Parte III – Aspectos Bioquímicos e Moleculares na Interação Parasito-Hospedeiro-Vetor

Parte III - Aspectos bioquímicos

e moleculares na interação

parasito-hospedeiro-vetor

 

8. Componentes de superfície

do parasito e o papel na

interação parasito-hospedeiro

Carlos Roberto Alves, Mariana Silva de Almeida, Franklin Souza da Silva, Bernardo Acácio Santini Pereira, Ricardo Luiz de Azevedo Pereira, Luzia Monteiro de Castro Côrtes

Protozoários, como os parasitos pertencentes ao gênero Leishmania, apresentam sua superfície recoberta por uma complexa membrana celular, que é a responsável pela manutenção da integridade do meio intracelular, mantendo-o distinto do meio extracelular. Dessa forma, a membrana celular também rege a interação do protozoário com o meio extracelular, atuando na captação de nutrientes e vias de sinalizações que definem mecanismos de adaptação do protozoário.

Como a superfície celular desses protozoários representa o primeiro contato com os diferentes microambientes dos seus hospedeiros (invertebrados e vertebrados), a expressão regulada de componentes de superfície está diretamente relacionada ao sucesso da infecção. Desse modo, os componentes de superfície dos promastigotas e amastigotas são os determinantes da interação parasito/hospedeiro nas leishmanioses e podem significar alvos de ação sobre a cadeia de transmissão da doença em ambos os hospedeiros.

A membrana plasmática desses protozoários apresenta ainda uma camada mais externa, constituída por uma rede entrelaçada de carboidratos ligados covalentemente aos lipídeos e proteínas – o glicocálice ou glicocálix (glykys = glicídios e calyx = envoltório). Esse envoltório é secretado pela membrana plasmática, por vesículas secretoras, e se mantém aderido a ela, atuando nas interações entre os protozoários e as células dos hospedeiros. Uma vez que a constituição do glicocálice pode variar entre diferentes espécies e entre as formas evolutivas de uma mesma espécie, esta pode ser utilizada para a caracterização de espécies e para o acompanhamento da mudança das formas evolutivas. De maneira geral, o glicocálice dos protozoários Leishmania é rico em glicosilfosfatidilinositol (glycosylphosphatidylinositol – GPI), lipofosfoglicanos (lipophosphoglycan – LPG), glicoinositolfosfolipídeos (glycoinositolphospholipids – GIPLs), proteínas e enzimas.

Ao longo deste capítulo será relatada a composição da membrana de superfície de Leishmania, com enfoque na atuação desses componentes no ciclo de vida do protozoário. O capítulo pretende apresentar o estado da arte desses componentes nos subgêneros Leishmania e Viannia, principalmente nas espécies que ocorrem no continente americano.

 

Lipofosfoglicano

O lipofosfoglicano (LPG) é um dos principais componentes da superfície dos promastigotas de Leishmania sp., participando na constituição do glicocálice desses parasitos (Moody et al., 1993). Foi identificado inicialmente em promastigotas por meio de anticorpos monoclonais, sendo caracterizado como um lipopolissacarídeo com propriedades anfipáticas (Handman, Greenblatt & Goding, 1984). A estrutura e a expressão do LPG variam entre as diferentes espécies e estágios evolutivos do protozoário, mostrando-se uma importante ferramenta na adaptação do parasito ante os diferentes microambientes dos hospedeiros (Pimenta, Saraiva & Sacks, 1991; Saraiva et al., 1995; Olivier, Gregory & Forget, 2005; Assis et al., 2012). Estudos in vitro utilizando Leishmania (Leishmania) major indicaram que a forma específica de LPG de amastigota desaparece após 48 horas da transformação amastigota-promastigota, enquanto durante a transformação promastigota-amastigota, a forma específica de LPG de amastigota foi detectada 12 horas após a infecção (Glaser et al., 1991). Em outras espécies, como Leishmania (Leishmania) donovani, a forma específica de amastigota não é detectada (McConville & Blackwell, 1991).

O tipo de ancoramento do LPG à superfície da membrana plasmática é realizado por um grupamento GPI [1-O-alquil-2-lisofosfatidil(mio)inositol] presente em todas as espécies de Leishmania analisadas até o momento (McConville & Ralton, 1997; Turco & Descoteaux, 1992). O GPI apresenta um núcleo fosfossacarídico com galactofuranose (Galf) interna. Uma das características do gênero Leishmania é o fato de o GPI dispor de um esqueleto formado por unidades repetitivas de fosfodissacarídeos e na região mais extrema, uma cobertura de oligossacarídeos (Turco et al., 1987; Ilg et al., 1992; McConville & Homans, 1992). Variações dessas estruturas podem ser detectadas dentro de uma mesma espécie e entre espécies de Leishmania, revelando um polimorfismo dos oligossacarídeos que as constituem, servindo, assim, como marcador específico de espécies ou do estágio em que se encontra o parasito, como proposto para Leishmania (Leishmania) mexicana e L. (L.) major.

A presença de resíduos de Gluβ1,3 nas ramificações das unidades repetitivas de Galβ1,4 Manα1-PO4 é um dos aspectos que distingue o LPG das formas promastigotas procíclicas de Leishmania (Leishmania) infantum das metacíclicas. Tais modificações são significativas na interação desse parasito com seu vetor, o flebotomíneo Lutzomya longipalpis, visto que, em contraste às formas procíclicas, as formas metacíclicas não são capazes de se ligar ao intestino do inseto vetor (Soares et al., 2002).

O LPG das formas procíclicas de Leishmania (Viannia) braziliensis foi caracterizado por não conter cadeias laterais de açúcares. Diferente das espécies do subgênero Leishmania, as formas metacíclicas de L. (V.) braziliensis produzem menos LPG e adicionam resíduos de 1-2 (β1-3)Glicose nas ramificações das unidades repetitivas de Galβ1,4 Manα1-PO4 do LPG. Essa modificação foi descrita como um novo mecanismo na regulação da estrutura do LPG durante a metaciclogênese (Soares et al., 2005).

No hospedeiro invertebrado, o LPG é importante para a fixação de promastigotas procíclicos ao epitélio intestinal, o que representa uma etapa essencial à manutenção do ciclo de vida do parasito no inseto vetor (Mahoney et al., 1999; Sacks et al., 1995; Pimenta et al., 1992). A L. (V.) braziliensis apresenta um padrão de adesão ao epitélio intestinal de Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani, que caracteriza-se como um vetor bastante competente, diferente do observado em Lu. (N.) intermedia, sendo que neste último, o LPG parece ter uma importância menor no processo de adesão (Soares et al., 2010). Estudos recentes avaliando a permanência de uma linhagem mutante para LPG de L. (L.) major (null para o gene lpg1 que codifica para enzima transferase da galactofuranose) (Spath et al., 2000) no intestino de Phlebotomus duboscqi evidenciaram que a ausência da expressão de LPG reduz expressivamente a presença de parasitos 72 horas após a infecção, sendo que após 15 a 21 dias não se detecta a presença de parasitos (Secundino et al., 2010). É interessante notar que a infecção com a cepa mutante em Lu. longipalpis, vetor não natural desse parasito, mostrou-se mais efetiva do que com a cepa selvagem, indicando que o LPG não é necessário para infecções em vetores não naturais, fato também observado em outros estudos (Secundino et al., 2010; Myskova et al., 2007).

Um polipeptídeo de 65 kDa no epitélio do trato digestório de Phlebotomus papatasi foi descrito como ligante de LPG das formas procíclicas L. (L.) major (Dillon & Lane, 1999). Posteriormente, em uma série de experimentos, a PpGalec, uma galectina expressa no epitélio intestinal de P. papatasi, demonstrou ser crucial para sobrevivência e transmissão de L. (L.) major por meio de sua ligação com LPG (Kamhawi et al., 2004). No inseto vetor – após o escape da matriz peritrófica –, os promastigotas necessitam aderir ao epitélio intestinal. Essa adesão evita a excreção dos promastigotas do interior da luz do intestino, assim como permite a sua multiplicação e posterior diferenciação, sendo um fenômeno essencial à manutenção do ciclo de vida.

No hospedeiro vertebrado, o LPG é um importante ligante de macrófagos, estando diretamente envolvido nas etapas iniciais da infecção. A utilização de uma cepa mutante de L. (L.) major, deficiente no gene lpg1 (lpg1-), revelou que o parasito apresenta uma atenuação de sua virulência nas infecções de macrófagos de camundongo. Os promastigotas lpg1- se mostraram altamente suscetíveis à ação do sistema complemento, além de terem sido afetados por agentes oxidantes produzidos pelas células do hospedeiro e perderem a capacidade de inibir a fusão do fagolisossoma (Spath, 2000; Handman & Goding, 1985; Spath et al., 2003).

Sabe-se também que o LPG de Leishmania spp. exerce uma ação inibitória sobre a atividade da proteína quinase C (PKC) de macrófagos, favorecendo o estabelecimento e manutenção da infecção, uma vez que essa enzima é um componente-chave do processo de ativação de tais células (Turco, 1999; Delgado-Domínguez et al., 2010). Embora esse efeito do LPG seja um fato estabelecido, o mecanismo de sinalização intracelular envolvido na resposta oxidativa que lesa o parasito ainda não foi esclarecido. Um avanço na compreensão da via de ação do LPG foi a descrição de que na infecção murina por L. (L.) donovani há uma ação seletiva sobre a isoforma PKC β dependente de cálcio, com diminuição da expressão e atividade dessa enzima (Bhattacharyya et al., 2001). Além disso, estudo avaliando ação de três tipos de LPG de L. (L.) infantum indicou que apenas uma variante é capaz de estimular a produção de óxido nítrico em macrófagos murinos (Coelho-Finamore et al., 2011).

Em relação ao sistema complemento, o LPG de promastigotas metacíclicas de L.(L.) major inibe a formação do complexo de ataque à membrana em virtude de suas longas cadeias de açúcar. As modificações que ocorrem na superfície dos promastigotas durante a transição entre o estágio não infectivo (forma procíclica) ao infectivo (forma metacíclica) obstruem a inserção do componente lítico C5b-9 na membrana dos promastigotas infectivos (Puentes et al., 1990; Puentes et al., 1988; Sacks, 1992). Por sua vez, LPG também pode atuar na ativação do complemento, com deposição de C3b covalentemente ligado à membrana celular, o que proporciona a ligação dos promastigotas ao macrófago via receptor C3bi, com a posterior endocitose das formas metacíclicas do parasito e lise das formas não infectivas (Puentes et al., 1988; Mosser, Springer & Diamond, 1992).

Além de atuar sobre macrófagos, o LPG de L. (L.) major promove também a ativação da resposta imune inata com a participação de linfócitos natural killer (NK) e de células dendríticas por intermédio do receptor toll-like 2 (Becker et al., 2003; Brandonisio, Spinelli & Pepe, 2004; Soong, 2008). Em linfócitos NK, esta interação do LPG com o receptor toll-like 2 leva a um aumento da síntese de interferon gama (INF-γ) e fator de necrose tumoral alfa (tumor necrosis factor alfa – TNF-α), estimulando subpopulações de linfócitos T, o que conferiu certo grau de imunidade à infecção em animais de experimentação (Becker et al., 2003).

Além dessas características indicarem o LPG como um dos possíveis candidatos à vacina contra as leishmanioses (Moody et al., 1993; Tonui et al., 2001), estudos em camundongos infectados previamente com cepas mutantes de L. (L.) major, deficientes nos genes lpg, indicaram uma resposta imune protetora contra infecção de cepas virulentas na ausência de uma forte resposta Th1 (Uzonna et al., 2004).

 

Glicoinositolfosfolipídeos

Os glicolipídeos majoritariamente estudados em Leishmania são os glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs). Também denominados GPIs livres, são glicolipídeos de baixo peso molecular e altamente expressos na superfície do parasito tanto nas formas promastigotas como nas amastigotas. Os GILPs de L. (L.) major contêm de quatro a seis resíduos de açúcar ligados ao lipídeo liso-alquil-fosfatidilinositol (McConville et al., 1990).

Estudos vêm demonstrando que os GIPLs auxiliam na sobrevivência de L. (L.) major dentro de macrófagos, inibindo a síntese de óxido nítrico principalmente pela região alquil-acil-glicerol (Proudfoot, O’Donnell & Liew, 1995; Zuffery et al., 2003). Além disso, os GILPs, de modo semelhante ao LPG, provavelmente pela porção GPI comum aos dois, atuam na inibição da atividade de PKC (Zufferey et al., 2003). Diferenças na estrutura do GILPs sugerem que sejam espécieespecífica, cepa-específica e estágio-específico (McConville & Blacwell, 1991; McConville et al., 1994).

A taxa de infecção de macrófagos por L. (V.) braziliensis tem sido relacionada com microdomínios de lipídeos da membrana externa (detergent-resistant membranes – DRMs) de promastigotas contendo GILPs. A desestruturação desses domínios é capaz de induzir a uma diminuição na taxa de infecção de macrófagos por L. (V.) braziliensis, sugerindo uma relação entre os microdomínios contendo GILPs e a infectividade desses parasitos (Yoneyama et al., 2006).

 

Proteínas e enzimas

Inúmeras proteínas têm sido verificadas na superfície das formas amastigotas e promastigotas de espécies de Leishmania, com base em estudos com marcações radioativas associadas às técnicas de imunoprecipitação, ou Western blotting, utilizando anticorpos monoclonais e soro imune de paciente e animais. Assim, uma faixa muito ampla de proteínas, com massa molecular relativa de 10 kDa até 120 kDa, tem sido encontrada. Poucas dessas proteínas têm sua função conhecida, sendo uma notável exceção a proteína ligante de laminina com 67 kDa, identificada na superfície de promastigota e amastigota de L. (L.) donovani (Bandyopadhyay et al., 2001). Assim como o observado para as diferentes formas de LPG e GILPs, muitas das proteínas encontradas parecem ser estágio-específicas, como é o caso da proteína de 116 kDa presente em promastigotas infectivas de L. (L.) major (Sacks, Hieny & Sher, 1985) e das proteínas de 23 kDa, 52 kDa e 68 kDa em promastigotas e 38 kDa, 70 kDa e 74 kDa em amastigotas de L. (L.) pifanoi (Pan, 1986).

Um dos primeiros estudos sobre as proteínas de superfície de L. (V.) braziliensis, realizado em 1985, foi uma simples comparação entre a superfície celular dos promastigotas patogênicos e os não patogênicos. Nesse estudo foi constatado que a superfície celular desses promastigotas é diferente quanto aos receptores de lectinas e quanto às cargas (Ayesta, Arguello & Hernandez, 1985). Nesse mesmo ano foi descrita outra estratégia para a análise das proteínas de superfície desse parasito, a qual inclui a iodinação da superfície celular seguida do procedimento fracionamento com detergente não iônico e cromatografia de troca iônica, para isolar uma proteína de 65 kDa de promastigotas infectivos (Misle, Márquez & Hernandez, 1985). No ano seguinte foram isoladas duas glicoproteínas da membrana celular de promastigotas de L. (V.) braziliensis, uma de 53 kDa com afinidade de ligação à concanavalina A e à Ricinus communis e outra de 47 kDa com afinidade de ligação a Dolichos biflorus (Nagakura et al., 1986).

A proteína de 11 kDa de cinetoplastídeos (Kinetoplastid membrane protein of 11 kDa –KMP-11) e as hidrofílicas aciladas (hydrophilic acylated surface protein – HASP) também estão localizadas na membrana plasmática de Leishmania spp.. Tais proteínas não apresentam domínio transmembrana, peptídeo sinal e nem âncora de GPI, e são isoladas por solventes orgânicos juntamente com o LPG. A KMP-11 apresenta fortes características hidrofóbicas e está associada ao LPG na superfície celular do parasito (Jardim et al., 1995). Já foi descrita em diversos gêneros de tripanossomatídeos (Stebeck et al., 1995), contudo suas propriedades imunorregulatórias foram confirmadas somente em pacientes com leishmaniose cutânea e mucosa, uma vez que induzem a expressão de interleucina-10 (Carvalho et al., 2005). Um estudo recente demonstrou sua presença em amastigotas e promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e também que sua expressão aumenta na superfície dos parasitos durante a metaciclogênese (Matos et al., 2010).

As proteínas hidrofóbicas aciladas de superfície (hydrophobic acylated surface proteins – HASPs) têm características hidrofílicas além de serem distintamente reguladas nas formas evolutivas do parasito e encontradas com predominância em amastigotas e em abundância na superfície de formas infectivas de L. (L.) major (Flinn, Rangarajan & Smith, 1994). Estas proteínas são expressas em genes em uma mesma região cromossômica nas espécies do gênero Leishmania (Depledge et al., 2010). Provavelmente a dupla acilação que apresentam deve mediar a associação com a membrana, agindo como uma âncora de superfície. Entre 70% a 80% das HASPs são observadas na face citosólica da membrana celular (Denny et al., 2000). Já foi proposto que em pacientes com leishmaniose visceral causada pela Leishmania (Leishmania) chagasi, as HASPs estariam atuando na imunomodulação da infecção (Vinhas et al., 1994).

A caracterização de genes por meio de métodos moleculares tem possibilitado a associação de sequências de nucleotídeos com proteínas presentes em tripanossomatídeos. É o caso de uma sequência de nucleotídeos obtida de L. (L.) donovani, a qual codifica para uma proteína com 198 aminoácidos, que apresentou 36% de identidade com a proteína amastina da superfície de Trypanosoma cruzi (Wu et al., 2000). No T. cruzi a amastina foi caracterizada com glicoproteína e atua na invasão e proliferação intracelular desse parasito (Jackson, 2010). Em razão de ausência de estudos sobre a funcionalidade dessa proteína em Leishmania spp., não se pode afirmar que tenha a mesma função da amastina de T. cruzi. Porém, sabe-se que o gene dessa proteína, semelhante à amastina, é mais expresso na fase estacionária e principalmente em amastigotas de L. (L.) donovani, podendo, dessa forma, estar relacionado à sobrevivência de amastigotas dentro do fagolisossomo (Wu et al., 2000).

Certas proteínas presentes na superfície do parasito parecem ter um papel na via de sinalização que leva à mudança de estágio dentro do ciclo de vida dos mesmos, como os receptores de adenilato ciclase (receptor AC). Essa enzima cataliza a conversão de adenosida trifosfato (ATP) a adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e, assim, participam de uma via de sinalização do AMPc já descrita em protozoários kinetoplastida (Seebeck, Schaub & Johner, 2004). Esses receptores foram descritos em L. (L.) donovani e podem induzir a mudanças de estágio pela elevação de AMPc intracelular, fato observado em T. cruzi (Sanchez et al., 1995; Biswas, Bhattacharya & Das, 2011).

A glicoproteína de 46 kDa, chamada de gp46/M-2, descrita na superfície de L. (L.) amazonensis (Kahl & McMahon-Pratt, 1987), apresenta notável resistência à digestão proteolítica. Sua estrutura contém uma sequência repetitiva de 24 aminoácidos, a qual corresponde a 22% do total da proteína madura, e um teor glicídico de 7%, correspondente a 3 kDa, além de ser ligada à membrana pela âncora de GPI (Lohhman, Langer & McMahon-Pratt, 1990). A gp46/M-2 é codificada pela mesma família de genes polimórficos do complexo de antígenos-2 de superfície de promastigotas, descrito previamente em L. (L.) major, e observa-se em sua estrutura regiões conservadas com esses antígenos (Murray, Spithill & Handman, 1989).

Dentre todas as espécies de Leishmania já estudadas, os genes que codificam gp46/M-2 não foram encontrados em somente duas espécies: L. (V.) braziliensis e Leishmania (Leishmania) enrittii (Hanekamp & Langer, 1991; McMahon-Pratt et al., 1992). Além disso, a expressão de RNA mensageiro (mRNA) da gp46/M-2 de L. (L.) chagasi apresenta indícios de ser mais elevada em promastigotas de fase estacionária de cultura, levando a crer que seria um fator de virulência desse estágio evolutivo do parasito (Beetham et al., 1997). Outro fato importante é que gp46/M-2 de L. (L.) amazonensis proporciona uma proteção contra a infecção dessa espécie em camundongos susceptíveis (Champsi & McMahon-Pratt, 1988; McMahon-Pratt et al., 1993). Tal observação sugere que a gp46/M-2 seria outro antígeno candidato a vacina contra a leishmaniose (Liew & O’Donnell, 1993).

As espécies de Leishmania têm várias proteínas reconhecidas como membros de famílias conservadas durante a evolução (Requena, Alonso & Soto, 2000). Dentre essas, se destacam os proteofosfoglicanos (proteophosphoglycan – PPG), caracterizados como polipeptídeos altamente glicosilados. São proteínas que apresentam ligação de fosfossacarídeos à cadeia peptídica por O-glicosilação. Os PPGs podem ser encontrados na membrana celular do parasito ancoradas por GPI, sendo dessa forma denominadas mPPGs (Ilg et al., 1999). A função dos mPPGs ainda não está totalmente clara, porém especula-se que, em razão da sua longa cadeia cobrindo a membrana plasmática dos parasitos, tenha papel importante como ligante a receptores de macrófagos e de células do trato digestório do inseto vetor (Ilg, 2000).

Em promastigotas, um PPG secretado e filamentoso (fPPG) forma um agregado viscoso, estabelecendo uma rede de filamentos fibrosos como um gel. O fPPG é secretado pela bolsa flagelar (Stierhof et al., 1994) com 95% de sua composição de fosfoglicanos e a porção peptídica apresentando abundância de serina, alanina e prolina. Sua extensiva glicosilação potencialmente confere capacidade de resistir à ação de proteinases, embora ainda não existam claras evidências nesse sentido. Além disso, sua participação parece ser importante no bloqueio do intestino anterior do inseto vetor, o que impede a ingestão de alimento e leva o inseto a sucessivas tentativas de se alimentar, aumentando as chances de infecção dos hospedeiros vertebrados por Leishmania spp. (Ilg, 2000; Walters et al., 1989).

Amastigotas secretam dentro do vacúolo parasitófaro outro tipo de PPG, que estruturalmente são definidos como uma cadeia polipeptídica modificada com fosfoglicanos ligados a resíduos de serina (Ilg, 2000) e contêm açúcares semelhantes aos encontrados em LPG e nas fosfatases ácidas. A secreção deste PPG modificado dentro de macrófagos parece contribuir para manutenção do vacúolo parasitóforo (Peters, Stierhof & Ilg, 1997). Adicionalmente, essa molécula também é capaz de ativar o complemento via proteína ligadora de manose (Peters et al., 1997), podendo assim contribuir para ligação da Leishmania spp. à célula hospedeira.

Várias espécies de Leishmania estudadas revelaram a expressão de fosfatases ácidas (acid phosphatase – AcP) durante seu ciclo biológico (Shakarian & Dwyer, 2000). Três destas AcP foram descritas na membrana de L. (L.) donovani com 128, 132 e 108 kDa e pH ótimo de atividade próximo a 5,5 (Remaley et al., 1985). O genes de Leishmania para as fosfatases ácidas secretadas (SAcP) e de membrana (MAcP) mostraram-se homólogos tanto em espécies viscerotrópicas como dermotrópicas (Shakarian & Dwyer, 2000; Shakarian et al., 2002).

Tanto as MAcPs (que apresentam peso molecular 120 kDa e 134 kDa) quanto as SAcPs podem ser apontadas como uma das estratégias de sobrevivência do parasito no trato alimentar do inseto vetor, e também no interior do macrófago, uma vez que interferem

na produção de metabólitos oxidativos (H - 2-O , OH , O) tóxicos ao 2 2 protozoário (Buchmuller-Rouiller & Mauel, 1987; Glew et al., 1988). Essas ectoenzimas são monoesterases capazes de hidrolisar uma variedade de substratos fosforilados, principalmente fosfolipídeos e fosfoproteínas e, dessa forma, interferem na produção de radicais livres pelos macrófagos (Glew et al., 1988). Contudo, seu papel na resposta imunológica ainda não está completamente elucidado. Estudos com amostras de soro de pacientes com leishmaniose visceral (Ellis, Shakarian & Dwyer, 1998) detectaram anticorpos contra SAcPs de L. (L.) donovani, sugerindo que sua expressão em amastigotas induz a um estímulo da resposta imune humoral.

Outras classes de enzimas presentes na membrana plasmática, no flagelo e na bolsa flagelar de diversas espécies de Leishmania são as 3’-nucleotidases (~43 kDa) (Côrte-Real et al., 1993) e 5’-nucleotidases (~70 kDa) (Campbell et al., 1991). Essas enzimas hidrolisam nucleotídeos a ácidos nucléicos 3’-AMP e 5’-AMP, respectivamente (Farajnia et al., 2004; Gottlieb & Dwyer, 1983; Hansen et al., 1982). As nucleotidases teriam papel nutricional importante, já que esses parasitos não são capazes de sintetizar purina via síntese de novo (Debrabrant, Gottlieb & Dwyer, 1995). A identificação de genes homólogos dessa enzima em várias espécies de Leishmania confirma que a 3’-nucleotidase é conservada nesse gênero (Debrabant, Gottlieb & Dwyer, 1995), corroborando o seu papel crítico na captação de purinas. A remoção de porção C-terminal da enzima causa sua liberação da membrana plasmática de L. (L.) donovani, demonstrando que esse domínio é responsável por seu ancoramento. Ainda assim, sua atividade enzimática não sofre interferência com a remoção desse domínio e nem com a remoção de suas N-glicosilações (Debrabant, Ghedin & Dwyer, 2000). Como a 3’-nucleotidase não foi detectada em células de mamíferos, ela surge como outra possibilidade de alvo para ação de quimioterápios mais seletivos (Farajnia et al., 2004; Gbenle & Dwyer, 1992).

As enzimas transportadoras de íons Ca2+ 2+ (Ca-ATPase) também foram descritas na membrana de superfície da Leishmania spp. e atuam como uma bomba de Ca 2+. Tais enzimas apresentam alta afinidade com esse íon e sua atividade está estritamente relacionada com a calmodulina, visto que antagonistas da calmodulina bloqueiam completamente sua atividade (Banerjee, Sarkar & Bhaduri, 1999; Benaim et al., 1993). Com duas subunidades (51 kDa e 57 kDa) fortemente associadas à membrana plasmática (Ghosh et al., 1990), conta com um sítio aloestérico ao Mg 2+ capaz de modular sua atividade cinética (Mazumder et al., 1992).

A homeostase da concentração submicromolar de Ca2+ intracelular de L. (V.) braziliensis, L. (L.) mexicana, T. cruzi e Trypanosoma brucei 2+ é mantida pela atividade da Ca-ATPase presente na membrana plasmática desses parasitos (Benaim & Romero, 1990). Também foi proposto que o aumento da atividade da Ca 2 + ATPase presente na membrana plasmática de L. (L.) amazonensis pode determinar a regulação dos níveis de cálcio no interior do fagossomo (Côrte-Real, Santos & Meirelles, 1995).

Enzimas transportadoras de íons Mg2+ também foram descritas na membrana celular de Leishmania spp., sendo denominadas Mg 2+ 2+-ATPases. As Mg-ATPases de L. (L) donovani têm sua atividade modulada pela fluidez da membrana (Dutta et al., 1990). Tais enzimas parecem ter uma função de bomba de extrusão de H +, além de ter um possível papel na acumulação de glicose e potássio no meio intracelular (Dutta et al., 1990; Mukherjee, Mandal & Bhaduri, 2001). Alterações na atividade dessas proteínas podem estar relacionadas com a virulência do parasito, participando da pré-adaptação dos promastigotas para sobrevivência dentro dos macrófagos (Berredo-Pinho et al., 2001; Lu et al., 1997).

As proteinases consistem em outra categoria de proteínas descrita na membrana celular de Leishmania spp. Entre as quatro classes de proteinase descritas nesse parasito (Alves et al., 2005; Silva-Lopez et al., 2004; Bouvier, Etges & Bordier, 1985; Silva-Lopez & Giovanni-De-Simone, 2004), somente as metaloproteinases e as cisteína-proteinases foram localizadas na membrana plasmática de várias espécies de Leishmania, até o momento.

A gp63 é uma das principais glicoproteínas encontradas na superfície de promastigotas de Leishmania spp., com massa molecular aproximada de 63 kDa. É uma zinco-metaloproteinase e está fixada à membrana plasmática por meio de âncora de GPI, evidenciando polimorfismo entre espécies, além de ter uma expressão reduzida em amastigotas (Olivier & Hassani, 2010; Davies et al., 1990; Muskus & Marin, 2002). Nos últimos anos, tem sido demonstrado que a massa molecular das metaloproteinases de Leishmania spp. não é muito homogênea, podendo ser detectadas enzimas desde 50 kDa e mesmo acima de 63 kDa (Alves, Mendonça-Lima & Alves, 2004; Yao et al., 2004; Cuervo et al., 2006).

Não obstante as metaloproteinases terem sido descritas como proteinases de membrana em espécies de Leishmania, estudos recentes indicam que isoformas dessas enzimas têm localização intracelular em L. (L.) mexicana e em L. (L.) chagasi (Weise et al., 2000; Yao et al., 2005). Também uma análise por microscopia confocal sobre a distribuição dessas enzimas em L. (V.) braziliensis demonstrou a existência intracelular de metaloproteinases com domínios homólogos a gp63, localizados próximos à bolsa flagelar (Cuervo et al., 2008).

A importância das metaloproteinases no ciclo biológico da Leishmania spp. ainda é alvo de muitos estudos. As metaloproteinases têm atividade proteolítica sobre numerosos substratos, podendo estar envolvidas na degradação de macromoléculas do hospedeiro. Essas enzimas estão associadas à hidrólise e inativação de imunoglobulinas G (Etges, Bouvier & Bordier, 1986; Mendonça-Lima & Atta, 1992) e têm propriedade de inativar o fator C3b, em C3bi, do complemento (Bogdan & Rollinghoff, 1998; Chaudhuri & Chang, 1988). Essa última atividade pode auxiliar a internalização dos promastigotas no macrófago, tendo como consequência C3bi atuar como opsonina, ligando ao LPG ou à própria gp63 (Bogdan & Rollinghoff, 1998).

Protótipos de vacina oral usando Salmonella typhimurium atenuada contendo o gene da gp63 induziram um fenótipo Th1 de proteção, com linfócitos T CD4+, para infecção por L. (L.) major em camundongos BALB/c (Xu et al., 1995). O êxito de vacinas de cDNa também foi observado no controle da infecção de BALB/c por L. (L.) mexicana com indução de linfócitos T citotóxicos (Ali et al., 2009). Também camundongos BALB/c vacinados com gp63 em lipossomos catiônicos induz proteção contra infecção por L. (L.) donovani (Bhowmick, Ravindran & Ali, 2008). Por sua vez, a vacinação de cães com plasmídeos de DNA codificante da gp63, e outras proteínas de Leishmania, não induziu proteção desses animais contra a infecção experimental por L. (L.) infantum (Rodriguez-Cortes et al., 2007). Mesmo sem uma clara definição do perfil de proteção que a gp63 pode induzir, ainda é plausível o uso dessa proteína na construção de vacinas para as leishmanioses.

Estudos in silico, com sequência da L. (V.) braziliensis, indicaram que regiões do sítio catalítico da metaloproteinases apresentam sequências conservadas e que regiões que codificam os domínios de superfície estão possivelmente envolvidas nas interações parasito-hospedeiro: sítios de adesão a macrófago e epitopos de linfócitos T e B imunodominantes (Victoir et al., 2005).

Além disso, já foi proposta uma função protetora da gp63 contra a ação de tripsina e quimiotripsina do inseto vetor, enzimas cuja expressão aumente após o repasto sanguíneo e, dessa forma, podem interferir no desenvolvimento de parasitos no intestino do inseto. Observou-se que a atividade de tripsina e quimiotripsina acarreta a diminuição da subpopulação de promastigotas com expressão menor de gp63 no intestino do vetor, quando este se encontra repleto de sangue (Pimenta et al., 1997).

Várias cisteína-proteinases (CPs) foram descritas em espécies de Leishmania que causam a forma tegumentar e visceral da doença. Inicialmente essas enzimas foram descritas em amastigotas de L. (L.) mexicana, que são particularmente ricas em CPs, principalmente encontrada em megassomas, com possível papel na virulência no hospedeiro vertebrado (Pupkis & Coombs, 1984; Robertson & Coombs, 1990).

Posteriormente verificou-se que essa enzima poderia ser detectada em outras espécies de Leishmania e que a mesma não estaria exclusivamente relacionada às formas infectivas do parasito (Alves, Marzochi & Giovanni-de-Simone, 1993; Omara-Opyene & Gedamu, 1997). Com a descrição do genoma de L. (L.) major, foi observada a existência de genes que codificam um total de 65 CPs, agrupadas em quatro clãs e 13 famílias (Mottram, Coombs & Alexander, 2004).

A possibilidade de CPs na superfície celular foi inicialmente demonstrada utilizando-se o método de extração com o detergente Triton X-114 (Alves, Marzochi & Giovanni-de-Simone, 1993). Nesse trabalho, os autores demonstraram que promastigotas não infectivos de L. (L.) major apresentam uma proteína hidrofóbica (20 kDa) com atividade enzimática sensível à presença de um inibidor de cisteína-proteinases [L-trans-epoxisuccinil-leucilamida-(4-guanidino) butano]. Estudos posteriores, nos quais foi utilizado soro de coelho antipapaína, uma CP de Caryca papaia, demonstraram a presença de proteínas reconhecidas por esse antissoro na superfície da membrana celular e na bolsa flagelar de L. (L.) amazonensis (Alves et al., 2005; Mottram, Coombs & Alexander, 2004). Hoje, sabe-se que algumas isoformas de CP estão presentes na membrana de superfície de promastigotas de L. (V.) braziliensis associadas a âncoras GPI (Rebello et al., 2009).

A maioria dos estudos sobre a atividade das CPs está centrada nos grupos das enzimas denominadas CPA, CPB e CPC, e cada um deles apresenta características que lhes são próprias: CPA – constituído por enzimas da subfamília das catepsinas L. Esse grupo caracteriza-se por ser codificado por um gene de cópia única e pela ausência de uma longa extensão COOH-terminal antes de seu processamento final (Mottram et al., 1992; Mottram & Coombs, 1998); CPB – constituído por enzimas da subfamília das catepsinas L. Esse grupo caracteriza-se por uma longa extensão COOH-terminal nas formas das enzimas antes de seu processamento final. Além disso, as enzimas CPB são expressas por genes com múltiplas cópias, organizados em sequências em tandem. Essas isoformas apresentam variações entre suas especificidades por substratos e propriedades catalíticas (Brooks et al., 2001); CPC – constituído por enzimas da subfamília das catepsinas B. Esse grupo, de forma similar ao grupo CPA, é codificado por um gene em cópia única e não apresenta uma extensão COOH-terminal como as enzimas CPB (Bart, Coombs & Mottram, 1995).

As CPs de Leishmania spp. podem atuar como moduladores da resposta imune nas infecções tegumentares. Nesse particular, é válido ressaltar que sequências peptídicas da região COOH-terminal das CPBs têm potencial imunorregulador na resposta imune celular para casos humanos de LTA causados por L. (V.) braziliensis (Alves et al., 2001) e no desenvolvimento da infecção experimental murina por L. (L.) amazonensis (Alves et al., 2004, Pereira et al., 2011).

Existem evidências da ação de CPs de Leishmania atuando na regulação do sistema imune do hospedeiro, tanto induzindo este a apresentar uma resposta tipo Th2 quanto inibindo uma resposta do tipo Th1. As CPs de L. (L.) mexicana e de L. (L.) amazonesis são capazes inibir a apresentação de antígenos pela degradação da molécula do complexo principal de histocompatibilidade classe II no vacúolo parasitóforo do hospedeiro (Souza Leão et al., 1995).

A geração de mutantes deficientes nos genes das CPB (Δcpb) permitiu a obtenção de informações sobre a importância dessas CPs na interação parasito-hospedeiro. Mutantes de L. (L.) mexicana Δcpb apresentaram virulência reduzida e pouca capacidade de promover lesões em camundongos BALB/c (Alexander, Coombs & Mottram, 1998) e somente a reinserção de múltiplos genes CPB nesses mutantes por um cosmídeo foi capaz de efetivamente restaurar sua virulência, sugerindo que tais genes têm funções complementares (Denise et al., 2003).

Além disso, existem indícios de que a enzima CPB de L. (L.) mexicana ativa é capaz de clivar os receptores de IL-2 e de IgE e de induzir à expressão de IL-4 em camundongos, promovendo a resposta Th2. Camundongos infectados com parasitos mutantes Δcpb foram capazes de apresentar uma resposta do tipo Th1 e, dessa forma, debelar a infecção (Pollock et al., 2003). Também já foi descrita a capacidade de diferentes espécies de Leishmania, inclusive da L. (L.) mexicana, de inibir a produção de IL-12 em macrófagos e células dentríticas (Weinheber et al., 1998). Esse processo é, ao menos em parte, dependente da CPB, uma vez que parasitos do tipo selvagem contam com uma capacidade maior de inibir a produção de IL-12 do que mutantes Δcpb, e inibidores de CPB são capazes de impedir essa ação dos parasitos. É possível que tal capacidade seja resultado da clivagem proteolítica tanto do fator de transcrição kappa B do hospedeiro quanto de seu inibidor IκB pela CPB (Cameron et al., 2004).

Não obstante homólogos de CPB terem sido detectados na membrana celular de promastigotas de L. (V.) braziliensis (Rebello et al., 2009), assim como outras cisteína-proteinases em L. (L.) amazonensis (Alves et al., 2000), essas enzimas estão presentes nos grandes lisossomos do estágio amastigota e também podem ser liberadas na matriz extracelular, o que pode facilitar alguns de seus efeitos (Mottram, Brooks & Coombs, 1998).

Proteínas que ligam à heparina (PLHs) também foram descritas na superfície de Leishmania spp. (Butcher et al., 1990; Azevedo-Pereira et al., 2007; Mukhopadhyay et al., 1989) e outros tripanossomatídeos (Kock et al., 1997; Ortega-Barria & Pereira, 1991). A maior parte dos estudos com PLHs de Leishmania spp. tem sido desenvolvida com L. (L.) donovani, L. (L.) major e L. (L.) amazonensis, e só recentemente foi proposto o estudo dessa proteína em L. (V.) braziliensis. Nesta espécie, a PLH sinalizou uma possível participação na interação com proteínas do intestino de Lu. intermedia e de Lu. Whitmani (Azevedo-Pereira et al., 2007).

Nos parasitos nos quais as PLHs foram estudadas, verificou-se que essas moléculas agem como proteínas de adesão e podem promover a interiorização dos mesmos com as células hospedeiras. Experimentos realizados com promastigotas de L. (L.) donovani demonstraram que em torno de 860 mil moléculas de PLHs são encontradas na superfície do parasito, mais precisamente na porção flagelar dos promastigotas, e que por meio de ligação com heparina pudesse induzir a inibição da atividade de PKCs sobre a superfície celular do parasito (Butcher et al., 1990; Mukhopadhyay et al., 1989).

As PLHs estariam relacionadas às formas infectivas de L. (L.) donovani, já que estas predominam em promastigotas de fase estacionária de cultivo e que sucessivas passagens desses parasitos em meio de cultivo levam à perda da capacidade de os mesmos se ligarem à heparina (Kock et al., 1997; Butcher et al., 1992). Amastigotas de L. (L.) amazonensis e de L. (L.) major têm maior capacidade de se ligar à heparina do que promastigotas das mesmas espécies (Volf, Svobodova & Dvorakova, 2001). Além disso, glicosaminoglicanos como heparina influenciam o desenvolvimento de L. (L.) major no intestino do inseto vetor, aumentando a carga parasitária dos insetos experimentalmente infectados.

Uma recente discussão alerta para o fato de que as PLHs, assim como o LPG, estariam participando dos fenômenos moleculares de ligação entre promastigotas de L. (V.) braziliensis e o trato digestório de espécies de Lutzomyia que atuam como vetores na leishmaniose tegumentar americana (Alves, Côrtes & Brazil, 2010). Assim, outros componentes da superfície dos promastigotas de L. (V.) braziliensis, como as proteínas, podem estar envolvidos nas etapas de ligação desse parasito ao intestino do vetor. A habilidade de os promastigotas estarem aderidos às microvilosidades do trato digestório dos flebotomíneos é um passo essencial para manutenção do ciclo de vida do parasito, sendo um fator que distingue parasitos infectivos dos não infectivos.

Demonstrou-se, em ensaios in vitro, que a heparina e o sulfato de heparan são os principais GAGs envolvidos no fenômeno de inibição da ligação de promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. às células hospedeiras (Butcher et al., 1992; Volf, Svobodova & Dvorakova et al., 2001). Curiosamente, também demonstrou-se que a heparina pode aumentar a ligação de promastigotas aos macrófagos (Butcher et al., 1992). Tal fato é um indicativo de que a heparina poderia influenciar duas atividades distintas sobre a infecção celular por Leishmania spp., sendo também uma sugestão para heterogeneidade funcional das proteínas que ligam a heparina presente na superfície do parasito.

Embora certas proteínas e proteinases de Leishmania spp. sejam ancoradas por GPI e têm ações definidas no ciclo de vida do parasito, ressalta-se que nem todas as proteínas ancoradas por GPI são essenciais ao crescimento ou infectividade no hospedeiro vertebrado. Mutantes ΔGPI8 de L. (L.) mexicana foram capazes de promover a infecção em camundongos (Hilley et al., 2000). Esses mutantes não têm o gene GPI8 que codifica a enzima transamidase, a qual é responsável pela adição da porção proteica à ancora de GPI.

 

Conclusões

Os parasitos do gênero Leishmania apresentam uma série de peculiaridades adaptativas nas diferentes fases de seu ciclo biológico. Como as superfícies celulares dos promastigotas e amastigotas estão em contato direto com tecidos e células dos hospedeiros, é razoável que a organização destas seja uma das estratégias para aumentar as chances de sucesso do parasitismo.

Ao fazer uma síntese do conhecimento atual sobre o papel funcional dos componentes do parasito é possível indicar o envolvimento desses componentes nos eventos iniciais da dinâmica de interação finas e vitais que se estabelecem entre os protozoários

Leishmania e os seus hospedeiros (Tabela 1). Assim, quando os promastigotas ou amastigotas mudam de hospedeiro ocorre ativação de receptores presentes na superfície celular, que sinalizam para transformação do parasito (receptor de adenilciclase). Nessa mudança de hospedeiros, permanecem ativas nos parasitos enzimas que favorecem o equilíbrio e a adaptação às condições iônicas (Ca 2+ 2+ e MgATPases) e a captação de nutrientes essenciais (3’-nucleotidase e 5’-nucleotidase).

Tabela 1 – Principais componentes da membrana de superfície

das espécies de Leishmania e suas atuações nos hospedeiros

Componentes Função

Hospedeiro Hospedeiro Vertebrado Invertebrado

LPG Ligante de Fixa

macrófagos; promastigotas Inibe a atividade da procíclicos ao PKC de macrófagos; epitélio Em metacíclicos: (a) intestinal inibe a formação do

complexo de ataque

à membrana; e (b)

ativa complemento

proporcionando a

ligação ao

macrófago via C3bi;

Atua na resposta

imune inata via

células NK e célula

dendríticas por meio

de receptor toll-like 2 e pelo aumento de

INF-γ e TNF-α

GIPLs Inibe síntese de FNd

óxido nítrico em

macrófagos;

Inibe atividade de

PKC;

Influencia a taxa de

infecção de

macrófagos;

Proteínas e

enzimas:

KMP-11 Imunomodulação FNd

HASP Imunomodulação FNd

Amastina Invasão e FNd

multiplicação

intracelular

Receptor de Induz a mudança de Induz à adenilciclase estágio de mudança de

promastigota a estágio amastigota amastigota a

promastigota

gp46/M-2 FNd FNd

PPG mPPG – ligante de mPPG –

receptores de ligante de

macrófagos células do

tubo

digestório

aPPG – contribuir FNd para manutenção do

vacúolo parasitóforo

aPPG – ativa FNd complemento via

proteína ligadora de

manose

FNd fPPG –

dificulta

ingestão de

alimento do

flebótomo

AcPs MAcPs/SAcPs – Idem

interferem na

produção de

metabólitos

oxidativos (H O , 2 2 OH- 2-, O)

3’-nucleotidase e Papel nutricional – Idem 5’-nucleotidase hidrólise de

nucleotídeos a

ácidos nucleicos (3’-

AMP e 5’-AMP)

Ca2+- ATPase Manutenção dos Manutenção

níveis de Ca2+ dos níveis de

citoplasmático e do 2+ Ca fagossomo citoplasmático

Mg2+- ATPases Função de bomba FNd

de extrusão de H+ Acumulação de

glicose e potássio

Pré-adaptação dos

promastigotas no

macrófago

Metaloproteinases Hidrólise e Protege os

inativação de promastigotas

imunoglobulinas G; da ação da Inativação do fator tripsina e C3b em C3bi do quimiotripsina

complemento; do intestino

Adesão do inseto; interiorização nos

macrófagos

Cisteína- Imunorregulador na FNd proteinases leishmaniose

cutânea: com

atividade enzimática

sobre componentes

do sistema imune e

pela atuação da

região C-terminal na

indução resposta

Th2

PLH Ligação dos Ligação dos

promastigotas aos promastigotas macrófagos ao trato

digestório de

flebótomos

Obs: FNd (função não determinada).

A superfície celular desses protozoários é capaz de controlar atividades específicas para viverem em um ou outro hospedeiro. Até o presente momento, a maioria dos componentes de superfície dos parasitos, já descritos anteriormente, tem o papel biológico relacionado ao hospedeiro mamífero, enquanto apenas um escasso número voltado à interação com o inseto vetor foi estudado. Nesse cenário, o LPG é o componente de superfície mais diversificado em funções direcionadas à manutenção do ciclo de vida do parasito, com atuação no vertebrado (influenciando na resposta imune inata e adquirida e subvertendo as funções do macrófago) e no inseto vetor (realizando a fixação do promastigota ao trato digestório).

No hospedeiro vertebrado, o parasito tem a capacidade de controlar ou subverter a ação de diversos componentes do sistema imune. A superfície celular reúne fatores como proteínas, enzimas e/ou glicoconjugados voltados à imunomodulação da resposta imune do hospedeiro vertebrado, favorecendo assim a sobrevivência do parasito.

Também as proteínas de superfície, como metaloproteinases e proteínas que ligam à heparina, têm ações no vertebrado (nas funções do macrófago), mas somente as metaloproteinases atuam no inseto vetor (protege os promastigotas da ação de proteinase do inseto); e é nítido o papel das cisteína-proteinases na resposta imune da leishmaniose cutânea do hospedeiro vertebrado, como enzima e como indutor de resposta imune celular.

Mesmo com os conhecimentos aqui reunidos sobre a os componentes de Leishmania spp., para uma real compreensão dos fenômenos de interação entre os parasitos e seus hospedeiros faz-se necessário levar em consideração a ação de todos os componentes de superfície – aqueles já descritos e os que ainda estão em estudo, uma vez que uma categorização artificial da importância destes pode acarretar uma interpretação incorreta de tais fenômenos.

 

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