Sinalização purinérgica na sepse

 

Vanessa Valéria Miron, Maria Rosa Chitolina Schetinger, Andréia Machado Cardoso

 

Introdução

 

A sepse representa uma condição inflamatória amplamente estudada devido à sua gravidade e abrangência. Não é de hoje que seu tratamento e sua prevenção estabelecem conexões com pesquisas no mundo inteiro na busca por mecanismos para melhor compreender a inflamação.

Esta é uma condição fisiopatológica que envolve a síndrome da resposta inflamatória sistêmica, síndrome de disfunção de múltiplos órgãos e dano tecidual (Cinar et al. 2019). As infecções mais comumente associadas à sepse são a pneumonia (50% dos casos), a infecção intra-abdominal e a infecção urinária. Além destas, também há as infecções relacionadas a cateteres, abcessos de partes moles, meningites e endocardites (ILAS, 2017).

Muitos mecanismos são investigados nesta condição, e o sistema purinérgico parece ter um papel importante nas alterações causadas pela sepse. Todas as modificações citadas nesta pesquisa, tanto em nível enzimático, quanto de receptor e substrato, parecem estar envolvidas na disfunção de órgãos proveniente da sepse (Miron et al., 2018).

Atualmente, a sepse ainda é um dos alvos principais de pesquisas, as quais parecem estar focadas no mecanismo de ação da condição e em métodos para serem utilizados na prevenção ou nos estágios iniciais (Miron et al., 2018; Water et al., 2019), pois uma vez instalada, é muito difícil reverter o quadro que a sepse proporciona. Este capítulo se propõe a apresentar as disfunções celulares causadas pela sepse, bem como os mecanismos envolvendo o sistema purinérgico e essa condição.

 

Sepse

A sepse é definida, atualmente, como disfunção de órgãos com risco de vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção, ou seja, é uma condição que surge quando a resposta do organismo a uma infecção prejudica seus próprios tecidos e órgãos. Por vezes, essa infecção se localiza em apenas um órgão, mas gera uma resposta em todo o organismo tentando combater este agente infecioso e, assim, pode ocorrer o comprometimento de vários órgãos. Os tecidos mais atingidos são pulmões, cérebro, coração e fígado (Salles et al., 1999; Singer et al., 2016).

Essa resposta desregulada pode ocasionar morte do paciente por falência de múltiplos órgãos. No Brasil, a sepse ocupa 25% dos leitos nas UTI, constituindo-se a principal causa de morte nestas unidades. Além disso, a sepse é a principal causa de morte hospitalar tardia, superando o infarto do miocárdio e até o câncer. Segundo o Instituto Latino Americano de Sepse (ILAS), a sepse pode chegar à mortalidade de 65% dos pacientes acometidos no Brasil, sendo que a média mundial está em torno de 30-40%. Em 2003, de acordo com o ILAS, ocorreram 398.000 casos e 227.000 mortes por choque séptico no Brasil, gerando um custo de R$ 17,34 bilhões em seu tratamento. Os pacientes que sobrevivem ficam, muitas vezes, com sequelas físicas, psicológicas e até mesmo cognitivas por longos períodos de tempo, necessitando ainda de cuidados especiais (ILAS, 2017; Singer et al., 2016).

Com ajuda de softwares de banco de dados, o Instituto vem conseguindo agregar informações sobre a sepse no Brasil desde 2005 e conta com 130 instituições que enviam informações e dados para enriquecer sua base. Ao todo, mais de 60 mil pacientes acometidos de sepse e choque séptico foram incluídos nesse banco de dados desde o

ano de início até 2017. A Figura 1 mostra a quantidade de pacientes incluídos por ano nestes registros.

Figura 1: Número de pacientes incluídos com sepse e choque

séptico no software ILAS

Fonte: ILAS – Relatório Nacional (2017).

 

 

A manifestação da sepse ocorre por interação entre o micro-organismo infectante e as respostas imunes, inflamatórias e de coagulação do hospedeiro, pois a sepse é causada pela infiltração de bactérias gram-negativas e gram-positivas (Peppler et al., 2016). Após a entrada no organismo humano, uma das toxinas liberadas pelas bactérias gram-negativas é o LPS (lipopolissacarídeo), principal endotoxina e componente lipídico da membrana externa dessas bactérias. Após as moléculas de LPS serem liberadas pela parede bacteriana, sua porção tóxica, o lipídio A, é exposta às células do sistema imunológico, gerando a resposta inflamatória (Peppler et al., 2016; Salles et al., 1999). A inflamação faz parte da resposta imune não específica e ocorre em resposta a qualquer tipo de lesão corporal (Ferrero-Miliani et al., 2006).

Essa exposição ao LPS desencadeia uma cascata inflamatória, que é ativada tanto em tecido específico, quanto em nível sistêmico. Esse processo caracteriza-se pelo aumento de marcadores pró-inflamatórios, tais como as citocinas interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 6 (IL-6), e pelo aumento da produção de espécies reativas (ER) (Peppler et al. 2016; Ferrero-Miliani et al., 2006).

A IL-1 β é um membro da família da interleucina 1 (IL-1) e é produzida por quase todas as células nucleadas. A interleucina está entre os marcadores mais importantes de indução de resposta inflamatória, podendo desencadear febre, hipotensão e produção de citocinas, como a IL-6, que, por sua vez, além de também induzir febre, induz a síntese de proteínas hepáticas de fase aguda e estimula a síntese de moléculas de adesão em células endoteliais e leucócitos (Ferrero-Miliani et al., 2006).

Por mais necessárias que sejam essas citocinas para induzir a resposta inflamatória, sua produção excessiva pode causar uma instabilidade hemodinâmica, característica em pacientes com sepse. Além disso, essa produção elevada também está associada à gravidade da resposta inflamatória, que, juntamente com a produção aumentada de espécies reativas de oxigênio, pode levar à falência de múltiplos órgãos (Lin et al., 2000; Heitrich et al., 2016).

Existem outros mecanismos que desencadeiam a sepse em modelo experimental. Além da administração do LPS, outro mecanismo muito utilizado e considerado o mais fidedigno é o método de punção e ligadura cecal (CLP). As infecções intra-abdominais são responsáveis por 20% dos casos de sepse, com mortalidade de até 60%. O ceco contém inúmeras bactérias, e sua punção resulta em peritonite polimicrobiana, translocação de bactérias para o sangue (bacteremia), choque séptico, disfunção de múltiplos órgãos e, por fim, morte (Siempos et al., 2014).

O sistema imune é um dos primeiros a serem atingidos pela sepse. No primeiro estágio, quando ocorre a desordem do sistema, os linfócitos e outras células são atingidos, e a apoptose é induzida. Isto também colabora com a disfunção de múltiplos órgãos. No segundo estágio, devido à diminuição no número de linfócitos, ocorre a imunossupressão, que é maior causa de morte na sepse (Lin et al., 2000; Heitrich et al., 2016).

Devido a essas complicações no sistema imune, algumas pesquisas têm focado no sistema purinérgico, visto que esses sistemas estão interligados por uma série de mecanismos regulatórios, tais como indução de secreção de citocinas e sinalização de células imunes (Miron et al., 2018). Inúmeras pesquisas foram e estão sendo desenvolvidas com os componentes deste sistema (enzimas, nucleotídeos, receptores) na tentativa de desvendar os mecanismos da condição da sepse. Apresentam-se aqui algumas destas pesquisas que possuem resultados promissores na tentativa de combater a sepse.

 

O sistema purinérgico e a sepse

 

O sistema purinérgico modula a inflamação, a coagulação e as respostas imunes e, devido a isso, esse sistema tem sido investigado na sepse (Vuaden et al. 2007; Savio et al., 2017; Miron et al,. 2018). As pesquisas são desenvolvidas com alvos em receptores, enzimas, nucleotídeos e nucleosídeos deste sistema, buscando uma melhor compreensão do mecanismo desta condição e na busca constante de amenizar os efeitos lesivos da sepse.

Em trabalho recente, Savio et al. (2019) verificaram que a maior ativação do receptor P2X7 (P2X7R) em macrófagos pode contribuir para a produção de Óxido Nítrico (ON), citocinas inflamatórias e exacerbar a resposta inflamatória na sepse. Sendo assim, a inibição desse receptor com o uso de BBG (de antagonista brilliant blue G), diminui a produção de citocinas inflamatórias (IL1-β, IL-6 e IL-10), a produção de ON e o recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal 3 horas após a indução da sepse. Dessa maneira, esses dados reforçam a ideia de que o ATP, atuando através do P2X7R em macrófagos, contribui para a resposta inflamatória nas fases iniciais da sepse (Savio et al., 2017). Essa mesma constatação foi vista por Wu et al. (2017), quando camundongos tratados com antagonista do P2X7R (A740003) tiveram uma regressão da sepse, reduziram as respostas inflamatórias e atenuaram a disfunção da barreira intestinal com base na evidência de que os camundongos tratados exibiram uma síntese de citocinas pró-inflamatórias atenuadas e taxas de apoptose epitelial menores do que os não tratados. Assim, os autores sugerem que o bloqueio do P2X7R pode ser um potencial alvo terapêutico no tratamento da disfunção da barreira intestinal induzida pela sepse (Wu et al., 2017).

Outro receptor que está envolvido na condição da sepse é o P2X4 (P2X4R). Em estudo envolvendo camundongos nocaute para este receptor, Csóka et al. (2018), além de confirmarem que os níveis de ATP extracelular aumentam durante a sepse, verificaram que esta molécula pode atuar sobre o P2X4R, eliminando bactérias e protegendo contra lesão de órgãos e morte, uma vez que estes camundongos apresentaram carga bacteriana aumentada e diminuição da sobrevida em comparação com os controles. O estudo também utilizou Invermectina (ativador alostérico do P2X4R) como abordagem farmacológica para estudar o papel do P2X4R na sepse. Verificou-se que a Invermectina aumentou a morte bacteriana em macrófagos e melhorou o controle bacteriano e a sobrevivência dos animais após a sepse. Uma das suposições é de que o P2X4R aumenta a liberação de mediadores inflamatórios, como a prostaglandina E2, responsável pela dor e inflamação (Csóka et al., 2018).

A sepse aguda ainda foi investigada em camundongos deficientes dos receptores P2X1, P2X4 e P2X7. Verificou-se que os animais sem o P2X4R e o P2X7R estavam significativamente mais suscetíveis à sepse, morrendo mais rapidamente e tendo níveis plasmáticos de citocinas (IL-1β) maiores. Dessa maneira, os autores confirmaram que a ativação do P2X7R e do P2X4R protege contra infecções graves, seja limitando o número de bactérias no sangue ou diminuindo a secreção dessas citocinas (Greve et al., 2017).

Em nosso grupo de pesquisa, o sistema purinérgico foi investigado na sepse em nível de atividade e densidade enzimática, conforme

Figura 2. Em linfócitos, a atividade da CD39 encontrou-se diminuída 24h após a indução da sepse, e a atividade da ADA estava aumentada. Os níveis de ATP foram analisados em soro e se mostraram aumentados neste mesmo período, contribuindo com os resultados obtidos na atividade. A densidade da CD39 realizada em tecido também confirmou esses resultados se mostrando diminuída, enquanto o P2X7R se encontrou elevado (Miron et al., 2018). Esses resultados confirmam as suposições que vêm surgindo no estudo da sepse e demonstram a ligação do sistema purinérgico neste modelo inflamatório.

Figura 2: Efeitos da sepse sobre componentes do sistema

purinérgico

 

Fonte: autoras (2019).

De acordo com os dados mostrados até agora, pode-se supor que um aumento na atividade da CD39 poderia diminuir os efeitos da sepse, uma vez que ocorreria maior hidrólise de ATP. Foi isso que Csóka e colaboradores (2015) conseguiram verificar em sua pesquisa com esta enzima. Verificaram que os animais em que se injetou apirase antes da indução da sepse apresentaram uma menor mortalidade em relação a animais knockout para CD39. Além disso, a enzima foi capaz de diminuir os níveis de citocinas e quimiocinas (TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p40, e MIP-2) e proteger contra inflamação e lesão dos órgãos (coração e rim) (Csóka et al., 2015). Esses dados confirmam a ação protetora da CD39 na sepse.

Em 2007, Vuaden e colaboradores realizaram uma pesquisa in vitro e in vivo a fim de melhor compreender o envolvimento da hidrólise de nucleotídeos extracelulares em modelo de endotoxemia induzida por

LPS. Como mostra a Figura 3, in vitro, eles observaram um aumento na hidrólise de nucleotídeos nos linfócitos e uma diminuição na atividade enzimática da NPP no soro sanguíneo. In vivo houve aumento da hidrólise de nucleotídeos nos linfócitos e uma diminuição na hidrólise de todos os nucleotídeos testados no soro sanguíneo. Por fim, sugere-se um aumento do metabolismo de nucleotídeos extracelulares dependentes do tempo de indução da sepse em linfócitos e soro sanguíneo após a utilização do LPS para indução de endotoxemia, mostrando, mais uma vez, a sensibilidade das enzimas nucleotidades em relação ao LPS (Vuaden et al., 2007).

Figura 3: Efeito do LPS em modelo de endotoxemia sobre

hidrólise de nucleotídeos em linfócitos e soro de modelos in vitro

e in vivo

 

Fonte: autoras (2019).

A adenosina, por sua vez, tem papel protetor contra a sepse induzida por LPS (Riff et al., 2017; Zeng et al., 2019). Riff et al. (2017) avaliaram o papel da adenosina na linfopenia de camundongos sépticos e verificaram que a interferência com a sinalização de adenosina pode ser potencialmente benéfico para pacientes sépticos com leucopenia, já que a produção de IL-15, responsável por aumentar a sobrevivência em modelo de sepse, é dependente de adenosina (Riff et al., 2017). Além de comprovar que a adenosina atenua a disfunção cardíaca induzida por LPS por inibir a função mitocondrial, Zeng e colaboradores (2019) confirmaram que a condição da sepse está ligada ao gênero. O prognóstico é melhor para as fêmeas por possuírem mais fatores anti-inflamatórios, como a IL-10, e substâncias com atividade semelhante ao estrogênio reduzindo a ocorrência de imunossupressão. A adenosina tem atividade semelhante ao estrogênio e sua função é mediada por receptores de estrogênio (Zeng et al., 2019). Considerações finais

 

A sepse é caracterizada como uma condição letal em todo o mundo. Neste estudo aqui apresentado, foram mostrados dados epidemiológicos e algumas das características dessa condição. Por mais avançadas que sejam as pesquisas, ainda há certa carência na prevenção e no tratamento da sepse, de modo que ainda se desenvolvem buscas para melhor compreensão dos efeitos dessa disfunção.

Nesta busca, um dos sistemas que tem íntima ligação com a sepse é o sistema purinérgico. Verificou-se que a enzima CD39, os receptores P2X7 e P2X4, além do ATP e da adenosina, sofrem alteração desde o início até o final da condição e possuem, em todos os seus níveis, indícios de ser alvo promissor na busca de uma melhor compreensão da sepse, para encontrar-se um tratamento mais eficiente. Porém, algumas contradições ainda são encontradas em relação a essa ligação, como apresentado anteriormente, necessitando, assim, de novas pesquisas, talvez, com outras estratégias para estabelecer um conceito aceitável e utilizável nas redes de saúde.

 

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