3. Ultraestrutura de Parasitos do Gênero Leishmania

3. Ultraestrutura de parasitos

do gênero Leishmania

Camila Guerra Silva, Roger Magno Macedo Silva, Vanessa Alvaro Diniz, Suzana Côrte-Real

Os protozoários do gênero Leishmania são parasitos digenéticos pertencentes à ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae. Esse parasito tem duas formas principais distintas: promastigota, encontrada no trato digestório do inseto vetor (Família – Phlebotominae) e amastigota, parasito intracelular obrigatório encontrado em hospedeiros vertebrados. Promastigotas são alongados, apresentando longo flagelo livre emergindo da região anterior do parasito e extremidade posterior mais afilada. Seu tamanho é variável, medindo entre 1,5–3 µm de largura x 16–40 µm de comprimento, incluindo o flagelo que normalmente tem tamanho

igual ou superior ao corpo do parasito (Figura 1A). O núcleo é arredondado ou oval e está localizado na região mediana da célula, enquanto o cinetoplasto está situado entre a extremidade anterior e

o núcleo, próximo à bolsa flagelar (Figura 1B). Entretanto, os amastigotas são ovoides ou esféricos, com flagelo curto e interiorizado na bolsa flagelar. O tamanho dos amastigotas varia de acordo com a espécie do parasito, medindo entre 1,5-3 µm x 3-6,5 µm de diâmetro. O núcleo é arredondado, ocupando cerca de um terço do corpo do parasito, estando o cinetoplasto localizado

próximo à bolsa flagelar (Figura 2).

Figura 1A – Microscopia eletrônica de varredura: promastigota de Leishmania (L.) amazonensis mostrando sua forma afilada e os

longos flagelos emergindo da bolsa flagelar

Figura 1B – Microscopia eletrônica de transmissão: promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis formando a tradicional roseta em

cultura axênica. Uma delas apresenta dois núcleos (N), indicando o

início da divisão celular

Figura 2 – Microscopia eletrônica de transmissão: amastigotas ( ) * de Leishmania (L.) amazonensis intracelulares com morfologia

arredondada, flagelo (F) curto localizado na bolsa flagelar, núcleo

(N) e cinetoplasto (K)

 

O estudo da estrutura das formas evolutivas da Leishmania, desde sua descoberta, tem sido feito com a utilização de colorações (segundo o método Romanowsky: Leishman, May-Grunwald, Giemsa e Wright; e o método Panótico) e posterior observação em microscópio óptico, pela qual é possível distinguir as duas formas evolutivas – promastigota e amastigota – basicamente pela presença ou não de flagelo aparente, e a forma do corpo do parasito – alongado ou ovalado, respectivamente (Nacy & Diggs, 1981; Naderer & McConville, 2008; Chang, 1978).

Aspectos ultraestruturais da

leishmania

 

Membrana plasmática

As células dos seres vivos são envolvidas pela membrana plasmática. Esta desempenha importante papel de separação entre o ambiente extracelular e o intracelular, e atua de forma seletiva e específica interligando esses dois compartimentos.

Os parasitos do gênero Leishmania apresentam um denso glicocálix composto por várias moléculas localizadas na superfície externa da membrana plasmática, presas por meio de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Dentre elas estão as lipofosfoglicanas (LPG) (McNeely & Turco, 1990; Lang et al., 1991); as proteofosfoglicanas (PPGs) (Ilg, Handman & Stierhof, 1999); as glicoproteínas 63 (gp63) (Chaudhuri & Chang, 1988; Chaudhuri et al., 1989); e os glicosilinositolfosfolipídeos (GIPLS) (Orlandi & Turco, 1987), sendo a gp63 e a LPG as moléculas mais estudadas. Quando ocorre a conversão para a mudança de promastigota para amastigota, essas moléculas apresentam perfil de permanência na membrana.

A LPG é o principal glicoconjugado presente na superfície de parasitos do gênero Leishmania (Ilg, 2001). Os promastigotas expressam uma grande quantidade de LPG em sua superfície (cerca de 1-5x106 cópias por célula), estando distribuídos por toda a superfície do parasito, incluindo flagelo. Entretanto, os amastigotas expressam um número significativamente menor, cerca de 100-1.000 cópias por célula (Turco, 1990). A gp63 é uma metaloproteinase ancorada por GPI, distribuída de forma homogênea na superfície dos promastigotas e concentrada majoritariamente na bolsa flagelar dos amastigotas (Medina-Acosta et al., 1989).

Enzimas presentes na membrana plasmática são amplamente estudadas, seja por métodos bioquímicos ou por citoquímica ultraestrutural. Dentre elas, destacamos a 3’e 5’-nucleotidase

(Figura 3), que são enzimas utilizadas por esses parasitos na obtenção de nucleotídeos, uma vez que não fazem “síntese ‘de novo’” (Dwyer & Gottlieb, 1984; Côrte-Real et al., 1993). Também é possível detectar a Mg ++ ++ ATPase e a CaATPase, sendo esta última importante na obtenção do cálcio do meio externo, seja ele oriundo do meio axênico ou do trato digestório (promastigotas) ou da célula hospedeira, quando os amastigotas estão localizados no vacúolo parasitóforo (Côrte-Real, Santos & Meirelles, 1995). A ATP difosfohidrolase também está presente na membrana de Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonensis (Rezende-Soares et al., 2010; Coimbra et al., 2002).

Figura 3 – Citoquímica ultraestrutural: promastigota de

Leishmania (L.) mexicana apresentando material eletrondenso na

superfície da membrana plasmática, indicando reação positiva para

a enzima 5´-nucleotidase

 

Por meio da técnica de criofratura foi possível observar diferenças na distribuição de proteínas integrais, denominadas como partículas intramembranosas, e a agregação destas partículas em regiões especializadas na membrana da Leishmania (Benchimol & De Souza, 1980). A diferença na distribuição de tais partículas reflete a variação da composição e função das proteínas de membrana. A densidade de tais partículas pode variar de acordo com a forma evolutiva do parasito (Pimenta & De Souza, 1987), sendo possível observar que a membrana que recobre os promastigotas é mais rica em proteínas integrais que a membrana dos amastigotas. Além disso, foi possível verificar que a bolsa flagelar e a membrana do flagelo apresentam uma quantidade menor de partículas intramembranosas quando comparadas ao corpo do parasito. A presença de grupos de partículas intramembranares, descritas como regiões especializadas da membrana, foram observadas na área de adesão do flagelo ao corpo do parasito, formando as zonas de adesão flagelar (Pimenta & De Souza, 1987). No entanto, na região da membrana próxima à abertura da bolsa flagelar foi encontrado um domínio especializado com alta concentração de proteínas integrais (Snapp & Landfear, 1999).

 

Citoesqueleto

O citoesqueleto da Leishmania apresenta um arranjo de microtúbulos subpeliculares (MT) que correm paralelamente ao

longo do eixo do corpo (Figura 4), sendo responsáveis pela manutenção da forma do parasito durante as fases de diferenciação no seu ciclo de vida (Woods, Baines & Gull, 1992; Kohl & Gull, 1998). Esses microtúbulos medem cerca de 150-200 Å de diâmetro, são constituídos de heterodímeros de α e β-tubulina repetidos, ligados uns aos outros por proteínas associadas a microtúbulos – MAPs (Sasse & Gull, 1988).

Figura 4 – Promastigota de Leishmania (V.) braziliensis mostrando

microtúbulos subpeliculares (MT) localizados abaixo da membrana

plasmática

 

Além dos microtúbulos subpeliculares, a Leishmania apresenta outros componentes do citoesqueleto, entre eles a actina. Ela está distribuída de maneira uniforme no corpo do parasito, estando presente no flagelo, na bolsa flagelar, no núcleo (lâmina nuclear) e no cinetoplasto, mas também na face citoplasmática da membrana plasmática. Essa proteína está principalmente associada ao polo apical do corpo do parasito e no ponto de fixação do flagelo com o corpo basal (Sahasrabuddhe, Bajpai & Gupta, 2004).

Bolsa flagelar e flagelo

A porção anterior do corpo da Leishmania apresenta uma invaginação da membrana plasmática conhecida como bolsa flagelar (BF), e desta emerge o flagelo. A membrana plasmática presente no corpo do parasito estabelece continuidade com a membrana do flagelo, mantendo características proteicas próprias de ambas. A membrana que reveste a bolsa flagelar é especializada, sendo o local onde ocorre o processo de endocitose de nutrientes desses parasitos, já que é a única região do corpo onde não são encontrados microtúbulos subpeliculares (Field et al., 1998). Próximo ao cinetoplasto (K) está localizado o corpúsculo basal (CB), formado somente por nove pares de microtúbulos periféricos e intimamente ligado à base dos microtúbulos do flagelo.

(Figura 5). Todavia, o flagelo da Leishmania é constituído por um axonema formado por nove pares de microtúbulos concêntricos e um par central. Ao longo do flagelo pode ser observada uma estrutura complexa conhecida como estrutura paraflagelar ou corpo

paraxial (Figura 6). O corpo paraxial é formado por um arranjo de filamentos proteicos conectados aos pares de microtúbulos 4 e 7 do axonema (De Souza, 1995; Foth et al., 2002). O flagelo desses parasitos está envolvido em diversas funções, como motilidade e adesão às células-alvo. A Leishmania é um parasito extremamente móvel, sendo capaz de mover-se cerca de 10-30 µm por segundo em meio de cultura, através do movimento de onda realizado pelo flagelo (sempre da ponta para base), puxando desta forma o corpo do parasito (Santrich et al., 1997).

Figura 5 – Corpúsculo basal (CB) pode ser visualizado próximo à

base da bolsa flagelar (BF). Ao longo do flagelo (F) podem ser vistos

os microtúbulos e a formação do axonema formado por nove pares

de microtúbulos concêntricos e um par central (insert)

Figura 6 – No corte transversal do flagelo (F) observamos uma

estrutura complexa conhecida como estrutura paraflagelar ou corpo

paraxial (*)

 

Retículo endoplasmático e complexo de Golgi

Por todo o corpo dos parasitos do gênero Leishmania são encontrados perfis tubulares do retículo endoplasmático (RE). Entretanto, ele é por vezes visualizado logo abaixo dos microtúbulos subpeliculares (Pimenta & De Souza, 1985), formando assim uma

tríade, juntamente com a membrana plasmática (Figura 7).

Figura 7 – Micrografia eletrônica mostrando perfis tubulares do

retículo endoplasmático (RE) próximo aos microtúbulos

subpeliculares

 

As organelas envolvidas no transporte de moléculas do retículo endoplasmático para a bolsa flagelar são encontradas agrupadas na extremidade anterior da célula, enquanto as regiões do retículo endoplasmático que apresentam intenso brotamento de vesículas ficam localizadas próximas ao complexo de Golgi (CG). Na Leishmania, ele tem estrutura similar à observada em células de mamíferos, sendo encontrado entre o núcleo e cinetoplasto na

região anterior do parasito (Figura 8). Estudos citoquímicos têm demonstrado a participação do complexo de Golgi no processo de glicosilação de glicoconjugados (Clayton, Häusler & Blattner, 1995).

Figura 8 – Nos parasitos do gênero Leishmania, o complexo de

Golgi (CG) é formado por cisternas e está entre o núcleo e

cinetoplasto na região anterior do parasito

 

Via endocítica

A endocitose em Leishmania pode ser observada tanto em promastigotas quanto em amastigotas, no processo de nutrição e evasão do sistema imune. O processo de endocitose/exocitose de macromoléculas ocorre na região da bolsa flagelar, que não apresenta microtúbulos subpeliculares. Proteínas de membrana são endocitadas e posteriormente encaminhadas ao sistema endolisossomal, por meio de um processo dependente de clatrina (Weise et al., 2000). A presença de proteínas que participam da via endocítica como a clatrina, Rab5, receptores de transferrina e de hemoglobina indicam que o processo de endocitose é mediado por receptores em Leishmania (Voyiatzaki & Soteriadou, 1992; Singh et al., 2003).

Diversas estruturas da via endocítica foram identificadas em promastigotas de Leishmania, dentre elas: corpos multivesiculares,

estruturas tubulares e túbulos multivesiculares (Figura 9). Os corpos multivesiculares são estruturas com cerca de 200-300 nm de diâmetro, arredondadas, limitados por membrana e com conteúdo elétron-lucentes. As estruturas tubulares são constituídas de aglomerados de túbulos regulares conectados uns aos outros com 60 nm de diâmetro, localizadas próximo ao complexo de Golgi e da bolsa flagelar (Weise et al., 2000). Os túbulos multivesiculares são observados desde a região anterior até a região posterior do corpo do parasito, sendo a organela final da via endocítica. São caracterizados como grandes túbulos limitados por membrana contendo uma série de pequenas vesículas de tamanho e formas distintos, medindo cerca de 100-200 nm de diâmetro (Weise et al., 2000; Ghedin et al., 2001). Além de ser o compartimento final da via endocítica de promastigotas e Leishmania, os túbulos multivesiculares são o local de acúmulo de proteínas e lipídeos ingeridos pelo parasito. No citoplasma da Leishmania são observadas organelas contendo lipídeos, estando dispersas por

todo o citoplasma (Figura 10).

Figura 9 – Estruturas tubulares e vesículas (setas) participando no

processo de endocitose podem ser visualizadas na bolsa flagelar

(BF) de amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis

Figura 10 – Micrografia eletrônica de Leishmania (V.) braziliensis

mostra organelas eletrondensas, contendo lipídeos (L), dispersas no

citoplasma

 

Em amastigotas, a via endocítica é utilizada como mecanismo de escape do sistema imune do hospedeiro, mediante a ingestão e degradação de moléculas como MHC Classe II e cofatores, evitando assim a apresentação antigênica (Antoine et al., 1999). As moléculas endocitadas por meio da bolsa flagelar são encaminhadas aos megassomos (MG), organela final da via endocítica em amastigotas (Alexander & Vickerman, 1975).

Megassomos

Formas amastigotas de Leishmania apresentam uma organela circundada por uma membrana, contendo em seu interior vesículas eletrondensas imersas em uma matriz heterogênea, o megassomo

(Figura 11). Ela pode variar em tamanho e número, podendo ser maior que o núcleo. O megassomo tem como característica a presença de enzimas, fosfatase ácida e cisteína-proteinase em suas vesículas (De Souza, Sant’Anna & Cunha-e-Silva, 2009). Em promastigotas metacíclicas de Leishmania (L.) chagasi foram descritas estruturas tubulares e multivesiculares, apresentando enzimas características de lisossomos (Alberio et al., 2004).

Figura 11 – Megassomos (MG), organelas da via endocítica

(cabeça de seta) são observadas em amastigotas Leishmania (L.)

amazonensis. Estas organelas apresentam em seu interior vesículas

eletrondensas (seta) imersas na matriz (insert)

 

Glicossomas

Inicialmente, organelas presentes em alguns tipos celulares, contendo dois tipos de enzimas – catalase e H O – produzindo 2 2 oxidases, foram denominadas peroxissomos. Entretanto, em tripanossomatídeos também foi descrito, no citoplasma desses parasitos, uma organela esférica circundada por uma membrana, com diâmetro aproximado de 0.7 µm, com matriz pouco densa e homogênea e contendo um cristaloide no seu interior, sendo então denominada de glicossoma (De Souza, 2002).

 

Acidocalcissoma

Há quase cem anos, organelas com conteúdo ácido e contendo grande quantidade de cálcio foram identificadas como grânulos de volutina (Vercesi, Moreno & Docampo, 1994). Essas organelas, quando estudadas em tripanossomatídeos e Apicomplexa, receberam uma nova denominação, sendo então chamadas de acidocalcissomas (Docampo & Moreno, 1999). Elas foram caracterizadas como organelas ácidas que armazenam cálcio, apresentando alta densidade de elétrons e alto teor de polifosfatos, além de magnésio e outros elementos (Docampo & Moreno, 1999; Scott et al., 1997; Vannier-Santos et al., 1999). Os acidocalcissomas são delimitados por uma única membrana, podendo apresentar morfologia esférica, alongada ou polimórfica, e estão distribuídos

randomicamente pela célula (Figuras 1B e 12). Ele apresenta conteúdo eletrondenso que varia de acordo com o procedimento utilizado nas preparações das amostras por métodos convencionais. O material eletrondenso pode ser removido, deixando um fino anel abaixo da membrana ou dando-lhes a aparência de vacúolos vazios. Em alguns tripanossomatídeos, o material denso aparece em um dos lados da membrana como uma inclusão, o que levou à sua denominação como vacúolos de inclusão (Docampo et al., 2005; Moreno & Docampo, 2009; Vickerman & Tetley, 1977). Em promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, os acidocalcissomas foram observados distribuídos por todo o corpo,

apresentando as características mencionadas anteriormente (Figura

12). Entretanto, a melhor preservação do material eletrondenso do acidocalcissoma é obtida por congelamento e ultracriomicrotomia, no qual todos os acidocalcissomas parecem ser completamente preenchidos (Scott, Docampo & Dvorak, 1997).

Figura 12 – Por microscopia eletrônica de transmissão podemos

visualizar organelas com conteúdo eletrondenso, distribuídas no

citoplasma de Leishmania (L.) amazonensis

 

Mitocôndria e cinetoplasto

Os parasitos do gênero Leishmania têm mitocôndria única, que percorre todo o corpo do parasito, apresentando dupla membrana, sendo a membrana interna formadora das cristas mitocondriais geralmente paralela à membrana externa. Na porção mitocondrial

próxima à base do flagelo está presente o cinetoplasto (Figura 13). O cinetoplasto é a região que possui o mais complexo DNA mitocondrial encontrado na natureza. Ele está presente em flagelados unicelulares da ordem Kinetoplastida. Ele é conhecido como uma rede de milhares de DNAs circulares catenados, o k-DNA. Os círculos de k-DNA são de dois tipos, maxicírculos que geralmente têm tamanho de intervalo entre 20-40 kb, dependendo da espécie, e estão presentes em algumas dezenas de cópias idênticas por rede e, minicírculos, presentes aos milhares de exemplares por rede, geralmente são quase idênticos em tamanho 0,5 a 10 kb, dependendo da espécie, mas são heterogêneos na sequência. Os maxicírculos codificam produtos de genes mitocondriais típicos (r-RNAs) e subunidades complexas da cadeia respiratória, mas, curiosamente, alguns dos genes codificadores de proteínas são criptografados (Lukes et al., 2002).

Figura 13 – Micrografia eletrônica mostrando mitocôndria única

apresentando dupla membrana, com cristas mitocondriais formadas

pela membrana interna. Na porção mitocondrial próxima à base do

flagelo observamos o cinetoplasto (complexo DNA mitocondrial) em

forma de bastão

 

Núcleo

Os protozoários do gênero Leishmania apresentam núcleo arredondado, ocupando a região central do corpo do parasito e nucléolo central, com uma organização estrutural similar ao de outras células eucarióticas. A heterocromatina forma uma rede, conectando-se com a lâmina nuclear e esta com a membrana interna do envoltório. A membrana externa é proveniente do retículo endoplasmático e apresenta polirribossomos aderidos. O envelope nuclear contém inúmeros complexos do poro nuclear, que abrangem as membranas interna e externa e são morfologicamente indistinguíveis do envelope nuclear de outros eucariotos. O tamanho e o número de cromossomos é variável, conforme a espécie da Leishmania (Pagès et al., 1989).

 

Conclusão e perspectivas

A observação desses parasitos, utilizando metodologias que preservassem suas organelas e estruturas e que pudessem ser visualizados na amplitude de seus detalhes, levou ao estudo ultraestrutural utilizando a microscopia eletrônica. Para isso, são utilizadas técnicas convencionais de inclusão e/ou técnicas avançadas de congelamento e criofratura, citoquímica e imunocitoquímica. Essas demonstram a organização de componentes celulares, a presença de moléculas importantes para o ciclo de vida da Leishmania e a presença de receptores de superfície utilizados no reconhecimento da célula-alvo (Benchimol & De Souza, 1980; Weise et al., 2000; De Souza, 2002).

O estudo morfológico ultraestrutural da Leishmania tem sido amplamente avaliado com o objetivo de detectar mudanças expressivas, principalmente quando acontece a conversão da forma promastigota para amastigota, a divisão celular de ambas, o momento fugaz da troca genética (Sousa, Pereira & Côrte-Real, 1997), ocorrendo a formação de híbridos, o estudo das organelas e a participação da membrana plasmática na interação com as célulaalvo (Hespanhol et al., 2005; Guerra et al., 2010), sejam elas do inseto vetor ou de mamíferos.

 

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