição por agonistas A1 do acúmulo de AMP cíclico estimulado por dopamina. De modo interessante, essa inibição podia ser detectada em culturas de agregados de retina na mesma idade embrionária, indicando que a expressão de tais receptores estava sob regulação de contactos celulares ocorrendo nos agregados (que apresentam padrão histotípico organizado semelhante ao tecido in vivo), mas não nas culturas em monocamada. A incubação prolongada das culturas, tanto com análogos permeáveis de AMP cíclico como 8-bromo e Sp AMP cíclico quanto com forskolina, um ativador direto da adenilil ciclase, promovia aumento marcante da expressão de receptores A1, quando detectados por ensaio de “binding”.

Em concordância com os dados relatados, a exposição das células a agonistas A2A promovia um aumento semelhante na expressão de receptores A1 e esse efeito era dependente de PKA e síntese proteica. Além disso, a incubação prolongada das culturas com agonistas A2A promovia aumento dos receptores A1 e, concomitantemente, uma diminuição da expressão dos receptores A2A, sugerindo que a expressão dessas duas classes de receptores apresenta uma regulação recíproca. Esse estudo foi publicado, em 2010, no Journal of Neurochemistry, com o título Modulation of A1 adenosine receptor expression by cell aggregation and long-term activation of A2A receptors in cultures of avian retinal cells: Involvement of the cyclic AMP/PKA pathway, cuja autoria era de Mariana Rodrigues Pereira, Vanusa Rocha Hang, Eliza Vardiero, Fernando G. de Mello e Roberto Paes de Carvalho (Pereira et al., 2010).

 

O início do estudo dos receptores

purinérgicos P2 no Brasil

 

O estudo dos receptores purinérgicos P2 no Brasil teve seu início com os trabalhos pioneiros do professor Pedro Muanis Persechini do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ, no início da década de 90. Persechini estudava, na década de 80, propriedades eletrofisiológicas de membranas de macrófagos. Nessa ocasião, ele descreveu canais de potássio ativados por Ca 2+ em macrófagos e células multinucleadas (Persechini et al, 1981; Persechini; Oliveira Castro, 1987). Em 1986, realizou seu Pós-Doutorado na Rockfeller University, sob supervisão do Dr. John Ding-E Young, referência internacional em mecanismos efetores de citotoxidade de linfócitos. Dr. Persechini participou da descoberta da perforina, molécula formadora de poros em linfócitos citotóxicos, secretada junto com granzima e envolvida em atividades de citotoxidade mediada por célula (Jiang et al., 1988; Kwon et al., 1989; Persechini; Young, 1988; Young et al., 1988). Na ocasião, assistira, na Rockfeller University, a uma conferência cuja abordagem era os efeitos do ATP extracelular em macrófagos, que incluía a ativação de uma possível molécula formadora de poro. Como ele estudava canais iônicos em macrófagos e moléculas formadoras de poros, foi desafiador pensar na ideia de estudar canais iônicos induzidos por ATP em macrófagos.

Ao retornar ao Brasil, colocou em prática sua ideia e, usando a técnica de eletrofisiologia de Patch clamp, o grupo do professor Pedro Persechini descreveu respostas bifásicas de correntes elétricas em função do tratamento com ATP sendo uma despolarizante e outra hiperpolarizante (Albuquerque et al., 1993). Na ocasião, a corrente hiperpolarizante foi atribuída a canais de potássio dependente de cálcio, associado posteriormente aos receptores P2Y, e a corrente despolarizante e pouco dessensibilizante, a canais não seletivos a cátions monovalentes e atribuídos, posteriormente, aos receptores P2X7. Ele estava determinado em caracterizar o poro induzido por ATP nos macrófagos e apresentou ao então aluno de pós-graduação Robson Coutinho-Silva, coautor deste capítulo, o desafio de caracterizar os canais unitários das correntes elétricas induzidas por ATP em macrófagos. Não foi uma tarefa fácil.

Em continuidade à pesquisa de possíveis canais iônicos ativados por ATP em macrófagos, passaram a buscar registros unitários de atividades elétricas no limite de detecção da técnica Patch clamp. Entretanto, o registro ideal sem ruído, com uso de micropipetas especiais e impermeabilizadas manualmente uma a uma, só foi feito depois de dois anos de sucessivas tentativas em abordagens experimentais exaustivamente exploradas. Paralelamente, o grupo estava investigando atividades elétricas de outras células do sistema imune e descreveu respostas eletrofisiológicas induzidas por ATP em células fagocíticas do retículo tímico com características de células dendríticas (Coutinho Silva, R. et al., 1996a), respostas essas análogas àquelas anteriormente registradas em macrófagos.

O professor Persechini explorou a possibilidade de existência de junções comunicantes entre macrófagos justapostos. À época, havia relatos na literatura sugerindo que o fenômeno da permeabilização induzida por ATP pudesse estar relacionado à abertura de hemicanais de junções comunicantes de conexina-43. O grupo demonstrou o acoplamento elétrico de macrófagos justapostos pela técnica de double patch clamp. Os resultados obtidos na ocasião apontaram, entretanto, que não havia correlação entre a abertura de hemicanais por conexina-43 e o fenômeno da permeabilização induzida por ATP (Alves et al., 1996).

Finalmente, em 1995, o grupo do professor Persechini conseguiu o registro do canal unitário responsável pela corrente de despolarização induzida por ATP tanto em macrófagos como também em células fagocíticas do retículo tímico (Coutinho Silva, R. et al., 1996b). Esse trabalho foi pioneiro ao descrever o canal unitário do receptor P2Z ativado por ATP, que, após ser clonado, foi renomeado como receptor P2X7, tendo sido posteriormente caracterizado em inúmeras outras células do sistema imune. Apesar da importante descoberta para a área, a pergunta inicial do grupo não havia sido ainda completamente respondida, ou seja: como exatamente ATP induziria a formação de um poro na membrana de macrófagos? As correntes por eles registradas tinham condutâncias muito pequenas, em torno de 7 pS, não compatíveis com o que era esperado para poros não seletivos.

Na verdade, os resultados do grupo do professor Persechini até então alcançados indicavam que o possível poro induzido por ATP não funcionava como receptor-ligante; logo, sua abertura deveria ser dependente de segundos mensageiros. Nesse caso, as configurações da técnica patch clamp utilizadas para investigação do poro, whole cell e outside-out, não eram as mais favoráveis, uma vez que provocavam alterações no meio citoplasmático. Somente ao alterar a técnica de registro para a configuração cell-attached, que preserva o meio intracelular, foi possível registrar, em macrófagos, a atividade de canais ativados por ATP com grandes condutâncias. Demonstraram, portanto, pela primeira vez, o tão especulado poro responsável pelo fenômeno da permeabilização induzida por ATP e associada à expressão do receptor que, como já comentado, em momento posterior, foi clonado e nomeado como receptor P2X7 (Coutinho Silva; Persechini, 1997). Tratava-se de um ou dois poros com sensores de abertura voltados para a porção citoplasmática da célula e dependente de segundos mensageiros para sua abertura, como se comprovou mais tarde.

Em 1998, Robson Coutinho Silva é aprovado num concurso para o Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho e se integra formalmente ao laboratório de Imunobiofísica chefiado pelo Professor Pedro Persechini. Juntos iniciam uma exploração voltada a entender as funções dos receptores purinérgicos nas células do sistema imune. Inicialmente, descreveram a presença de receptores P2X7 em células dendríticas (Coutinho Silva et al., 1999) e fizeram uma extensiva caracterização dos receptores P2X e P2Y expressos em macrófagos de camundongos e humanos (Coutinho Silva et al., 2005). Adicionalmente, mostraram que a resposta da ativação de receptores P2X7 era reduzida durante a infecção por bactéria intracelular Chlamydia (Coutinho Silva et al., 2001).

O grupo foi responsável pelas primeiras evidências do papel dos receptores P2X7 no contexto da resposta imune disparada pela infecção de bactéria intracelular Chlamydia, protozoários T. cruzi (Mantuano et al., 2003) e Leishmania (Chaves et al., 2009) ou mesmo vírus HIV (Schachter et al., 2014; Schachter et al., 2015), inaugurando, assim, uma nova linha de investigação, buscando entender o papel dos receptores purinérgicos no contexto da quebra da homeostase, quer seja durante a infecção por parasitas intracelulares, ou até mesmo durante doenças inflamatórias como obstrução unilateral dos rins (Goncalves et al., 2006) ou doenças inflamatórias intestinais (Welter Stahl et al., 2009). Nesse sentido, o professor Persechini desnudou a cascata intracelular ativada por ATP extracelular em macrófagos (Da Cruz et al., 2006), vias envolvendo mediadores lipídicos (Da Silva Souza, H. A. et al., 2014a; Da Silva Souza, H. A. et al., 2014b), bem como demonstrou que a ativação do receptor P2X7 induz produção de ROS (Cruz et al., 2007).

Uma característica marcante na vida acadêmica do professor Persechini foi ser sempre muito crítico ao volume de burocracia que envolve a pesquisa científica no Brasil. Dizia sempre que gostaria de aposentar-se para, de forma livre, entregar-se a fazer pesquisa sem cobranças de relatórios e formulários. Infelizmente, em paralelo com a sua aposentadoria, veio a doença que interrompeu sua trajetória de forma precoce, em junho de 2018.

 

Considerações finais

 

O professor Pedro Muanis Persechini tinha uma maneira democrática de chefiar seu laboratório, oferecendo toda a liberdade intelectual aos seus alunos. Foi capaz de formar várias lideranças científicas que atuam amplificando seu legado. Assim sendo, o trabalho pioneiro do prof. Persechini permitiu nuclear diferentes grupos de pesquisa espalhados pelo Brasil e exterior. Graças a ele, seus ex-alunos continuam contribuindo para formação de recursos humanos e expansão do saber no nosso país. Como reconhecimento ao seu trabalho, o Clube Brasileiro de Purinas (CBP), em 2018, nomeou o Prêmio de Menção honrosa ofertado aos melhores trabalhos apresentados nos congressos organizados pelo CBP em “Menção honrosa Pedro Muanis Persechini”.

 

Breve biografia

 

Graduado em Física pela Universidade Federal de Minas Gerais (1973), Mestre em Física pela Universidade Federal de Minas Gerais (1976), Doutor em Ciências Biológicas – Biofísica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1984) e Pós-Doutor pela “Rockefeller University”(1989), Pedro Muanis Persechini foi professor do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais (1974-1976) e professor do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (1976-2018), onde criou seu laboratório de Imunobiofísica. Como Professor Titular, foi orientador no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Biofísica da UFRJ, tendo orientado dezenas de teses e dissertações na área da sinalização purinérgica. Seus interesses situavam-se nas áreas da Imunologia, Biofísica e suas interseções. Mais recentemente, estava focado na caracterização biofísica, molecular e funcional de receptores de nucleotídeos (P2), canais iônicos e mecanismos de transporte presentes em células do sistema imune, e no estudo dos mecanismos de indução de morte celular empregados por linfócitos citotóxicos. Com o seu trabalho, visava conseguir desenvolver novas estratégias de imunomodulação que permitissem interferir em modelos experimentais de processos imuno-patológicos, aproximando a pesquisa básica da pesquisa clínica a partir de uma visão imunobiofísica.

 

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