17. Modelos Experimentais na Leishmaniose Tegumentar Americana

17. Modelos experimentais na

Leishmaniose Tegumentar

Americana

Sylvio Celso Gonçalves da Costa, Tânia Zaverucha do Valle

As leishmanioses são doenças que atingem o homem e animais domésticos, constituindo doenças espectrais com uma ampla variação de manifestações clínicas. Essas variações são consequência de vários fatores que dependem tanto do parasito quanto do hospedeiro. Primeiramente, devemos considerar as várias espécies de protozoários que causam a doença no homem e nos reservatórios domésticos e silvestres. No Novo Mundo, por exemplo, as leishmanioses ocorrem do sul dos Estados Unidos à região norte da Argentina e são causadas por diferentes espécies, tais como L (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.) guyanensis e L (L.) infantum.

Em seguida, precisamos levar em conta a diversidade de cepas, a carga parasitária no momento da infecção, o estado imunológico do hospedeiro, as infecções concomitantes etc. Infecções concomitantes, por exemplo, podem mudar o curso de uma infecção de maneira surpreendente, tanto diretamente quanto por consequência do tratamento com algumas drogas. Da mesma forma, drogas utilizadas no tratamento de outras doenças como o câncer, também podem alterar o curso de uma infecção por Leishmania (Gurubacharya et al., 2006; Desjeux & Alvar, 2003).

Essa variedade de lesões tem sido estudada nos modelos experimentais, o que tem permitido um melhor entendimento do que se passa no homem e nos reservatórios domésticos e silvestres (Lainson & Rangel, 2005; Schubach et al., 2001). A escolha do modelo a ser utilizado, no entanto, é um ponto crucial em tais estudos, uma vez que ele deve representar da melhor maneira possível as condições que queremos analisar.

Neste capítulo temos por objetivo expor a variedade de modelos disponíveis para o estudo da leishmaniose tegumentar, comentando sobre alguns dos avanços científicos que foram possíveis graças a sua utilização.

 

Leishmania (L.) major: a construção

da imunopatologia das leishmanioses

Os camundongos são os mais bem conhecidos e mais utilizados modelos mamíferos para o estudo de doenças infecciosas, genética, imunologia, toxicologia etc. Seu porte pequeno, facilidade de se reproduzir em cativeiro, amabilidade, rápido tempo de geração e tamanho da prole são algumas das características que o tornam modelos bastante práticos. Muito mais do que isso, o Projeto Genoma Camundongo apontou a grande semelhança entre o genoma deste animal e o do homem. Em uma comparação feita utilizando-se resultados preliminares com 96% do genoma do camundongo completo, e outros tanto do genoma humano, admitiu-se que mais de 90% dos dois genomas poderiam ser particionados em regiões correspondentes, revelando que a ordem dos genes no ancestral comum mais recente foi mantida em ambas as espécies. Além disso, mais de 40% do genoma do humano poderia ter seus nucleotídeos alinhados com o genoma do camundongo. Na realidade, a proporção de genes de camundongo sem nenhum homólogo detectável no homem parece ser de menos de 1% do total (Waterston et al., 2002). Sua semelhança com o genoma humano, associada ao fato de suportar bem a consanguinidade, além de todas as vantagens citadas antes, e ainda o baixo custo de sua manutenção, tornaram o camundongo o modelo de escolha para o estudo de fisiologia, biologia do desenvolvimento, imunologia, patologias humanas, entre outros.

Dessa forma, grande parte dos estudos em leishmaniose tegumentar foram então realizados nesse organismo. Investigações experimentais no modelo murino empregando a L. (L.) major, isoladas no Mediterrâneo, foram extremamente importantes, pois estabeleceram o paradigma Th1/Th2. Isto é, foi visto que a resistência a essa infecção é em grande parte controlada pela genética do hospedeiro. Assim, os camundongos da linhagem C57BL/6 cicatrizam espontaneamente após o desenvolvimento de uma lesão cutânea e os animais se tornam resistentes a um novo desafio, constituindo-se então num bom modelo para a forma humana da leishmaniose tegumentar causada por L. (L.) major. Por sua vez, a linhagem BALB/c, quando infectada com essa mesma amostra de Leishmania, desenvolve uma infecção que se torna sistêmica e mata o camundongo em algumas semanas (Kellina, 1973; Nasseri & Modabber, 1979). Evidenciou-se que a linhagem resistente C57BL/6 desenvolve uma resposta Th1 que se baseia na produção de IL-12 e γ-interferon (γ-IFN) e a consequente ativação dos macrófagos, que têm a capacidade de controlar a proliferação dos parasitos e o desenvolvimento da lesão pela L. (L.) major. De modo contrário, a linhagem BALB/c, que é sensível, desenvolve uma resposta do tipo Th2, exprimindo citocinas como IL-4 e IL-5 (Scott et al., 1988).

Camundongos BALB/c tratados por anticorpos anti-IL-4 no momento da infecção ou animais deficientes para o gene IL-4 conseguem resolver a infecção (Sadick et al., 1990; Kopf et al., 1996), o que demonstra o papel fundamental dessa citocina no desenvolvimento da imunidade contra o parasito. Três dias após a injeção de promastigotas mortos ou extratos parasitários, os gânglios provenientes de BALB/c passam a produzir γ-IFN, IL-4 e IL-5, enquanto os gânglios de linhagens C57BL/6 imunizados com os mesmos antígenos produzem apenas γ-IFN. Apesar do importante papel da IL-4, quando camundongos C3H, também resistentes, são tratados por injeções dessa citocina no momento da infecção, eles desenvolvem uma forte resposta Th2 que, por ser transitória, não reverte seu fenótipo resistente (Chatelain, Varkila & Coffman, 1992). De forma semelhante, muito embora tenhamos evidências do papel central do γ-IFN na resistência à infecção por Leishmania, a administração dessa citocina aos camundongos sensíveis não é suficiente para protegê-los contra a infecção por Leishmania (Sacks & Noben-Trauth, 2002).

Devemos chamar atenção também para o fato de que a administração de IL-12 a camundongos BALB/c induz uma proteção extremamente eficaz e que este efeito protetor contra L. (L.) major está associado à menor produção de IL-4 e ao aumento da síntese de γ-IFN (Heinzel et al., 1993). Tanto na leishmaniose humana quanto na experimental, o desenvolvimento de uma imunidade depende da produção de γ-IFN induzido pela IL-12. Vemos que o γ-IFN é capaz de ativar os macrófagos infectados que eliminarão os parasitos via produção de óxido nítrico (NO) (Sacks & Noben-Trauth, 2002; Reiner & Locksley, 1995). Alguns autores empregando extratos de Leishmania conseguem induzir uma proteção contra Leishmania desde que os antígenos sejam injetados juntamente com a IL-12 (Mougneau et al., 1995).

Desde quando foram descritas as diferenças de suscetibilidade de cada linhagem de camundongo à infecção por L. (L.) major até hoje, muitos estudos foram realizados utilizando-se o modelo murino, explorando especialmente a dicotomia entre as linhagens C57BL/6 e BALB/c e o paradigma Th1/Th2. Embora alguns autores defendam que esse paradigma simplifica mecanismos imunológicos mais complexos (discutido por Sacks e Noben-Trauth, 2002), o estudo das linhagens C57BL/6 e BALB/c foi fundamental para a melhor compreensão da imunopatologia das leishmanioses.

 

As principais leishmânias do novo

mundo: L. (L.) amazonensis E L. (V.)

braziliensis

L. (V.) braziliensis é a espécie mais importante como agente da leishmaniose tegumentar americana, sendo a espécie de mais ampla distribuição no Novo Mundo e responsável por um grande problema de saúde pública. Suas manifestações clínicas variam de úlceras cutâneas a formas mucocutâneas erosivas com destruição do trato nasofaringeal.

O ensaio dessa Leishmania em modelo murino, entretanto, apresenta dificuldades. Em modelos experimentais, a L. (V.) braziliensis se desenvolve melhor no hamster (Mesocricetus auratus) ou em primatas. Embora o modelo murino infectado por L. (V.) braziliensis tenha sido retomado por alguns grupos (Pereira et al., 2009), a facilidade de infecção experimental empregando L. (L.) amazonensis determinou um amplo predomínio dessa espécie sobre as investigações experimentais com L. (V.) braziliensis. É interessante salientar que as investigações com L. (L.) amazonensis no modelo murino permitem o estudo de diferentes aspectos da leishmaniose tegumentar, uma vez que é possível se obter uma lesão localizada com cura espontânea, assim como uma doença que evolua para uma lesão de mucosa. Finalmente, tal modelo também proporcionou resultados extraordinários nos estudos da forma difusa (Cupolilo et al., 2003).

Um dos grandes problemas que devem ser discutidos envolve conhecimentos estabelecidos sobre a imunologia das leishmanioses de maneira geral, quando diferentes grupos de pesquisadores tentam estabelecer uma correlação entre a imunopatologia da leishmaniose cutânea humana e os resultados obtidos nos modelos experimentais. Esses resultados são geralmente obtidos com uma espécie de Leishmania, predominando os resultados obtidos com L. (L.) major, e a seguir generalizados para outras. Algumas coisas básicas podem ser generalizadas, como, por exemplo, o papel do γ-IFN, que é importante no controle não apenas de aspectos clínicos causados por uma espécie de Leishmania, mas de muitas infecções, principalmente em casos de parasitos de macrófagos. Um dos pontos cuja generalização leva a conclusões equivocadas é o fato de que os resultados obtidos em modelos experimentais partem do princípio de que a linhagem C57BL/6 é resistente às infecções por Leishmania; esses camundongos são considerados como uma linhagem que recapitula os pontos mais importantes da infecção humana por esse parasito. Os resultados que temos obtido utilizando a linhagem C57BL/6 infectada por L. (L.) amazonensis são, em muitos aspectos, completamente diferentes dos resultados obtidos com L. (L.) major. Conforme já discutido, os camundongos C57BL/6 infectados com L. (L.) major desenvolvem uma lesão cutânea capaz de evoluir para a cura espontânea semelhante ao que pode ocorrer na infecção no homem (Stebut, 2007). Quando se analisa o comportamento de uma cepa de L. (L.) amazonensis isolada de um paciente com forma difusa, em três linhagens diferentes de camundongos, observamos o desenvolvimento de uma lesão nodular progressiva que evolui para uma lesão ulcerada. As linhagens BALB/c, C57BL/6 e C57BL/10 são consideradas suscetíveis nos ensaios que realizamos empregando um desafio de 10 4 amastigotas purificadas. Observamos nesses modelos o desenvolvimento de metástases nas diferentes patas, cauda, focinho e mucosa oral. A ocorrência de amputação espontânea da pata infectada inicialmente foi frequente nos experimentos. Podemos considerar também esses camundongos como excelentes modelos para estudos de forma mucocutânea, uma vez que pode ocorrer comprometimento de boca e focinho (Cupolilo et al., 2003). Dessa forma, vemos que a linhagem C57BL/6 é sensível para L. (L.)

amazonensis (Figura 1).

Figura 1 – O camundongo C57BL/6 e sua sensibilidade à L. (L.)

amazonensis

 

A – Lesão no coxim plantar 90 dias após a infecção com 104

promastigotas; B – Lesão metastática, ulcerada no focinho 90 dias

após a infecção por 10 6 promastigotas de L. (L.) amazonensis no

coxim plantar; C – Histopatologia do baço 90 dias após a infecção

por 106 promastigotas de L. (L.) amazonensis no coxim plantar.

Presença de amastigotas (setas) 400x; D – Histopatologia da pele

do focinho 90 dias após a infecção por 106 promastigotas de L. (L.)

amazonensis no coxim plantar. Presença de amastigotas (seta)

400x. Coloração por eosina e hematoxilina.

A resistência de C57BL/6 às infecções por L. (L.) major está correlacionada à produção de γ-IFN, que ativa os macrófagos infectados pelo parasito que serão eliminados pelo NO produzido. A cura da leishmaniose cutânea é dependente de células Th1. O γ-IFN é igualmente essencial ao controle da L. (L.) amazonensis. Estudos com camundongos C57BL/6 deficientes para γ-IFN (γ-IFN knockout) mostraram que esses animais desenvolvem uma patologia mais grave que os animais não deficientes da mesma linhagem. Essa diferença entretanto não é observada nos primeiros dois meses após a infecção, sugerindo que o γ-IFN não seja necessário no início da infecção (Pinheiro & Rossi-Bergmann, 2007).

Utilizando a L. (L.) amazonensis também tivemos a oportunidade de estudar a importância da resposta Th1 em ensaios vacinais empregando camundongos albinos (Swiss Webster). Animais vacinados com fração microssomal de L. (L.) amazonensis sob a imunomodulação do Mycobacterium bovis BCG e da ciclofosfamida foram protegidos contra a infecção experimental, e mostraram uma indução bastante forte de resposta Th1 (Zaverucha do Valle, 2005)

(Figura 2). Neste modelo, o BCG atua imunomodulando a resposta imunológica do camundongo, uma vez que induz o desenvolvimento de uma resposta Th1 e atrai células inflamatórias, em especial macrófagos, para o local de inoculação. Dessa forma, quando injetamos o antígeno vacinal dentro do granuloma do BCG, encontramos ali um ambiente favorável para o desenvolvimento de uma resposta protetora efetiva. A ciclofosfamida é um imunossupressor que provoca forte leucopenia. Entretanto, quando cessa esse efeito citotóxico ela causa um efeito rebote, que se traduz em leucocitose. Assim, quando utilizada no momento certo, a ciclofosfamida também pode atuar como um imunomodulador que auxilia no desenvolvimento da resposta protetora.

Figura 2 – Camundongos albinos heterozigotos (Swiss Webster), vacinados com fração microssomal de L. (L.) amazonensis sob

imunomodulação de BCG e ciclofosfamida, mostram proteção contra a infecção por 10 4 de amastigotas do parasito no coxim

plantar traseiro

 

A – Histopatologia do coxim plantar de um animal vacinado 21

dias após a infecção. Presença de forte infiltrado inflamatório no local da infecção; B – Histopatologia do coxim plantar de um animal-

controle (somete infectado) 21 dias após a infecção. Presença

maciça de amastigotas no local da infecção; C – Histopatologia do

linfonodo drenante ao local da infecção, após 21 dias, em animal

vacinado. Observa-se zona de intensa linfoproliferação; D –

Histopatologia do linfonodo drenante ao local da infecção, após 21

dias, em animal-controle. Sem alterações. 400x. Coloração por

eosina e hematoxilina.

Dentro desse quadro, precisamos investigar vários aspectos do estado de resistência que podemos induzir com frações subcelulares de membrana, flagelo e microssomal, em camundongos previamente imunizados com o BCG, podendo-se incluir um imunomodulador como a CY, antes do desafio com a forma infectante.

Assim, esse esquema de vacinação nas infecções por Leishmania torna-se uma poderosa arma e podemos considerar que a produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF, IL-12 e IL-6 são essenciais na ativação de uma resposta imunológica protetora contra patógenos intracelulares. TNF e IL-12 são fatores importantes em induzir a imunidade protetora e induzir a produção de γ-IFN pelas células T. Ficou demonstrado que a produção de IL-12 no camundongo é fundamental para o desenvolvimento de uma imunidade protetora contra um desafio intravenoso por M. tuberculosis (Cooper et al., 1997). Os estudos no modelo murino têm evidenciado que o TNF e o γ-IFN são fundamentais para a expressão de óxido nítrico induzível (iNOS), que tem papel-chave na morte dos amastigotas e outros microrganismos parasitas de macrófagos. Todavia, podemos afirmar que a produção em excesso de TNF contribui para a exacerbação dos processos inflamatórios das lesões causadas por Leishmania. Outro aspecto a ser considerado é o fato de que a citocina anti-inflamatória IL-10 controla de maneira efetiva o TNF, IL-12 e γ-IFN, diminuindo drasticamente os níveis dessas citocinas. Foi evidenciado que penetrando no macrófago a Leishmania pode, pelo menos parcialmente, inibir a ativação da célula do hospedeiro pelo γ-IFN, o que conduz a uma baixa produção de O , H O e NO (Mauel, 1996). 2 2 2

É preciso enfatizar que o fosfoglucano, uma importante molécula da superfície da Leishmania, inibe seletivamente a síntese de IL-12 pelo macrófago. Essa inibição da produção de IL-12 pelo macrófago constitui uma estratégia para a sobrevivência do parasito, retardando a produção de γ-IFN e inibindo a produção de NO pelo macrófago. O fosfoglucano, na realidade, engloba três moléculas diferentes: o lipofosfoglucano (LPG), a fosfatase ácida que é secretada e o proteofosfoglucano (Mengeling, Beverley & Turco, 1997). Assim, no modelo de vacinação em que empregamos a fração microssomal modulada pelo BCG e pela CY podemos observar, no primeiro dia após a infecção por L. (L.) amazonensis, níveis séricos bastante elevados de γ-IFN e baixos níveis de IL-10. Quando comparamos com o grupo controle que só recebeu a dose de infecção, os níveis de γ-IFN são baixos (Zaverucha do Valle, 2005; Zaverucha do Valle et al., 2007). Nesse contexto, devemos considerar que os ensaios de vacinação que dão um estado de proteção indiscutível permitem avaliar os fatores que garantem o conhecimento das condições imunológicas que induzem resistência em diferentes hospedeiros experimentais.

As infecções pelas diferentes espécies de Leishmania vêm se expandindo pelo mundo. No caso da L. (L.) amazonensis podemos constatar que hoje em dia, na Região Centro-Oeste do Brasil, ela ocorre na cidade de Campo Grande, a capital do estado, e no município de Dourados, em Mato Grosso do Sul (Dorval et al., 2006). Ela está determinando infecções no homem com uma característica espectral que vai de casos cutâneos a formas viscerais (Barral et al., 1991). Como tem sido discutido por alguns autores, a leishmaniose tende a ser mais grave em áreas onde ela acaba de ser introduzida (Vieira & Coelho, 1998). Tal fato requer uma investigação em modelos experimentais visando a avaliar a virulência das amostras que têm sido isoladas do homem e de reservatórios domésticos e silvestres.

No Rio de Janeiro, durante anos ocorria apenas L. (V.) braziliensis causando formas cutâneas e mucocutâneas (Oliveira-Neto et al., 2000, Grimaldi et al., 1989). Recentemente foi diagnosticado o primeiro caso de forma cutâneodifusa autóctone, causada por L. (L.) amazonensis no Rio de Janeiro. Esse caso, caracterizado por lesões cutâneas múltiplas e progressivas, apresentando resistência à quimioterapia, foi encontrado em uma criança na cidade de Paraty (Azeredo-Coutinho et al., 2007). O teste cutâneo conhecido como reação de Montenegro foi negativo e a análise histopatológica mostrou um infiltrado mononuclear na derme com macrófagos altamente parasitados, L. (L.) amazonensis foi identificada por eletroforese de isoenzima e PCR-RFLP (Azeredo-Coutinho et al., 2007). Nosso grupo de pesquisa tem estudado no modelo murino algumas espécies de Leishmania causadoras da infecção no homem e em reservatórios domésticos e silvestres. Assim, utilizando diferentes técnicas de diagnóstico e avaliando o comportamento das cepas isoladas nos modelos experimentais, podemos ter uma ideia melhor das características biológicas da espécie de Leishmania isolada e as variações de cepas de uma determinada espécie. A preocupação com a expansão das leishmanioses na Região Centro-Oeste determinou o emprego de várias técnicas de biologia molecular para a detecção e identificação, de forma mais precisa, das espécies de Leishmania que estão ocorrendo antes do início dos experimentos no modelo murino, que é o foco principal da linha de pesquisa de nosso grupo de trabalho. Nesse último caso, o emprego de diferentes linhagens de camundongos inbred abriu caminho para as pesquisas com L. (L.) amazonensis (Cupolilo et al., 2003; Cupolilo, 2002).

Como discutimos anteriormente, o estudo de L. (V.) braziliensis em modelo animal é geralmente realizado em hamsters ou primatas, uma vez que o camundongo é resistente à infecção por essa espécie de Leishmania. O hamster é comumente utilizado para o isolamento do parasito obtido de lesões de pacientes, podendo também ser utilizado em estudos de quimioterapia (Sinagra et al., 2007). O macaco rhesus também se mostrou suscetível à infecção por L. (V.) braziliensis, desenvolvendo uma doença semelhante à de humanos (Teva et al., 2003) e tem sido utilizado em estudos de imunologia e imunoproteção (Grimaldi Jr., 2008). Um trabalho utilizando esses animais infectados por L. (V.) braziiensis permitiu o estudo de diferentes momentos na infecção. Os autores observaram desde a formação da lesão até a cura espontânea, que ocorreu em seis meses. O estudo mostrou que neutrófilos estão envolvidos de forma decisiva no controle do parasito e na inflamação nos primeiros momentos da infecção. Além disso, granulócitos infectados fagocitados por células monocíticas parecem participar do estabelecimento da lesão. De forma semelhante, o modelo também mostra que células CD4 + + e CD8 produtoras de γ-IFN e α-TNF são importantes na cura da lesão (Souza-Lemos et al., 2008). Esse primata pode ser muito interessante para compreender os diferentes aspectos da doença em um modelo muito semelhante ao homem, podendo assim ser utilizado em estudos de vacinação. Leishmania (L.) Mexicana: sua

importância em países do novo

mundo

Leishmania (L.) mexicana está envolvida principalmente com formas cutâneas, infectando o homem e vários hospedeiros vertebrados. Podemos encontrá-la na América do Norte, Central e do Sul, tendo vários vetores assinalados na literatura, dos quais destacamos Lu olmeca e Lu anthophora. No México causa no homem a úlcera de chiclero – lesões, em geral nas orelhas, que aparecem em trabalhadores que fazem a extração da borracha das árvores (seringueiras). Nos Estados Unidos, as investigações realizadas no Sul e região central do Texas têm mostrado casos autóctones de homens com leishmaniose cutânea. Esses autores observaram que roedores silvestres como Neotoma micropus apresentam lesões na base da orelha (McHugh, Grogl & Kerr, 1990; McHugh, Melby & LaFon, 1996). Ensaios experimentais realizados em camundongos da linhagem C57BL/10 apresentaram um comportamento semelhante com inoculações subcutâneas quando variações genéticas nessa cepa foram testadas. Tais variações genéticas (alelos alternativos a níveis Lsh, H-2 ou H-11) indicaram, entretanto, alguma influência na visceralização e expansão de metástases (Roberts, Alexander & Blackwell, 1989).

Quando realizamos experimentos em hamster, com a dose de infecção numa das patas do animal, vamos observar que esta espécie invade rapidamente o linfonodo drenante, lá se multiplicando intensamente. Temos com frequência a formação de metástases nas outras patas, nas orelhas e no focinho.

Já no modelo murino, ficou evidenciado que quatro linhagens de camundongos singênicos, como AKR, C57BL/6, DBA/2 e NMRI são relativamente resistentes à leishmaniose cutânea causada por L. (L.) mexicana. BALB/c foi considerado o mais sensível, tendo sido demonstrado, além disso, que os camundongos híbridos oriundos do cruzamento de machos da linhagem C57BL/6 com fêmeas BALB/c não eram mais sensíveis que o C57BL/6, ficando assim evidenciado que a resistência é consequência de um caráter hereditário dominante (Perez, Malave & Arredondo, 1979). Tem sido observado que as fêmeas da linhagem DBA/2 são relativamente mais resistentes à infecção por L. (L.) mexicana quando comparamos com os machos. Viu-se que a produção de γ-IFN é um fator importante, por si só suficiente para bloquear o crescimento de L. (L.) mexicana em fêmeas DBA/2. Quando as observações chegam a um tempo maior, como 12 semanas, observou-se que os machos apresentam amplas lesões que não cicatrizam, que as fêmeas apresentam lesões muito pequenas e que o γ-IFN é detectado apenas nas fêmeas (Satoskar & Alexander, 1995).

 

Infecções na cobaia por Leishmania

(L.) enriettii

A Leishmania (L.) enriettii é uma espécie que foi descoberta parasitando espontaneamente cobaias domésticas (Cavia porcellus) no estado do Paraná, Brasil, provocando lesões cutâneas exuberantes, principalmente aquelas que se localizam no pavilhão auricular (Medina, 1946). As infecções por L. (L.) enriettii produzem uma lesão local que se assemelha em muitos aspectos ao botão do oriente, lesão muito característica causada por L. (L.) major. São lesões que cicatrizam com o desenvolvimento de hipersensibilidade retardada que surge após certo período da infecção e é revelada pelo teste de Montenegro. Metástases ocorrem com frequência em áreas do corpo desprovidas de pelos, como o nariz, orelhas, lábios, patas e genitália (Bryceson et al., 1970).

A interação de L. (L.) enriettii com macrófagos ativados de cobaia tem sido bastante estudada há vários anos. É importante salientar que após inoculações subcutâneas na cobaia, essa espécie de Leishmania induz tanto uma resposta mediada por células quanto a produção de anticorpos. A cicatrização, que ocorre em geral após três meses, deixa o animal com uma imunidade consistente e favorece as investigações in vitro. Os estudos histopatológicos foram realizados há muitos anos no Instituto Oswaldo Cruz, cujos resultados revelaram o crescimento da lesão com intensa proliferação de formas amastigotas na pele de cobaias (Magarinos-Torres, Muniz & Cardoso, 1948). O esfregaço das lesões em uma lâmina corada pelo May-Grünwald-Giemsa permitiu a observação das formas amastigotas e seus aspectos morfológicos. Esses estudos morfológicos foram facilitados pelo grande tamanho dos amastigotas.

Além disso, o crescimento extraordinário das lesões nodulares cutâneas nas orelhas é frequente. Os cortes histológicos apresentam um infiltrado dérmico abundante e difuso de macrófagos, plasmócitos, linfócitos. Os macrófagos apresentam sempre vacúolos parasitóforos que permitem o estudo morfológico. A observação em meios de cultura no laboratório colocou essa espécie de Leishmania em um modelo exemplar também para estudos bioquímicos e de biologia molecular, servindo de base para investigações na área da quimioterapia.

Por sua vez, o estudo das infecções experimentais com L. (L.) enriettii nas cobaias constitui um modelo que contribui bastante para os conhecimentos que temos sobre a imunologia das leishmanioses. Esta infecção induz imunidade celular e imunidade humoral contra os antígenos do parasito, sendo que a hipersensibilidade retardada torna-se detectável sete dias após a dose de desafio (10 6), aumentando nas quatro semanas iniciais. Células recolhidas dos linfonodos respondem in vitro, ocorrendo transformação blástica e liberação de linfocinas. Estudos realizados com esse modelo experimental demonstraram, com clareza, a transferência de hipersensibilidade retardada para animais não imunizados (Doyle et al., 1974; Mauel, Behin & Noerjasi, 1973). A proteção pode ser detectada pela associação de infecção e quimioterapia (El-on, Witztum & Schnur, 1986) e estudos histopatológicos envolvendo a eliminação de L. (L.) enriettii têm sido realizados (Monroy et al., 1980).

A ocorrência de infecções naturais por L. (L.) enriettii foram raramente descritas, porém mais recentemente tem sido observada nos arredores de Curitiba, no município de Itaara no Rio Grande do Sul e no estado de São Paulo (Machado et al., 1994; Ecco et al., 2000; Luz, Giovannoni & Borba, 1967).

Lesões cutâneas por L. (L.) infantum

A espécie L. (L.) infantum Nicolle 1908, provoca no homem e no cão uma doença espectral, que varia de formas cutâneas localizadas, formas viscerais assintomáticas e formas viscerais extremamente graves (Bensaid et al., 2006; Carnauba et al., 2009; Gradoni & Gramiccia, 1994; Hatam, Hosseini & Ardehali, 1997). O cão é considerado um reservatório doméstico extremamente importante da L. (L.) infantum na China, nos países da bacia do Mediterrâneo e nas Américas, aparecendo em novas áreas endêmicas, altamente infectado com essa espécie de Leishmania, encontrada em diversos órgãos, em lesões cutâneas, bem como na pele íntegra (Cortada et al., 2004; Gradoni, 2001; Madeira et al., 2004). Uma das situações comuns é a que ocorre no campo, tanto aqui como em muitos outros países, onde o cão fica solto, muitas vezes no meio do gado, e é conhecido como “um cão perdido”, o que agrava os problemas de controle da epidemiologia das leishmanioses (Guerin et al., 2002). Podemos citar como exemplo os resultados obtidos com alta incidência de positividade como 80% em Marselha, na França, 67% em Majorca, na Espanha e 70% em Anastácio, Mato Grosso do Sul, Brasil, o que evidencia a importância epidemiológica do cão como reservatório dessa infecção (Cortada et al., 2004; Berrahal et al., 1996; Solano-Gallego et al., 2001).

A importância das investigações com L. (L.) infantum em modelos experimentais, tanto no cão quanto no hamster, é a de entender problemas que ocorrem nas infecções humanas e nos reservatórios domésticos. O cão constitui um excelente modelo para o estudo tanto da leishmaniose visceral quanto da leishmaniose tegumentar. Muitos aspectos dos sintomas que ocorrem nos cães são semelhantes àqueles que ocorrem em humanos e, assim, constituem um bom modelo para as leishmanioses. Devemos considerar como exceções a perda de pelos, o crescimento exagerado das unhas etc. (Peters & Killick-Kendrick, 1987). O progresso que tem sido obtido na leishmaniose canina poderá trazer uma grande ajuda nos avanços que tentamos obter nas investigações da leishmaniose humana. O grande problema que dificultou tal avanço foi a falta de marcadores imunológicos e reagentes para os cães, o que favoreceu uma extraordinária evolução na leishmaniose experimental no modelo murino (Solbach & Laskay, 2000). Recentemente, alguns progressos foram alcançados pela biologia molecular por meio da clonagem e do sequenciamento de muitas citocinas de cão, o que refletiu em importantes estudos sobre a imunologia, o desenvolvimento de vacinas e de várias técnicas de diagnóstico para a leishmaniose canina (Argyle et al., 1999; Devos et al., 1992; Pinelli et al., 1999; Quinnell et al., 2001; Reis et al., 2010).

A caracterização de linhagens de L. (L.) infantum com tropismo cutâneo tem sido feita utilizando-se um painel enzimático, apresentando 15 loci, que permite diferenciar dois grupos com zimodema Montpellier (MON I), característico de cepas tipicamente causadoras de leishmaniose visceral. Vários estudos mostraram que as cepas com características de um zimodema relacionado a formas cutâneas podem estar envolvidas com lesões nodulares, lesões ulceradas e lesões de mucosa. Os estudos baseados no polimorfismo genético de L. (L.) infantum têm sido obtidos com experimentos empregando a digestão do kDNA com endonucleases, e apontaram diferenças inquestionáveis entre cepas viscerotrópicas e cepas com tropismo cutâneo (Angelici, Gramiccia & Gradoni, 1989). A grande dificuldade de investigações comparando cepas viscerotrópicas com aquelas que apresentam tropismo cutâneo (Gradoni & Gramiccia, 1994; Hatam, Hosseini & Ardehali, 1997), é que estas cepas não infectam camundongos isogênicos (Pozio et al., 1985). Dessa forma, os estudos experimentais com L. (L.) infantum têm sido realizados sobretudo em cães (Travi et al., 2009). Uma das questões levantadas é se estamos tratando de tropismo de cepas de L. (L.) infantum ou de estados imunológicos dos hospedeiros.

 

Drogas imunossupressoras e seus

efeitos no curso das Leishmanioses

Um outro modelo experimental muito importante no estudo das leishmanioses é o do animal imunossuprimido. Nas últimas décadas, com o aumento dos casos de HIV, das cirurgias de transplante e dos tratamentos quimioterápicos contra o câncer, a importância desse modelo tem crescido muito. As leishmanioses são doenças oportunistas e a imunossupresão do hospedeiro pode levar a casos graves, com evolução bastante diferente daquela observada em hospedeiro imunocomptentes. Assim, formas viscerais assintomáticas no homem podem evoluir para formas sintomáticas de diferentes padrões de gravidade após algum efeito imunossupressor, dos quais o mais impactante tem sido as infecções concomitantes com o vírus HIV. Além disso, amplos estudos têm indicado que muitos casos com lesões cutâneas após uma infecção pelo vírus HIV evoluem para uma forma visceral. Finalmente, o tratamento de doenças com drogas imunossupressoras também determina modificações no curso dessas infecções espectrais como as leishmanioses (Motta et al., 2003).

Desse modo, diferentes autores têm investigado a ação de drogas imunossupressoras no curso de infecções por diferentes espécies de Leishmania. Nesse particular, temos amplas investigações sobre os efeitos da ciclosporina A (CsA), da ciclofosfamida e dos corticosteroides. A CsA é um metabolito extraído de fungos (Tolypocladium inflatum). Sendo um polipeptídeo de 11-aminoácidos, cíclico, lipofílico, altamente estável e insolúvel em água, vem sendo amplamente empregada em transplante de órgãos no homem desde o início dos anos 1980 pelas suas propriedades imunossupressoras. A CsA é capaz de inibir a formação de lesões causadas por L. (L.) tropica no modelo murino quando a linhagem BALB/c é empregada (Behforouz, Wenger & Mathison, 1986; Solbach, Forberg & Rollinghoff, 1986). Quanto a isso, devemos ressaltar que a CsA não tem nenhuma ação tóxica sobre as formas amastigotas. Trata-se de uma droga citotóxica, inibidora do primeiro sinal para ativação do linfócito T (Alvarez et al., 2004; Garcia et al., 2004). A CsA aumenta a expressão de TGF-β e inibe a produção de IL-2 por população e de células T, contribuindo assim para a inibição de diferentes fatores, incluindo γ-IFN, GM-CSF e CM-CSF. A CsA não é mielossupressora nas doses consideradas supressoras nos experimentos imunológicos desenvolvidos normalmente em vários laboratórios, sendo seus efeitos reversíveis após um período de terapia descontínua (Wong, Winslow & Cooper, 1993). É interessante salientar que outras investigações revelaram que doses diárias de CsA exacerbam a infecção por L. (L.) donovani em linhagens C57BL/10. Tal linhagem, quando recebe um desafio de 10 6 amastigotas por via intravenosa, controla a infecção após alguns meses (Adinolfi & Bonventre, 1990). Uma área cujas pesquisas ainda precisam de aprofundamento é a que se relaciona às investigações empregando CsA em diferentes linhagens de camundongos infectados com diferentes espécies de Leishmania.

Outra droga imunossupressora a ser enfatizada é a ciclofosfamida (CY), um agente alquilante derivado do gás mostarda (Turk, 1978) que foi introduzida na quimioterapia do câncer. Nos modelos experimentais de infecções, tem a propriedade de bloquear a ação de células T supressoras. Sua ação em diferentes infecções varia em função do tempo de sua aplicação, que tem sido feita inclusive antes ou depois do desafio com o agente infeccioso (Zaverucha do Valle et al., 2007; Gonçalves da Costa, Santos & Lagrange, 1988). Tal ação é semelhante à que se obtêm com uma dose de irradiação subletal de Raios X (550 rad) poucas horas antes da infecção (Ulczak & Blackwell, 1983). Em infecções por L. (L.) enriettii em cobaias, o tratamento com elevada dose (300mg/kg) de ciclofosfamida três dias antes da infecção gera lesões muito maiores e um prolongamento do processo inflamatório, o que determina a cicatrização muito mais tardiamente se comparada à lesão do grupo-controle (Turk & Belehu, 1974).

A cortisona tem contribuído para o agravamento das infecções por Leishmania, pois está envolvida em tratamento de diferentes doenças e vem sendo administrada como rotina na clínica médica. Nos últimos 25 anos essa droga tem aumentado de forma extraordinária os casos assintomáticos de leishmaniose visceral, tanto no Mediterrâneo quanto na América do Sul (Pittalis et al., 2006). Outro fato que precisa ser enfatizado é o que diz respeito à ocorrência de reativação da infecção por tratamento sistêmico com corticosteroide, após um longo período de tratamento encerrado com ‘cura clínica’ (Tuon et al., 2007). Além disso, formas mucocutâneas disseminadas pelo uso crônico de corticosteroide vêm sendo registradas na literatura (Motta et al., 2003). Ensaios experimentais no modelo murino determinam uma depressão dos linfócitos circulantes, bem como o sequestro de linfócitos periféricos na medula óssea (Cohen, 1972). O emprego da cortisona antes da imunização com um antígeno mostra um efeito depressivo na hipersensibilidade retardada e suprime a síntese de imunoglobulinas, especialmente o tipo 7S (Elliott & Sinclair, 1968). Observou-se que a cortisona é capaz de influenciar os linfócitos de vida curta e nos casos em que a expressão da imunidade celular estava estimulada pelo BCG, o tratamento pela cortisona bloqueou os efeitos de proteção induzidos pelo próprio BCG (Smrkovski, Reed & Larson, 1980). Em resumo, podemos dizer que a cortisona no modelo murino induz a uma diminuição de linfócitos circulantes, o que determina a liberação de novos linfócitos da medula óssea. O efeito da cortisona na resposta mediada por células atua, em parte, pelos efeitos que atingem o sistema fagocítico mononuclear (Rinehart et al., 1975). O macrófago, principal célula onde reside a Leishmania, constitui-se no maior produtor de IL-12. Assim, após a infecção por Leishmania, ela começa a sobreviver em virtude do baixo nível de produção de γ-IFN. Complementando esses fatores que favorecem a proliferação dos amastigotas, teremos em consequência a falta de ativação do macrófago e a produção insuficiente de NO, cuja molécula é considerada fundamental para matar os amastigotas de Leishmania.

 

Comentários finais e perspectivas

O conhecimento que se tem atualmente sobre os modelos experimentais nas leishmanioses, tem sido enriquecido com o emprego de imunomoduladores, objetivando-se sobretudo estabelecer mecanismos de resistência. Temse evidenciado que a estimulação de uma resposta Th1 e o envolvimento do γ-IFN é um caminho-chave para a resolução das lesões por Leishmania. Assim, as investigações com o modelo murino desenvolvido com L. (L.) major estabeleceram o conceito de que a linhagem BALB/c é sensível e que os camundongos C57BL/6 são resistentes às infecções experimentais com Leishmania.

Os resultados obtidos com L. (L.) amazonensis têm demonstrado que o C57BL/6 é sensível às infecções, com uma característica bastante interessante: após seis meses de infecção ocorre uma retração da primoinfecção, dando a impressão de que, passado certo tempo, haveria indícios de cura. Entretanto, a infecção segue com uma expansão extraordinária e metástases generalizadas, podendo advir a amputação da pata da primoinfecção. Lesões metastáticas na região nasal, com a ocorrência de muitos macrófagos parasitados, indicam que esse caso pode ser considerado um excelente modelo para estudos de lesões mucocutâneas. Além disso, tem-se observado a invasão da medula óssea, com a ocorrência de macrófagos altamente infectados (Cupolilo et al., 2003). Percebemos, assim, que a ideia de que a linhagem C57BL/6 é resistente tem de ficar restrita aos experimentos com L. (L.) major. O conceito de que a maioria dos camundongos singênicos, como C3H/HeN, CBA, C57BL/6, entre outros, resolvem espontaneamente as lesões (resistentes), é um problema limitado à leishmaniose cutânea do Velho Mundo (Milon, Del Giudice & Louis, 1995).

Como perspectiva para as investigações, faz-se necessário conduzir experiências a médio e longo prazos, investigando sob o ponto de vista tanto imunológico quanto imunopatológico os modelos experimentais com L. (L.) amazonensis. Isso, para que possamos ter ideia dos graves problemas que ela vem trazendo há anos no Novo Mundo, e que agora traz um novo nível de preocupação em razão da expansão de novas áreas epidemiológicas e dos casos de associação das leishmanioses com infecções concomitantes. Nesse último caso, a associação com o vírus HIV tem se expandido, necessitando de estudos imediatos.

 

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