26. Abordagens Genômicas, Transcriptômicas e Proteômicas Aplicadas ao Estudo de Leishmania spp.

26. Abordagens genômicas,

transcriptômicas e proteômicas

aplicadas ao estudo de Leishmania spp.

Marcelo Alves-Ferreira, Ana Carolina Ramos Guimarães, Patricia Cuervo, José Batista de Jesus

O desenvolvimento de tecnologias de alto desempenho a partir do fim do século XX,

tais como o sequenciamento automático de DNA, análises por microarranjo e análise e identificação de proteínas (genômica, transcriptômica e proteômica) vem produzindo uma grande quantidade de dados, que por sua vez exige a aplicação de abordagens mais complexas para a análise da informação gerada. As tecnologias para a descoberta de novos genes, estudos de expressão e análise funcional foram aplicados a uma vasta gama de organismos, incluindo muitos parasitos humanos. Em muitos casos, os dados estão livremente disponíveis pela Internet em bases de dados especializadas, as quais são continuamente atualizadas mediante novos dados experimentais (Hertz-Fowler & Hall, 2004). Com base no desenvolvimento dessas novas tecnologias de análise em larga escala, o conhecimento molecular das diferentes espécies de Leishmania teve um grande avanço. Dentro desse contexto, este capítulo revisa a produção de conhecimentos sobre esses protozoários patogênicos em três abordagens: genômica, transcriptômica e proteômica.

Genômica

Durante os anos de 1993 e 1994, países desenvolvidos e em desenvolvimento,

incluindo o Brasil, lideraram a formação de consórcios para iniciar uma série de projetos com o objetivo de mapear e sequenciar os genomas de diversos parasitos. Foi nessa época que se iniciou o programa de sequenciamento de três organismos da ordem Kinetoplastida: Leishmania major, Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei. Com a publicação dos genomas desses parasitos, o projeto foi denominado Tritryps (Degrave et al., 2001; El-Sayed et al., 2005).

O gênero Leishmania foi representado nessa primeira iniciativa pela espécie L. major

cepa Friedlin (Ivens et al., 2005). Após alguns anos, outras espécies desse gênero, como L. infantum, L. braziliensis e L. mexicana, também tiveram seus genomas decifrados. Uma das informações extraídas desses estudos revelou que espécies de Leishmania do Velho Mundo, tais como L. donovani e L. major, têm 36 pares de cromossomos, enquanto as espécies do Novo Mundo apresentam 34 ou 35 pares. No caso de L. mexicana o cromossomo 8 está fusionado com o 29 e o cromossoma 20 com o 36, enquanto em L. braziliensis o cromossomo 20 está fusionado com o 34.

Projeto genoma de Leishmania major cepa Friedlin

O genoma de L. major (cepa Friedlin) foi o primeiro a ser sequenciado e serviu como

modelo para análises genômicas posteriores. Observou-se que esse genoma tem 32.816.678 pares de bases (pb) de tamanho (versão 5.2) e seu cariótipo é representado por 36 cromossomos, com uma única sequência contígua (contig) gerada para cada cromossomo. O conteúdo total de G+C é de 59,7% e o percentual de

sequências codificadoras é de 47,9%, como resumido na Tabela 1. Os dados de sequência foram obtidos por meio de diferentes abordagens experimentais realizadas em paralelo, como sequenciamento de cosmídeos, shotgun e/ou sequenciamento e montagem de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Degrave et al., 2001).

Tabela 1 – Características do genoma de L. major

Parâmetro Número

Tamanho (pb) 32.816.678

Conteúdo G+C (%) 59,7

Cromossomos 36

Sequências contíguas 36

Percentual codificador 47,9

Fonte: adaptado de Ivens et al., 2005.

Análises computacionais identificaram 911 genes de RNA, 39 pseudogenes e 8.272

genes codificadores de proteínas, dos quais 36% têm uma função atribuída (Tabela 2). A maioria dos genes de L. major contém ortólogos nos genomas de T. brucei e T. cruzi, sendo 74 grupos gênicos compartilhados exclusivamente com T. brucei, 482 grupos compartilhados com T. cruzi e 6.158 grupos gênicos compartilhados com os dois organismos. Apenas 910 dos genes identificados em L. major são específicos desse

organismo (Figura 1 e Tabela 3). A maioria das proteínas espécieespecíficas faz parte de famílias de proteínas de antígenos de superfície e podem estar relacionadas com as diferentes estratégias de sobrevivência e escape do sistema imune do hospedeiro. Alguns genes específicos de Leishmania são responsáveis pelas principais diferenças metabólicas entre L. major e os outros Tritryps, como por exemplo, algumas peptidases, transportadores e componentes da biossíntese de glicoconjugados; porém, a maior parte dos genes ainda não teve uma função atribuída, sendo denominados como hipotéticos. Grande parte dos genes cuja função ainda não foi assinalada estaria, provavelmente, envolvida em processos únicos dos tripanossomatídeos. Genes altamente variáveis que escapam de uma inferência de função baseada em homologia, ou seja, similaridade com outros genes já anotados, também podem fazer parte dos genes sem função atribuída. Além disso, as estruturas das regiões teloméricas são heterogêneas e bastante distintas quando comparadas com as de T. brucei e T. cruzi (El-Sayed et al., 2005).

Tabela 2 – Características dos genes codificadores de proteínas no genoma de L.

major

Parâmetro Número

Genes 8.298

Genes com função atribuída (%) 36

Pseudogenes 39

Média do tamanho das CDS (pb) 1.901

Conteúdo G+C (%) 62,5

Média do tamanho da região intergênica* (pb) 2.045

Conteúdo G+C da região intergênica* (%) 57,3

*A região intergênica compreende a região entre as sequências codificadoras de

proteínas.

Fonte: adaptado de Ivens et al., 2005.

Figura 1 – Diagrama de Venn representando os grupos gênicos compartilhados pelos

Tritryps (LMA = L. major, TBR = T. brucei e TCR = T. cruzi)

 

Fonte: adaptado de El-Sayed et al., 2005.

Tabela 3 – Comparação das características gerais dos genomas dos Tritryps

Parâmetro L. T. cruzi T.

major brucei

Tamanho do genoma haploide (Mpb) b ~33 55 25

Número de cromossomos (por genoma b 36 ~28 11 haploide)

Número de cromossomos (por genoma a c 8.311 ~12.000 9.068 haploide)

Total de regiões com blocos de sintenia 30,7 NI 19,9 (Mpb)

a Incluindo 34 pseudogenes.

b Aproximado.

c Incluindo 904 pseudogenes.

Fonte: adaptado de El-Sayed et al., 2005.

Em relação aos genes que codificam para RNAs, identificaram-se os diferentes tipos

de RNA no genoma de L. major: RNA transportador (tRNA), RNA ribossomal (rRNA), RNA guia de Splice (slRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA) e RNA de partícula de reconhecimento de sinal (srpRNA), como

demonstrado na Tabela 4. Os Tritryps aparentemente codificam um repertório semelhante de genes de RNA, porém, a organização em L. major difere dos outros dois tripanossomatídeos. Os genes que codificam para as subunidades 28S, 18S e 5,8S do RNA ribossomal de L. major ocorrem em um único arranjo em tandem, enquanto nos outros Tritryp aparecem em loci dispersos em diferentes cromossomos. Em contrapartida, os genes que codificam para as subunidades 5S do RNA ribossomal são encontrados em 11 diferentes loci em vários cromossomos de L. major, e como um arranjo único em T. brucei e T. cruzi. Dos anticódons possíveis, os genomas dos Tritryps são capazes de codificar os mesmos 45 tipos; a diferença está no número de cópias e na localização dentro do genoma (Ivens et al., 2005).

Tabela 4 – Características dos genes codificadores de RNA

Parâmetro Número

RNA transportador (tRNA) 83

RNA ribossomal (rRNA)* 63

RNA guia de Splice (slRNA)* 63

RNA nuclear pequeno (snRNA) 6

RNA nucleolar pequeno (snoRNA) 695

RNA partícula de reconhecimento de sinal (srpRNA) 1

*Valores aproximados.

Fonte: adaptado de Ivens et al., 2005.

A propósito do conteúdo de genes e arquitetura do genoma, os Tritryps apresentam

uma conservação de cerca de 6.200 genes em grandes grupos sintênicos. A comparação dos genomas dos três organismos fornece indícios de uma ancestralidade

comum (Tabela 5). Os genomas de L. major e T. brucei têm 110 blocos de sintenia, como descrito em El-Sayed e colaboradores (2005). Mesmo com a grande sintenia existente entre esses organismos, é possível observar inserções, deleções e substituições que podem resultar em diferenças fisiológicas e bioquímicas entre tais parasitos (Degrave et al., 2001; El-Sayed et al., 2005).

Tabela 5 – Comparação das características gerais dos genomas dos Tritryps

Parâmetro L. L. L.

major infantum braziliensis

Tamanho do genoma haploide (Mpb) 32,8 32,1 32,0

Número de cromossomos (por genoma 36 36 35 haploide)

Conteúdo G+C (%) 59,7 59,3 60,4

Número de genes 8.298 8.154 8.153

Número de pseudogenes 97 41 161

Região codificadora (%) 48 44 48,5

Fonte: adaptado de Smith, Peacock & Cruz, 2007.

Os genomas de T. brucei e T.cruzi contêm elementos transponíveis capazes de se

reintegrar no genoma desses organismos. Em contraste, a análise de várias espécies de Leishmania indica uma falta de retroelementos ativos. Nos genomas de L. major e de L. infantum foi possível detectar vestígios de retrotransposons. Porém, detectou-se retrotransposons ativos no genoma de L. braziliensis.

Genômica comparativa entre L. major, L. infantum e L. braziliensis

As sequências dos genomas L. infantum e L. braziliensis foram obtidas por meio de

sequenciamento usando a abordagem de shotgun, com uma cobertura de cinco e seis vezes, respectivamente. Realizou-se uma análise comparativa a fim de alinhar as sequências desses organismos contra as sequências contíguas de referência de L. major (Smith, Peacock & Cruz, 2007). Embora essas três espécies tenham um conteúdo nucleotídico semelhante (cerca de 33 Mb), L. braziliensis é geneticamente mais distinta, como já havia sido observado na diferença do número de cromossomos. A conservação da sintenia, revelada por análises de genômica comparativa entre essas três espécies, sugere que o genoma do Leishmania é altamente estável e não tem sofrido grandes rearranjos durante a especiação (Smith, Peacock & Cruz, 2007).

A comparação entre os genes ortólogos dessas espécies revelou um alto grau de

conservação no conteúdo e ordem gênica, mesmo com algumas diferenças no número de cópias de alguns genes. O genoma mais divergente (L. braziliensis) apresenta somente 47 genes que não foram identificados nas outras duas espécies, enquanto L.

infantum possui 27 genes específicos e L. major apenas cinco (Figura 2).

Figura 2 – Diagrama de Venn representando as proteínas preditas específicas e

compartilhadas por três espécies de Leishmania (LMA = L. major, LBR = L. braziliensis

e LIN = L. infantum)

 

Fonte: adaptado de Smith, Peacock & Cruz, 2007.

Em uma comparação entre os genomas dos Tritryps, observa-se que a maioria dos

genes específicos para cada uma das espécies se localiza nas extremidades dos grupos gênicos ou nas regiões subteloméricas dos cromossomos. Entretanto, a comparação entre as três espécies de Leishmania revelou que a variação gênica não é restrita a essas regiões, estando bem distribuída por todo o genoma. Eventos de inserção, deleção e rearranjos nas sequências gênicas são responsáveis por essa variação, sendo a perda de função por degeneração gênica a mais abundante, correspondendo a cerca de 80% do total das diferenças entre as espécies. A aquisição de novos genes pode estar relacionada a mecanismos para a adaptação ambiental e para promover a sobrevivência do organismo; adaptações similares relacionadas ao estresse ou a outros estímulos podem levar ao ressurgimento de algumas funções em genes cujas sequências anteriormente foram identificadas como pseudogenes (Smith, Peacock & Cruz, 2007).

Pós-genômica

O conhecimento gerado com o sequenciamento dos genomas de diferentes espécies

de Leishmania auxilia no entendimento global do fenótipo da doença. Os genes que diferem entre as três espécies são bons candidatos para uma análise funcional para determinar seu papel no estabelecimento da infecção. Contudo, a maioria dos genes espécieespecíficos codifica proteínas com pouca ou nenhuma similaridade com outras sequências de eucariotos, dificultando a inferência de função. Assim, torna-se necessária a utilização de outras metodologias, sejam elas computacionais ou não, combinadas com a análise de fatores genéticos, bioquímicos e imunológicos a fim de determinar suas funções biológicas.

Mineração de dados nos genomas de Leishmania

O termo ‘mineração de dados’, uma tradução do termo em inglês data mining, pode

ser definido como um processo qualquer em que a informação útil é extraída tendo como base um grande conjunto de dados. No contexto de um projeto genoma, várias etapas envolvem a mineração de dados. Entre elas, pode-se incluir: a detecção dos ‘sinais característicos’ presentes nas sequências que estariam relacionadas com as diferentes ‘partes’ que compõem os genomas, como regiões regulatórias, regiões codificantes, elementos de transposição, sítios de ligação, entre outros. Após a detecção, são definidas as funções de cada região. As ferramentas mais utilizadas na mineração de dados envolvem comparação entre sequências em bancos de dados, sejam eles públicos ou privados (Berriman, 2004).

Várias iniciativas foram empreendidas com o intuito de reunir os dados provenientes

dos projetos genomas de diversos organismos. Atualmente, o EuPathDB – Eukaryotic

Pathogen Database (<http://EuPathDB.org>) – é um banco de dados integrado que abrange os patógenos eucarióticos dos gêneros Cryptosporidium, Giardia, Leishmania, Neospora, Plasmodium, Toxoplasma, Trichomonas e Trypanosoma. Embora cada um desses grupos conte com um banco de dados específico construído sobre a mesma infraestrutura, o EuPathDB é um portal que oferece um ponto de entrada para todos os recursos contidos em cada um desses bancos, com a conveniência de proporcionar buscas baseadas em ontologias preestabelecidas. Além disso, a interface amigável permite ao usuário uma navegação interativa, auxiliando o entendimento dos resultados de cada busca (Aurrecoechea et al., 2010).

Transcriptômica

Transcriptômica consiste no conjunto de análises da expressão gênica – por

intermédio do estudo qualitativo e quantitativo de diferentes tipos de RNA – de um determinado organismo sob uma condição específica ou na comparação de diferentes condições como, por exemplo, cepas resistentes e não resistentes a determinado fármaco. Ao contrário do genoma que apresenta características comuns nas diferentes formas evolutivas do ciclo de vida, o transcriptoma e o proteoma de parasitos protozoários, como Leishmania spp., apresentam diferenças significativas entre os distintos estágios (amastigotas, promastigotas). Tais diferenças estão associadas à adaptação e sobrevivência dos parasitos aos distintos ambientes que encontram nos hospedeiros vertebrados e invertebrados. Essas adaptações podem envolver regulações específicas, como a expressão de proteínas que permitem escapar da resposta imune do hospedeiro vertebrado ou que evitem a ação de enzimas digestivas do vetor (Peters & Sacks, 2006).

O conjunto de mRNA transcrito num determinado momento, no parasito, afeta

diretamente os níveis de proteínas expressas por essa célula. No caso de Leishmania, assim como nos outros Kinetoplastida, ocorrem os fenômenos de transcrição policistrônica e de processamento de mRNA através do sistema de trans-splicing, os quais aumentam a complexidade dos transcritos gerados e, como consequência, dificultam a análise via mRNA.

Em Leishmania spp., análises transcriptômicas vinham sendo feitas desde antes da

publicação dos genomas (Saxena et al., 2003; Akopyants et al., 2004; Almeida et al., 2004) por meio de duas metodologias: amplificação por PCR de fragmentos randômicos de DNA, seguido de fixação dos produtos em lâminas de vidro (Saxena et al., 2003; Akopyants et al., 2004), cobrindo aproximadamente 40% do genoma; e amplificação de um número limitado de fragmentos randômicos e de fragmentos específicos de cDNA, produzidos a partir de bibliotecas de formas amastigotas e promastigotas, possibilitando assim a identificação de genes expressos de maneira estágio-específica (Almeida et al., 2004). Após a publicação do genoma completo de L. major realizou-se um estudo que possibilitou a identificação de 97,5% dos genes, utilizando uma técnica de microarranjo de oligonucleotídeo de alta densidade, via síntese por fotolitografia (Holzer, McMaster & Forney, 2006; Leifso et al., 2007). Posteriormente, em razão do alto grau de similaridade genômica, as lâminas de microarranjo produzidas para L. major foram utilizadas para conduzir estudos em L. mexicana (Holzer, McMaster & Forney, 2006) e L. donovani (Saxena et al., 2007).

Em distintas espécies de Leishmania, ensaios de microarranjo dirigidos para o estudo

de vias específicas têm sido utilizados visando a análise do perfil de expressão gênica em diferentes formas evolutivas (Leifso et al., 2007; Saxena et al., 2007; Quijada, Soto & Requena, 2005; McNicoll et al., 2006) e no estudo de genes envolvidos em

resistência a fármacos (Guimond et al., 2003; Leprohon et al., 2006). A Tabela 6 resume os estudos em transcriptômica utilizando análise por microarranjo nas diferentes espécies de Leishmania (Cohen-Freue et al., 2007). Uma comparação da expressão diferencial de genes em amastigotas e promastigotas de L. major e L. mexicana permitiu a identificação de genes expressos em comum apenas nas formas

promastigotas das duas espécies (Cohen-Freue et al., 2007) (Figura 3).

Tabela 6 – Análise por microarranjo da expressão de mRNA* codificados pelos

genomas de diferentes espécies de Leishmania

Espécies Tipo de Número Genes Comparação da expressão diferencial [referência] microarranjo de de únicos de mRNA entre promastigotas

L. major sondas (cobertura prociclicos (% do total de genes nos

do arrays) e as outras formas evolutivas

genoma) Promastigotas Amastigotas Amastigotas

metacíclicos axênicos de lesão

L. major DNA genômico 10.479 (~80%) 5,1 (Saxena et

al., 2003)

L. major DNA genômico 10.479 (~80%) 0,8 0,9 (Akopyants

et al.,

2004)

L. major cDNA 2.734 1.843 7,0 13,0 (Almeida (22%) et al.,

2004)

L. DNA genômico 10.468 3.868 5,5 donovani (46,2%) (Saxena et

al., 2007)

L. Oligonucleotídeo 89.760 8.160 0,2 3,5 mexicana com alta (97,5%) (Holzer et densidade

al., 2006)

L. major Oligonucleotídeo 89.760 8.160 2,9 (Leifso et com alta (97,5%) al., 2007) densidade

* O percentual dos genes foi calculado tendo como base um total de 8.370 genes (L.

major GeneDB Dataset version 5.1; (<www.genedb.org.>).

Fonte: adaptado de Cohen-Freue et al., 2007.

Figura 3 – Comparação do padrão de expressão gênica diferencial entre L. major e L.

mexicana

 

Os diagramas de Venn mostram os números de genes expressos em cada espécie e

na intercessão dos círculos estão os genes compartilhados entre essas espécies. Em

‘a’ estão representados os genes totais identificados; em ‘b’ estão representados os

genes preferencialmente expressos em promastigotas; e em ‘c’ os genes expressos em

amastigotas.

Fonte: adaptado de Cohen-Freue et al., 2007.

Não obstante existam mecanismos de regulação dos níveis de mRNA, tanto nas

distintas formas evolutivas como nas distintas fases de crescimento (Brooks et al., 2001), o perfil do transcriptoma descrito em diferentes espécies (L. major, L. mexicana e L. donovani) demonstrou ser bastante estável (Leifso et al., 2007; Saxena et al., 2007; Duncan et al., 2004). A maioria dos transcritos regulados nos estágios de vida de Leishmania corresponde a proteínas de superfície ou proteínas altamente abundantes, enquanto as enzimas envolvidas no metabolismo central de carbono estão sub-representadas. Uma análise de dados de transcriptoma e proteoma de L. major e L. infantum mostrou que o genoma desses parasitos é constitutivamente expresso em amastigotas e promastigotas (Leifso et al., 2007; McConville et al., 2007). Entretanto, as limitações experimentais das técnicas usadas nessa análise podem dificultar a detecção e identificação das proteínas expressas em baixas concentrações. Dados obtidos utilizando pré-fracionamento com sulfato de amônio de extratos de culturas de L. infantum, utilizando-se amastigotas e promastigotas, revelaram um grande número de modificações nos níveis de expressão estágio-específicos, assim como em relação a modificações pós-traducionais em proteínas de amastigotas (McNicoll et al., 2006).

Recentemente publicaram-se novos trabalhos visando ao estudo da transcriptômica

em Leishmania spp., os quais utilizaram diferentes tecnologias. Adaui e colaboradores realizaram uma comparação entre as diferentes formas evolutivas de diferentes isolados clínicos de L. braziliensis pela técnica de PCR em tempo real, utilizando 12 enzimas envolvidas em diferentes funções como no metabolismo redox, e demonstraram que ocorrem modulações diferenciadas tanto entre os diferentes genes quanto entre os isolados clínicos (Adaui et al., 2011). Por sua vez, Alcolea e colaboradores utilizaram a tecnologia de hibridização por microarranjo em L. infantum, porém cobrindo o genoma inteiro, demonstrando alguns dados que corroboram com análises anteriores no que se refere à baixa regulação da expressão entre as formas evolutivas. Em inúmeros genes codificantes para proteínas sem função definida foi preponderante o aumento na expressão dos mesmos em amastigotas e, também, foi demonstrada uma diminuição de 68% na taxa de redução da expressão nessa forma evolutiva (Alcolea et al., 2010).

Transcriptômica da interação parasito-vetor

A interação de Leishmania com o vetor determina uma série de modificações

bioquímicas e metabólicas, que acarreta mudanças significativas do arsenal proteico desses microrganismos. Tais adaptações têm sido analisadas não só por técnicas de microarranjo, mas também por PCR semiquantitativo, PCR em tempo real e sequenciamento de ESTs (Ramalho-Ortigão et al., 2007; Jochim et al., 2008; Pitaluga et al., 2009).

Demonstrou-se que uma série de proteínas associadas às microvilosidades do trato

digestivo do vetor Phlebotomus papatasi, tais como a PpMVP1 e a PpMVP2, assim como as peritrofinas 1 e 2 (PpPer1 e PpPer2) e a quimotripsina PpChym2, apesar de serem expressas somente após o repasto sanguíneo, apresentaram uma significativa redução dos seus transcritos quando da presença de L. major no sangue ingerido (Ramalho-Ortigão, 2007). Em outro sistema, utilizando o vetor L. longipalpis e L. infantum, foi possível observar também uma redução na expressão de quatro proteínas associadas às microvilosidades (LuloMVP1, 2, 4 e 5), da quimotripsina LuloChym1A, da carboxipeptidase LuloCpepA1, dentre outras. Entretanto, descreveu-se um aumento na expressão de proteínas, tais como da proteína tipo peritrofina LuloPer1, da proteína tipo tripsina Lltryp2 e de uma proteína desconhecida (Jochim et al., 2008).

Outro estudo sequenciou 2.520 ESTs, partindo de bibliotecas de cDNA de intestino

médio de Lu. longipalpis, alimentada na ausência ou presença de L. infantum (Pitaluga et al., 2009), tendo-se observado um aumento significativo no percentual de transcritos expressos na biblioteca do vetor infectado. Os transcritos com expressão aumentada estavam correlacionados à defesa/estresse/oxidação (7% contra 4% obtido da biblioteca não infectada), proteínas ribossomais (16% contra 13%), proteínas envolvidas com a mobilização intracelular/citoesqueleto/adesão celular (4% contra 1%) e à transdução de sinais (5% contra 2%). Os dados apresentados nesses dois últimos trabalhos, que utilizaram diferentes estratégias/metodologias de análises, evidenciam a importância de se estudar especificamente os diferentes sistemas Leishmania-vetor, para um melhor entendimento da epidemiologia e da dinâmica da doença.

Proteômica

A análise global da expressão proteica em parasitos do gênero Leishmania vem

destinando-se a identificar e quantificar proteínas específicas expressas em estágios do ciclo biológico, proteínas enriquecidas das distintas frações celulares ou organelas e proteínas envolvidas na imunoestimulação, entre outros. Tais padrões de expressão proteica têm contribuído para a anotação funcional de proteínas e podem permitir o desenho de vacinas e o desenvolvimento de novos medicamentos que tenham como alvo fatores específicos de cada estágio de vida.

Os primeiros estudos em proteômica de Leishmania spp. basearam-se no uso da

eletroforese bidimensional (2DE), para detectar proteínas antigênicas presentes em extratos celulares (Handman, Mitchell & Goding, 1981) e para diferenciar, por meio dos seus padrões de expressão proteica, distintas espécies responsáveis pela LTA (Saravia et al., 1984). Contudo, tais estudos mostraram-se limitados em virtude da impossibilidade de se identificar em larga escala as proteínas de interesse.

A modernização da tecnologia da 2DE e o desenvolvimento de espectrometria de

massas (MS), para identificação de proteínas, impulsionaram os estudos proteômicos nesses parasitos. Dessa forma, mapas proteômicos têm sido descritos para várias espécies de Leishmania do Velho e do Novo Mundo (Thiel & Bruchhaus, 2001; Acestor et al., 2002; El Fakhry, Ouellette & Papadopoulou, 2002; Gongora et al., 2003; Bente et al., 2003; Drummelsmith et al., 2003; Nugent et al., 2004; Walker et al., 2006a; Brobey et al., 2006; Brobey & Soong, 2007; Cuervo et al., 2007).

As estratégias usadas para a análise global de proteínas nesses parasitos envolvem

a separação por eletroforese em uma e em duas dimensões, seguida pela detecção, excisão e digestão de bandas ou spots proteicos para subsequente identificação pela combinação do perfil de massas peptídicas (PMF, Peptide Mass Fingerprinting) ou pelas massas dos fragmentos peptídicos obtidos por MS em tandem, usando como fontes de ionização electropulverização (ESI, electrospray ionization), ou ainda, laser assistido por uma matriz (Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization – MALDI) em combinação com vários analisadores de massas, tais como tempo de voo (Time-Of-Flight – TOF), quadrupolo (Q), Fourier Transform (FT), Orbitrap, ou seus híbridos

(Figura 4). Outras abordagens, também muito usadas, acoplam a separação peptídica por cromatografia líquida (LC) uni- ou multidimensional com a análise de massas (LC-MS/MS).

Figura 4 – Fluxo experimental geral seguido em estudos proteômicos de parasitos do

gênero Leishmania

 

As proteínas são isoladas a partir de um lisado de parasitos e fracionadas por

eletroforese em uma ou duas dimensões. Em seguida, as proteínas são clivadas enzimaticamente, em geral com tripsina, para gerar peptídeos. Os peptídeos são

separados por um ou por sucessivos passos de cromatografia líquida de alta precisão,

e/ou diretamente eluídos numa fonte de ionização (ESI ou MALDI). Os peptídeos

protonados entram no espectrômetro de massas e suas massas são apresentadas na

forma de um espectro. A seguir, espectros de massa em tandem são produzidos a partir de peptídeos precursores, os quais implicam a fragmentação peptídica por colisão

energética com um gás. Os espectros de MS e de MS/MS são submetidos a buscas

contra bases de dados de sequências de proteínas. Finalmente, as proteínas são

identificadas pela coincidência das massas experimentais com as massas teóricas dos

peptídeos.

Proteômica comparativa dos estágios evolutivos

O ciclo de vida de Leishmania spp. envolve insetos vetores e distintos hospedeiros

vertebrados. A interação desses parasitos com seus dissímeis hospedeiros exige uma rápida adaptação fisiológica, a qual, por sua vez, deve implicar a expressão diferencial de genes em cada ambiente. Nesse cenário, as abordagens proteômicas têm sido ferramentas valiosas para elucidar as alterações na expressão de proteínas durante o ciclo de vida desses parasitos e identificar moléculas específicas de cada estágio. A maioria dos estudos proteômicos das formas evolutivas tem sido conduzida em parasitos do subgênero Leishmania (Leishmania), possivelmente por sua facilidade para cultivo in vitro e pela disponibilidade de informação genômica para esse subgênero. Entretanto, o sequenciamento do genoma de L. (Viannia) braziliensis, cuja análise tem revelado a presença de componentes de uma via de interferência de RNA (RNAi) (Peacock et al., 2007), deverá estimular futuros estudos em parasitos do subgênero L. (Viannia) (Smith, Peacock & Cruz, 2007).

Para os estudos proteômicos comparativos entre promastigotas e amastigotas têm

sido usados parasitos axênicos crescidos em condições in vitro que visam simular as condições no intestino do vetor (26 °C, pH 7) e do fagolisossomo (37 °C, pH 5.5) (Leifso et al., 2007; McNicoll et al., 2006; Thiel & Bruchhaus, 2001; El Fakhry, Ouellette & Papadopoulou, 2002; Bente et al., 2003; Nugent et al., 2004; Walker et al., 2006a; Smith, Peacock & Crz, 2007; Foucher, Papadopoulou & Ouellette, 2006; Rosenzweig et al., 2008a; Morales et al., 2008; Mojtahedi, Clos & Kamali-Sarvestani, 2008).

Dentre esses estudos destaca-se o reportado recentemente para L. donovani

(Rosenzweig et al., 2008a), no qual foi analisada a cinética de expressão proteica durante a transformação do parasito, tendo como foco principalmente os anos de mudanças metabólicas. Os autores obtiveram ~21% (~1.700/8.000 proteínas) de cobertura do proteoma predito de Leishmania e mostraram diferenças quantitativas na expressão de várias proteínas de vias metabólicas centrais. Durante a diferenciação de promastigota para amastigota, enzimas envolvidas no ciclo do ácido tricarboxílico (tri-carboxilic acid – TCA), na respiração mitocondrial, na fosforilação oxidativa, na gluconeogênese glicossomal e na β-oxidação de ácidos graxos foram superexpressas, ao passo que proteínas glicolíticas citosólicas foram subexpressas (Rosenzweig et al., 2008a).

Os autores também reportaram que tais mudanças na expressão estão

acompanhadas por extensiva modificação pós-traducional (post-translational modifications – PTM). Tais resultados indicaram que os parasitos trocam sua fonte de energia de glicose para ácidos graxos, o qual está de acordo com reportes prévios que indicam que o metabolismo de ácidos graxos é mais ativo em amastigotas do que em promastigotas (Coombs, Craft & Hart, 1982; Hart & Coombs, 1982). Um estudo proteômico quantitativo em L. infantum demonstrou que 72% das proteínas identificadas são expressas constitutivamente em ambos os estágios de vida do parasito (Leifso et al., 2007). Esses resultados foram corroborados por análises de microarranjos (Leifso et al., 2007; Cohen-Freue et al., 2007). Esse e outros estudos proteômicos em Leishmania demonstram claramente que os níveis de mRNA não refletem os perfis de expressão proteica no parasito, confirmando que mecanismos pós-transcricionais regulam majoritariamente a expressão gênica em Leishmania spp. (Leifso et al., 2007; McNicoll et al., 2006; Brooks et al., 2001; Clayton, 2002; Clayton & Shapira, 2007; Charest, Zhang & Matlashewski, 1996; Kelly, Nelson & McMaster, 2001; Larreta et al., 2004; Purdy, Donelson & Wilson, 2005).

Em L. mexicana, uma das espécies responsáveis pela leishmaniose cutânea no Novo

Mundo, um estudo proteômico comparativo (por meio de uma abordagem 2DE combinada com LC/MS) foi conduzido usando-se promastigotas procíclicos, promastigotas metacíclicos e amastigotas axênicos. Em tal trabalho observou-se expressão diferencial de proteínas entre os três estágios, dentre as quais foram identificadas proteínas implicadas na interação parasitohospedeiro, tais como chaperoninas, fatores de tradução e cisteína-proteinase (Nugent et al., 2004).

Ainda que as formas axênicas exibam muitas das características dos amastigotas

intracelulares (Pan et al., 1993; Sereno & Lemesre, 1997; Puentes et al.; 2000; Gupta, Goyal & Rastogi, 2001; Sereno et al., 2001a; Debrabant et al., 2004), não se sabe ao certo quão símiles elas são entre si. A propósito disso, recentemente foi reportado um estudo proteômico da diferenciação de L. mexicana usando amastigotas intracelulares (Paape et al., 2008). Amastigotas fluorescentes transgênicos foram extraídos de macrófagos do hospedeiro e comparados com promastigotas. Observouse que amastigotas intracelulares exibem mais proteínas com pI básico do que as promastigotas, além de apresentar um aumento no número de enzimas envolvidas no metabolismo de ácidos graxos, o que reforça os dados observados com amastigotas axênicas de L. donovani (Rosenzweig et al., 2008a). Algumas das proteínas exclusivamente identificadas em amastigotas intracelulares, tais como cisteína-proteinase B, chaperoninas e fatores de tradução foram também reportadas para os amastigotas axênicos (Nugent et al., 2004). Análise in silico dos genes que codificam para proteínas mais abundantes em amastigotas revelou motivos na sequência das regiões 3’-não traduzidas que poderiam estar associados a elementos de controle traducional (Paape et al., 2008), apoiando mais uma vez a hipótese de que mecanismos pós-transcricionais regulam a expressão gênica em Leishmania.

Leishmania panamensis é um agente etiológico de leishmaniose cutânea e

mucocutânea no Novo Mundo (Martinez et al.¸1991; Osorio, Castillo & Ochoa, 1998) e é a única espécie do subgênero L. (Viannia) cujo processo de diferenciação tem sido estudado usando abordagens proteômicas (Walker et al., 2006a). Os dados proteômicos sobre a expressão proteica durante a diferenciação, obtidos para várias espécies de Leishmania, são em geral congruentes (Leifso et al., 2007; McNicoll et al., 2006; Thiel & Bruchhaus, 2001; El Fakhy, Ouellette & Papadopoulou, 2002; Bente et al., 2003; Nugent et al., 2004; Walker et al., 2006a; Foucher, Papadopoulou & Ouellette, 2006; Rosenzweig et al., 2008a, 2008b; Mojtahedi, Clos & Kamali-Sarvestani, 2008; Paape et al., 2008).

Esses estudos suportam a ideia de que promastigotas e amastigotas são altamente

adaptados aos seus respectivos ambientes e que os mecanismos subjacentes de tais especificidades adaptativas são provavelmente pós-transcricionais (Rosenzweig et al., 2008a, 2008b). Entretanto, essas análises proteômicas revelaram um baixo número de proteínas (3-9%) que são diferencialmente expressas entre os estágios, tendo-se em conta o proteoma predito para tais parasitos.

Proteoma subcelular

Um dos aspectos mais interessantes da proteômica subcelular é a possibilidade de

inferir a função das proteínas e a organização celular com base na localização proteica. Esse aspecto é relevante, visto que cerca de 60% dos genes sequenciados em Leishmania spp. não têm função anotada (Ivens et al., 2005; Peacock et al., 2007). Os proteomas subcelulares são obtidos por purificação seletiva ou enriquecimento específico de organelas ou frações celulares (Dreger, 2003). Fracionamento com digitonina tem sido usado para purificar e enriquecer as frações mitocondrial e citosólica de L. infantum (Foucher, Papadopoulou & Ouellette, 2006; Hide et al., 2008). Microscopia de fluorescência de proteínas acopladas a GFP corroboraram a localização celular de várias proteínas hipotéticas identificadas em cada fração. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas não tinham sido detectadas em prévios estudos proteômicos globais (Foucher, Papadopoulou & Ouellette, 2006).

Partindo-se da hipótese de que proteínas importantes para a virulência dos parasitos

podem estar na membrana plasmática dos mesmos, desenvolveu-se um estudo para comparar essa fração entre promastigotas procíclicos e promastigotas metacíclicos de L. infantum (sin. L. chagasi) (Yao et al., 2010). As preparações de membrana foram feitas usando-se separação por afinidade com estreptavidina-biotina ou extração com detergente n-octil glicosídeo. Utilizando-se tais abordagens, as frações de membrana plasmática foram enriquecidas cerca de 130X e 250X, respectivamente. Identificação por LC-MS/MS revelou que promastigotas metacíclicos expressam proteínas específicas, ou isoformas destas, tais como cisteína-peptidases e GP63, não detectadas nos procíclicos, que estão envolvidas na virulência dos parasitos (Yao et al., 2010).

Os estudos proteômicos de organelas em Leishmania são relativamente parcos

quando comparados aos de proteínas totais. Motivos disso são, provavelmente, as dificuldades na obtenção de frações puras, livres de proteínas contaminantes, bem como o uso de técnicas laboriosas de fracionamento celular. Contudo, novas metodologias vêm sendo utilizadas para o enriquecimento de frações celulares que têm sido consideradas elusivas. Um exemplo dessas metodologias é a eletroforese de fluxo contínuo (FFE, sigla em inglês para free-flow electrophoresis). Essa técnica foi usada para o enriquecimento de proteínas básicas de amastigotas axênicos e promastigotas de L. infantum, tendo revelado ~2400 proteínas com pH >7.0 nos dois estágios (Brotherton et al., 2010). Diferenças discretas na expressão de proteínas básicas entre os estágios também foram reveladas, sendo ~60 proteínas únicas ou superexpressas nos amastigotas, incluídas proteínas envolvidas na β-oxidação de ácidos graxos (Brotherton et al., 2010).

Secretoma

As proteínas secretadas ou liberadas para o meio extracelular pelos parasitos são

mediadores-chaves das interações parasito-hospedeiro. Recentemente, os secretomas de L. donovani e L. braziliensis foram caracterizados (Silverman et al., 2008; Cuervo et al., 2009). Esses dois trabalhos são consistentes quando demonstram que apenas algumas das proteínas identificadas na fração secretada apresentam peptídeo sinal de secreção na região aminoterminal, típico das células eucarióticas, e sugerem a existência de mecanismos não convencionais de secreção nesses parasitos, provavelmente baseados em transporte através de vesículas. Ademais, tais estudos indicaram que uma grande porção de proteínas secretadas apresenta funções intracelulares já descritas, revelando a pluralidade funcional e localização múltipla de proteínas em Leishmania, bem como reforçando a ideia de que a fração secretada é uma importante fonte de moléculas efetoras implicadas na interação parasito-hospedeiro (Silverman et al., 2008; Cuervo et al., 2009). Estudos posteriores têm constatado que existe um sistema especializado de secreção de proteínas em Leishmania, baseado em exosomos, que responde por ~50% da secreção total de proteínas no parasito (Silverman et al., 2010).

Modificações pós-traducionais (PTM)

Como mencionado, os principais mecanismos de regulação da expressão gênica em

Leishmania são póstranscricionais. A modulação pós-transcricional e pós-traducional parece ser governada pela regulação da estabilidade do mRNA, da taxa de iniciação da tradução e do turnover de proteínas. Em adição a esses mecanismos, as PTM parecem ter um papel crítico na estabilidade das proteínas, contribuindo para o controle da expressão gênica. As PTM regulam a função proteica alterando a localização das proteínas, suas interações moleculares ou suas atividades. Dentre as PTM destacam-se a fosforilação, metilação, acetilação, glicosilação, piroglutamilação N-terminal, desamidação e oxidação do triptofano. Análise de sequenciamento de novo de proteínas identificadas no proteoma solúvel de L. braziliensis demonstrou que ~20% das proteínas apresentavam PTM (Cuervo et al., 2007).

Tais modificações foram detectadas em enzimas metabólicas, proteínas envolvidas

na replicação do DNA, cisteínapeptidase tipo calpaína, proteínas envolvidas na síntese proteica e na via proteasoma-ubiquitina. A clivagem do resíduo de metionina N-terminal, bem como a acetilação N-terminal, são as modificações mais comuns em proteínas eucarióticas. Essas PTM são importantes para a maturação das proteínas, assim como os resíduos N-acetilados são cruciais para a atividade de proteínas, tais como actina e subunidades do proteasoma (Abe et al., 2000; Polevoda & Sherman, 2000; Groll et al., 1999). Resíduos de piroglutamato N-terminal, como os identificados em L. braziliensis (Cuervo et al., 2007), poderiam ter a função de reduzir a suscetibilidade das proteínas à degradação por aminopeptidases (Cummins & O’Connor, 1998).

A desamidação das proteínas tem sido associada a importantes processos biológicos

tais como o turnover de proteínas, o desenvolvimento e senilidade molecular (Robinson & Robinson, 2001; Weintraub & Manson, 2004). Análise in silico constatou que algumas das enzimas envolvidas nessas PTM, tais como metionina aminopeptidases, deformilase, glutaminil ciclase e acetiltransferases, são codificadas pelo genoma de L. braziliensis (Cuervo et al., 2007). Fosfoproteínas de promastigotas e amastigotas axênicos de L. donovani foram purificadas e comparadas, com o intuito de elucidar o papel da fosforilação durante a diferenciação dessa espécie (Morales et al., 2008; Rosenzweig et al., 2008b). As fosfoproteínas identificadas foram classificadas em cinco grupos funcionais: chaperonas, proteínas do citoesqueleto, turnover de proteínas/RNA, sinalização celular, metabolismo e proteínas hipotéticas (Morales et al., 2008; Rosenzweig et al., 2008b).

Interação parasito-hospedeiro, marcadores de

virulência, antígenos para diagnóstico e

identificação de potenciais alvos para

desenvolvimento de vacinas

A maioria dos estudos sobre interação parasito-hospedeiro tem-se focado nos

antígenos imunogênicos do parasito. Tal interesse dá-se em razão da carência de vacinas para leishmaniose, o que tem levado muitos pesquisadores a investir esforços na busca por proteínas que possam ser usadas para o desenvolvimento racional de vacinas. Nesse sentido, as abordagens proteômicas apresentam uma oportunidade única para detectar marcadores de virulência em Leishmania e em potenciais alvos vacinais.

Os parasitos de subgênero Leishmania (Viannia), em particular L. braziliensis, L.

panamensis e L. guyanensis são os agentes etiológicos da leishmaniose mucocutânea nas Américas do Sul e Central. Esses parasitos são capazes de se disseminar (por metástase) a partir da lesão cutânea primária à mucosa nasofaríngea, produzindo desde perfuração do septo nasal até lesões faciais desfigurantes envolvendo o palato, os lábios, a faringe e a traqueia (Osorio, Castillo & Ochoa, 1998; Saravia et al., 1985; Santrich et al., 1990; Marsden, 1986; Oliveira-Neto et al., 2000; Figueroa et al., 2009).

Em recente trabalho, clones de L. guyanensis expressando distintos fenótipos

metastáticos estáveis – parasitos apresentando desde alta capacidade metastática à intermediária e baixa capacidade – foram analisados por 2DE e MS/MS com o intuito de identificar potenciais fatores metastáticos (Walker et al., 2006b). A comparação de seus proteomas revelou que o fator de elongação 1-β (EF-1β) e a triparedoxina peroxidase (TXNPx) poderiam estar associados ao fenótipo altamente metastático. Tal associação envolveria alternância na expressão de isoformas das proteínas, em vez de superexpressão ou subexpressão das mesmas. Além do seu papel na síntese de proteínas, o EF-1β tem atividades de tripanotiona S-transferase e tripanotiona peroxidase, as quais são importantes na defesa contra o estresse oxidativo (Vickers & Fairlamb, 2004; Vickers, Wylie & Fairlamb, 2004).

Não obstante as evidências de que tais proteínas contribuam para a sobrevivência e

persistência do parasito in vitro, quando o fenótipo bioquímico foi analisado em isolados clínicos observou-se uma expressão inconsistente desses marcadores. Esse resultado levou os autores a sugerir que as lesões metastáticas são determinadas por múltiplos mecanismos que envolvem tanto a resposta do hospedeiro, quanto determinantes moleculares dos parasitos (Walker et al., 2006b). Estudos posteriores demonstraram que a presença de vírus RNA em cepas de L. guyanensis com distintas capacidades metastáticas pode modular a resposta imune do hospedeiro (Ives et al., 2011). O estudo também apontou que a exacerbada resposta inflamatória na leishmaniose mucocutânea está relacionada com a intensidade da carga viral presente no parasito (Ives et al., 2011).

Proteínas imunomodulatórias e proteínas antigênicas têm sido analisadas por

abordagens proteômicas em L. infantum e L. donovani (Dea-Ayuela, Rama-Iñiguez & Bolás-Fernández, 2006; Forgber et al., 2006; Gupta et al., 2007; Costa et al., 2011). Tais estudos revelaram que proteínas pertencentes a categorias muito distintas podiam ser antigênicas. Entre estas, foram identificadas propinil carboxilase, transcetolase, gp63, fatores de iniciação, fatores de elongação, subunidades de proteasome, ATPases, subunidades de tubulina, enolase e HSP. Também se observou que a antigenicidade dessas proteínas não se correlaciona com seus níveis de expressão.

Recentemente, uma abordagem imunoproteômica in silico foi usada para identificar

proteínas antigênicas em L. major por meio da predição de epítopos reconhecidos por células T (Herrera-Najera et al., 2009). A imunogenicidade de 26 dos melhores candidatos foi avaliada em camundongos BALB/c, comprovando-se a natureza imunogênica de 54% deles. Observou-se também nesse trabalho que nenhum dos atuais candidatos vacinais ou antígenos conhecidos de L. major foram encontrados entre os principais epítopos preditos. Em vez disso, muitas proteínas constitutivamente expressas, incluindo proteínas hipotéticas e duas proteínas de superfície, foram achadas entre os ‘top’ 20 epítopos antigênicos preditos (Bolhassani & Rafati, 2008). Entre os estudos proteômicos descritos anteriormente, HSP são comumente identificadas como proteínas altamente antigênicas e, portanto, promissoras candidatas vacinais em Leishmania. O potencial de proteínas de choque térmico como alvos vacinais foi recentemente revisado (Croft, 2008).

Resistência a medicamentos e alvos

terapêuticos

Na ausência de vacinas, o controle da leishmaniose depende majoritariamente do

tratamento quimioterápico (Croft, Sundar & Fourlamb, 2006). Contudo, os compostos de antimônio pentavalente [Sb(V)], antimoniato de meglumina e estibogluconato de sódio – primeira linha de eleição no tratamento atual de pacientes com leishmaniose (Faraut-Gambarelli et al., 1997) –, que têm sido usados há mais de sessenta anos, apresentam alta toxicidade e severos efeitos secundários que incluem arritmias cardíacas e dano renal. Além disso, pacientes refratários ao tratamento e isolados clinicamente resistentes têm sido reportados em distintas partes do mundo (Lira et al., 1999; Palacios et al., 2001; Sundar, 2001; Abdo et al., 2003; Das et al., 2005; Hadighi et al., 2006; Rojas et al., 2006). Os medicamentos de segunda linha tais como anfotericina B, pentamidina, e o medicamento oral miltefosina apresentam também alta toxicidade, eficácia questionável e resistência cruzada, além de não serem economicamente viáveis para muitos países onde a doença é endêmica (Faraut-Gambarelli et al., 1997; Pérez-Victoria et al., 2006; Seifert et al., 2007; Kumar et al., 2009).

Nesse contexto, faz-se imperativa a elucidação dos mecanismos envolvidos na

resistência, bem como a descoberta e validação de novos alvos quimioterápicos. O primeiro reporte sobre análise proteômica, destinado à compreensão dos mecanismos de resistência em Leishmania, utiliza e valida a 2DE para observar a superexpressão de proteínas envolvidas em resistência in vitro de L. major ao Sb(V) (Drummelsmith et al., 2003). Nesse estudo observou-se aumento na intensidade de spots identificados como tripanotiona (TRYR), uma proteína envolvida na detoxificação do antimônio. A presença de vários spots com distintas intensidades sugere a presença de isoformas, provavelmente originadas a partir de PTM (Drummelsmith et al., 2003). Ademais, esse mesmo trabalho demonstrou que a indução in vitro de resistência ao metotrexate (MTX) em promastigotas de L. major é acompanhada pelo aumento na expressão de pteridina redutase, PTR1, um conhecido mediador primário da resistência ao MTX (Drummelsmith et al., 2003; Papadopoulou, Roy & Ouellette, 1992; Callahan & Beverley, 1992).

Trabalhos subsequentes demonstraram que mutantes de L. major resistentes ao

MXT apresentam expressão aumentada de proteínas envolvidas em resposta ao estresse tais como chaperoninas, HSP e enolase, bem como a metionina adenosiltransferase, cujo papel na resistência não tinha ainda sido descrito (Drummelsmith et al., 2004). Essa enzima catalisa a síntese de S-adenosilmetionina, cujo aumento de síntese correlaciona-se com o surgimento de resistência ao MXT nessa espécie (Drummelsmith et al., 2004).

Ainda que a resistência in vitro ao antimônio seja parcialmente entendida (Croft,

Sundar & Fairlamb, 2006; Ouellette, Drummelsmith & Papadopoulou, 2004), os mecanismos da resistência em isolados de campo permanecem obscuros. Com base em evidências prévias que sugeriam que o antimoniato eliminava os parasitos por meio de um processo envolvendo vários eventos da morte celular programada (MCP) (Sereno et al., 2001b; Lee et al., 2002; Sudhandiran & Shaha, 2003), Vergnes e colaboradores conduziram uma análise proteômica comparativa de isolados de campo de L. donovani para identificar proteínas potencialmente envolvidas na resistência ao Sb(V) (Vergnes et al., 2007). Parasitos naturalmente suscetíveis e resistentes ao Sb(V) diferiram na expressão de HSP83 e de uma pequena proteína relacionada à calpaína. Essas duas proteínas poderiam estar envolvidas na modulação da suscetibilidade ao Sb(V) e a outros medicamentos, tais como miltefosina, através da interferência nas vias de MCP induzidas por esses quimioterápicos (Vergnes et al., 2007).

Recente estudo comparando amastigotas axênicos de L. infantum sensíveis e

resistentes ao Sb(V) revelou expressão diminuída da proteína de membrana KMP-11, provavelmente em razão do aumento no turnover da mesma. Deduziuse que tal redução poderia afetar a interação de transportadores tais como aquagliceroporina ou sistemas de efluxo, os quais, por sua vez, aumentariam o bombeio do Sb(III) para fora da célula (El Fadili et al., 2009).

Perspectivas

A aplicação de metodologias de análise proteica em larga escala em Leishmania spp.

tem provado ser de grande valia para a identificação de grupos específicos de proteínas expressos por cada estágio de desenvolvimento do parasito, como também para a caracterização dos subproteomas e as PTM que as proteínas desses organismos sofrem. A análise proteômica de organelas tem revelado novas proteínas que não haviam sido descritas em análises do proteoma total.

Em paralelo, tais abordagens ressaltam a importância das metodologias de

subfracionamento para enriquecer frações proteicas específicas, ampliando o entendimento da biologia do parasito e mudando o paradigma da localização de proteínas nesses organismos. Contudo, a pureza desses subproteomas apresenta ainda um desafio metodológico e requer o emprego de técnicas mais refinadas. A elucidação dos mecanismos de modificação pós-traducional e das PTM per se pode trazer informações relevantes sobre novas vias candidatas para intervenção terapêutica. A descrição e análise das interações proteína-proteína em Leishmania spp. ainda são tímidas e representam um passo crítico para elucidar de forma integrada os mecanismos de virulência e patogenicidade nesses parasitos.

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Notas

1. Exemplo de cálculo de dose para um paciente de 60 kg:

5 mg Sb5+ 5+ /kg/dia = 300 mg Sb/dia = 3,7 ml/dia, arredondando, = 3,5 ml/dia EV ou IM.

20 mg Sb 5+ 5+ /kg/dia = 1.200 mg Sb/dia = 14,8 ml/dia, arredondando, = 15 ml/dia EV ou IM.

↩