Parte I – Questões Evolutivas, Taxonômicas e Ultraestruturais de Parasitos do Gênero Leishmania

Parte I - Questões evolutivas,

 

taxonômicas e ultraestruturais

de parasitos do gênero

Leishmania

 

1. Diversidade genética em

parasitos do gênero

Leishmania: uma abordagem

molecular

Raquel S. Pacheco, Filipe A. Carvalho-Costa

 

Diversidade genética inter e

intraespecífica em leishmania

Dentre os gêneros de protozoários parasitas do homem, Leishmania (Ross, 1903) é provavelmente aquele que abrange o maior número de espécies patogênicas. Espécies diferentes de Leishmania foram identificadas inicialmente com base em apresentações clínicas distintas (visceral, cutânea, cutânea difusa, mucocutânea), em situações epidemiológicas particulares, em características biológicas e em distribuições geográficas específicas. Dois subgêneros (Leishmania e Viannia) foram definidos pelas diferenças observadas em relação aos sítios anatômicos de desenvolvimento dos parasitos no tubo digestivo dos insetos vetores (Lainson & Shaw, 1987). Nesse sentido, o subgênero Viannia é restrito ao Novo Mundo, enquanto Leishmania (Leishmania) circula no Novo Mundo e no Velho Mundo (Kerr, 2000).

Verificar se todas as espécies de Leishmania descritas representam realmente unidades taxonômicas discretas (DTUs – sigla em inglês para Discrete Typing Unity), terminologia introduzida por Michel Tibayrenc no fim dos anos 90 (Tibayrenc, 1998), ou seja, conjuntos de isolados mais geneticamente relacionados entre si do que a quaisquer outros – identificáveis por meio de marcadores genéticos específicos, aplicados em estudos de abordagem interespecífica – é ainda um dos desafios em genética das leishmanioses. Como segundo desafio, este em nível intraespecífico, está a caracterização de DTUs capazes de subdividir determinado táxon, demonstrando as possibilidades de uma determinada espécie de Leishmania ser ‘estruturada’ ou ‘não estruturada’. A estruturação de DTUs capazes de subdividir espécies de Leishmania poderia ser explicada por dois mecanismos: evolução clonal e especiação críptica.

Como revisto por Bañuls, Hide e Tibayrenc (1999), as ferramentas utilizadas para identificar DTUs (ou para rejeitar sua existência) são: (i) a genética populacional, capaz de avaliar, em um corte pontual no tempo, a individualização de populações e a presença de fluxo gênico entre elas; e (ii) a análise filogenética, que tem como objetivo reconstruir o passado evolutivo (ou microevolutivo, como normalmente realizado em epidemiologia molecular e genética evolutiva de patógenos) de uma espécie. Nesse sentido, estudos iniciais (Tibayrenc, Kjellberg & Ayala, 1990; Jimenez, Alvar & Tibayrenc, 1997) utilizando como metodologia a eletroforese de multilocos enzimáticos testaram as seguintes hipóteses: (i) os genótipos determinados pela análise dos padrões de migração eletroforética de isoenzimas seriam ‘instáveis’ (ou seja, não se propagariam) devido à recombinação genética não podendo, portanto, ser usados como marcadores genéticos; (ii) os genótipos se propagariam como ‘cópias’ genéticas e, dessa forma, poderiam ser usados como marcadores genéticos. Como marcadores genéticos, entendemos quaisquer diferenças detectáveis ao nível do DNA cujo padrão de transmissão de geração para geração possa ser identificado. Confrontadas, tais hipóteses estão na base do debate sobre sexualidade versus clonalidade em genética evolutiva de microrganismos, de forma que, na primeira hipótese, estaríamos diante de uma espécie com comportamento sexual, ‘praticando fluxo gênico’ e, na segunda, perante um patógeno que se propagaria sob a forma de clones que são cópias daquele que lhes originou. Neste último caso, encontraríamo-nos diante da estruturação da população de parasitos e a espécie poderia ser subdividida em DTUs entre as quais não ocorrem trocas genéticas, ou ocorreriam como eventos esporádicos e raros (Tibayrenc & Ayala, 2002).

Cabe ressaltar que a segunda possibilidade é a que tem prevalecido nos estudos em taxonomia molecular do gênero Leishmania (Tibayrenc & Ayala, 2002). Tais discussões despertaram grande interesse dos pesquisadores envolvidos com a epidemiologia molecular e a genética em leishmanioses, uma vez que a diversidade das populações parasitárias poderia influenciar a evolução e a distribuição de caracteres relacionados à virulência, à resistência às drogas e à infectividade (Miles et al., 2009). Novas técnicas para estudo da variabilidade genética inter e intraespecífica no gênero Leishmania têm sido capazes de identificar (ou agrupar) diferentes espécies e distintos genótipos para determinadas espécies. Em comum entre essas metodologias está o emprego de técnicas baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) (Saiki et al., 1995). A PCR tem representado, também, importante ferramenta diagnóstica para as leishmanioses, com crescente aplicabilidade clínica e epidemiológica.

Partindo-se das observações sobre diversidade genética intraespecífica, podemos admitir que os parasitos do gênero Leishmania circulem em humanos, reservatórios e vetores como um conjunto de subpopulações heterogêneas (Tibayrenc, Kjellberg & Ayala, 1990). Dessa forma, tem sido proposto que determinados clones poderiam propagar-se com maior ou menor sucesso em áreas endêmicas e que distintos graus de endemicidade poderiam estar associados a uma maior ou menor diversidade de clones circulando na natureza, refletindo situações epidemiológicas mais simples ou de maior complexidade (Pacheco et al., 1986). Alguns clones, naturalmente, obteriam vantagens evolutivas ao serem selecionados por ‘filtros’ biológicos em reservatórios e vetores. Desses filtros emerge a geração endógena de novos polimorfismos, em um mecanismo adaptativo constante e dinâmico relacionado às pressões seletivas (Pacheco et al., 1995), podendo ser reversível (Lee, Tarn & Chang, 1993). A circulação, na natureza, de subpopulações parasitárias heterogêneas, traz a possibilidade de infecção por inóculos policlonais que estarão submetidos à pressão imune exercida pelo hospedeiro, em um processo que poderá levar à seleção clonal. Dentro desse contexto, a heterogeneidade clonal em isolados humanos e reservatórios silvestres foi evidenciada (Pacheco et al., 1990; Saravia et al., 1990).

Cenários ecoepidemiológicos distintos possivelmente são também capazes de influenciar a variabilidade genética de populações de Leishmania. Em regiões hiperendêmicas, situações epidemiológicas mais complexas podem possibilitar a circulação das populações parasitárias em um maior número de espécies de vetores e reservatórios, que representariam fontes de heterogeneidade, dentro da dinâmica da interação parasito-hospedeiro.

 

Marcadores moleculares empregados

na avaliação da diversidade genética

em Leishmania

 

Eletroforese de multilocos enzimáticos (MLEE,

sigla em inglês para Multilocus Enzyme

Electrophoresis)

O estudo de polimorfismos em enzimas que atuam nas vias metabólicas foi, como relatado anteriormente, a primeira metodologia empregada para caracterizar isolados de Leishmania (Momen, 1984). Por meio dessa técnica, graus variáveis de diversidade têm sido demonstrados entre as diferentes espécies do gênero. Deve-se ter em mente que a análise de padrões eletroforéticos de enzimas reflete de maneira indireta variações (polimorfismos) ao nível genômico. Isolados distintos de parasitos que apresentam padrões semelhantes são agrupados em zimodemas. A sensibilidade da técnica em identificar a diversidade genética existente entre cepas de Leishmania pode ser aumentada utilizando-se um maior número de enzimas. Entre as enzimas mais frequentemente utilizadas nas análises isoenzimáticas, podemos citar aconitato hidratase, glicose-6-fosfato-desidrogenase, glicose-fosfato-isomerase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase, enzima málica, nucleotidase, peptidase (L-prolina), aldolase fosfoglicomutase e 6-fosfoglico-desidrogenase. As diferenças nas posições das bandas produzidas nos géis de eletroforese são resultado das mobilidades distintas apresentadas pelas enzimas, ocasionadas por polimorfismos nos genes que as codificam. As bandas podem então ser numeradas e os perfis (eletromorfos) submetidos à análise numérica com o intuito de se agrupar as amostras em zimodemas. Embora permaneça sendo considerado o método padrão para a identificação de espécies no gênero Leishmania (Rioux et al., 1990; Momen et al.,1985; Grimaldi et al., 1991; Thomaz-Soccol et al., 1993; Cupolillo, Grimaldi & Momen, 1994; Cupolillo et al., 2000), a técnica apresenta como principal fator limitador a necessidade de que os parasitos sejam previamente cultivados, procedimento que em muitas ocasiões não é factível. Além disso, embora as isoenzimas sejam consideradas marcadores seletivamente neutros, o grau de polimorfismo enzimático é limitado, pois tais enzimas desempenham funções metabólicas cujas características não poderiam ser alteradas sob risco de inviabilização das atividades de respiração celular. Sendo assim, além do número de loci examinados ser limitado, pode-se não identificar polimorfismos para um ou mesmo vários dos loci isoenzimáticos disponíveis. Isso pode limitar ainda mais o poder discriminatório da metodologia. Não obstante, a vantagem da MLEE reside no fato de que os alelos isoenzimáticos são codominantes, isto é, genótipos homozigóticos e heterozigóticos de um determinado lócus são facilmente identificados. Essa vantagem permite estimar parâmetros tais como frequências genotípicas, frequências alélicas e, com base nestes, desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg em um lócus ou do equilíbrio de ligação gamética entre loci (Weir, 1990).

Como revisto recentemente (Schönian, Kuhls & Mauricio, 2011), por intermédio da MLEE, os parasitos do gênero Leishmania puderam ser classificados em complexos dentro do subgênero Leishmania: (i) complexo L. donovani, que inclui L. (L.) donovani, L. (L.) archibaldi e L. (L.) infantum (syn. L. (L.) chagasi); (ii) complexo L. tropica, que inclui L. (L.) tropica, L. (L.) killicki e L. (L.) aethiopica; (iii) complexo L. major, que inclui L. (L.) major, L. (L.) gerbilli, L. (L.) arabica e L. (L.) turanica; e (iv) complexo L. mexicana que inclui L. (L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (L.) aristidesi, L. (L.) venezuelensis e L. (L.) forattinii, além de L. (L.) enriettii fora destes complexos. Dentro do subgênero Viannia, distinguem-se (i) complexo L. braziliensis incluindo L. (V.) braziliensis e L. (V.) peruviana e (ii) complexo L. guyanensis, incluindo L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) shawi, além das espécies L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni, L. (V.) lindenbergi e L. (V.) utingensis, não pertencentes a estes complexos. Não classificadas em nenhum dos dois subgêneros, estariam L. colombiensis, L. equatorensis, L. hertigi, L. herreri e L. deanei.

 

Polimorfismo de tamanho de fragmentos de

restrição (RFLP, sigla em inglês para Restriction

Fragment Length Polymorphism)

A técnica RFLP baseia-se na digestão do DNA parasitário pelas denominadas ‘enzimas de restrição’, que são capazes de reconhecer e clivar a fita dupla da molécula de DNA em sítios específicos. Essas endonucleases identificam sequências nucleotídicas específicas, clivando a dupla fita de DNA nos sítios palindrômicos de reconhecimento (Nathans & Smith, 1975). Como produto da digestão do material genético, fragmentos de DNA de tamanhos distintos serão obtidos e visualizados através de eletroforese. Na presença de polimorfismos nas sequências nucleotídicas (e, portanto, de diversidade genética entre os isolados), as enzimas de restrição deixarão de reconhecer alguns sítios de clivagem gerando-se assim perfis eletroforéticos diferentes. A técnica de RFLP, quando comparada à MLEE, apresenta como vantagem o potencial de avaliar todo o genoma do organismo estudado. Os marcadores baseados em RFLP possuem expressão codominante, de forma que permite discriminar genótipos homozigotos e heterozigotos. A técnica aumenta, portanto, a probabilidade de se identificar associações entre marcadores e genes que controlam determinada característica de interesse (Tanksley et al., 1992).

Como aplicações práticas da técnica de RFLP do kDNA (DNA do cinetoplasto) em epidemiologia molecular e taxonomia em leishmanioses podemos citar, entre outras: (i) o rastreamento de cepas circulantes em humanos, reservatórios domésticos e silvestres, definindo-se situações epidemiológicas mais simples e mais complexas em áreas endêmicas (Pacheco et al., 1986); (ii) a identificação de infecção mista por L (L.) chagasi e L (V.) braziliensis em um paciente do Rio de Janeiro (Oliveira-Neto et al., 1986); (iii) a detecção de infecção concomitante cutânea, visceral e ocular por L (V.) braziliensis em paciente transplantado renal e em uso de imunossupressores (Gontijo et al., 2002); e (iv) a descrição de Leishmania (Leishmania) forattinii, nova espécie de Leishmania infectando gambás e roedores no Brasil (Yoshida et al., 1993).

Caso as enzimas de restrição sejam aplicadas a segmentos de DNA previamente amplificados por PCR específica para determinada região do genoma, teremos a técnica RFLP-PCR. Essa metodologia, baseada na PCR, é capaz também de avaliar a diversidade genética intra e interespecífica de espécies de Leishmania do Novo e do Velho Mundo (Marfurt et al., 2003; Rotureau et al., 2006). No Brasil, foi utilizada para a discriminação de amostras de L. (L.) braziliensis e L. (V.) amazonensis obtidas a partir de lesões cutâneas (Volpini et al., 2004). A avaliação da variabilidade interespecífica entre L. (L.) infantum e L. (L.) chagasi sugeriu que estes taxa fossem considerados uma única espécie (Mauricio et al., 2001), corroborando análise prévias por MLEE. Alguns estudos que utilizaram a técnica RFLP-PCR na epidemiologia molecular de Leishmania elegeram o gene que codifica a proteína gp63, e os produtos dessa amplificação como substrato para a digestão por enzimas de restrição (Mauricio et al., 2001).

Recentemente, foi demonstrado que os perfis eletroforéticos obtidos com base na digestão por enzimas de restrição do segmento genômico que codifica a proteína de choque térmico de 70 kDa (hsp70, sigla em inglês para heat shock protein) é capaz de discriminar muitas espécies de Leishmania de importância médica: L. (L.) infantum, L. (L.) donovani, L. (L.) tropica, L. (L.) aethiopica, L. (L.) major, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) braziliensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis e L. (V.) panamensis (Montalvo et al., 2010). Da mesma forma, a técnica RFLP-PCR direcionada ao gene de mini-exon foi capaz de gerar padrões de bandas espécie-específicos em Leishmania do Novo e do Velho Mundo (Marfurt et al., 2003).

 

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso

(RAPD, sigla em inglês para Random Amplified

Polymorphic DNA)

Esta técnica consiste na amplificação aleatória de fragmentos de DNA parasitário utilizando-se oligonucleotídeos inespecíficos que reconhecem sequências curtas no genoma. A presença de polimorfismos irá alterar o padrão de reconhecimento desses sítios pelos iniciadores, gerando, após a amplificação, um padrão de bandas distinto para as amostras geneticamente divergentes. A quantidade de bandas não compartilhadas entre amostras pareadas será tanto maior quanto mais polimorfismos existam no genoma destas. Diferentes perfis podem então ser submetidos à análise numérica em softwares específicos.

Assim como a MLEE, o RAPD é uma ferramenta disponível para avaliar a presença de variabilidade genética intra e interespecífica em Leishmania, possibilitando inferências sobre a estrutura de populações parasitárias. A técnica RAPD apresenta como vantagem o fato de não requerer a constituição prévia de uma biblioteca de iniciadores específicos para o organismo de interesse. Um grupo ‘polivalente’ de oligonucleotídeos pode ser usado para quaisquer organismos. A técnica conjuga, portanto, a simplicidade da visualização direta dos marcadores isoenzimáticos com a resolutividade dos marcadores de DNA.

A principal limitação da técnica é o relativamente baixo conteúdo de informação genética por lócus – apenas um alelo é detectado –, o que define a dominância dos marcadores RAPD (Grattapaglia & Sederoff, 1994). Dessa forma, genótipos heterozigotos não podem ser discriminados dos homozigotos pela técnica do RAPD. Idealmente, o RAPD deve complementar a MLEE com o objetivo de corroborar (ou não) o agrupamento em zimodemas obtido por meio desta. Estudos com marcador RAPD (Schriefer et al., 2004) possibilitaram avaliar a diversidade genética intraespecífica de L. (V.) braziliensis, evidenciando-se a multiclonalidade das populações parasitárias em uma área endêmica no Nordeste brasileiro; os parasitos identificados em lesões cutâneas eram geneticamente distintos daqueles detectados em lesões mucosas. Entretanto, clones geneticamente relacionados de L. (V.) braziliensis nas lesões inicial e reativada de um mesmo paciente, no Rio de Janeiro (Baptista et al., 2009). No Sudão, a variabilidade genética intraespecífica de amostras de L. (L.) donovani identificadas em pacientes com leishmaniose visceral foi avaliada, demonstrando-se a presença de três genótipos entre os parasitos resistentes ao estibogluconato de sódio e apenas um entre os isolados sensíveis a essa droga (Hamad et al., 2010). Os marcadores RAPD auxiliaram também a comparação de Leishmania isolada de lesões cutâneas no Brasil com cepas de referência da Organização Mundial da Saúde (OMS), demonstrando a similaridade daquelas com L. (L.) major (Silva et al., 2009).

 

PCR de iniciador único em condições de baixa

estringência (LSSP-PCR, sigla em inglês para

Low-Stringency Single Specific Primer-PCR)

Esta técnica baseia-se na amplificação prévia de um segmento genômico parasitário por meio de PCR específica. Os produtos desta primeira PCR são então submetidos a uma segunda amplificação utilizando-se iniciador único e condições de baixa estringência, como aquelas obtidas ao se utilizar baixas temperaturas de anelamento. Isso permite um reconhecimento menos específico de sequências nucleotídicas pelo iniciador único, que será um daqueles do par específico utilizado na primeira amplificação. Com base em tal procedimento, podem ser gerados produtos de diferentes tamanhos que serão discriminados por eletroforese, constituindo-se em padrões complexos formados por várias bandas. O padrão de bandas obtido pode ser alterado por polimorfismos de base única (Pena et al., 1994), sendo a técnica capaz de discriminar variantes genéticas intraespecíficas de L. (V.) braziliensis (Ferreira et al., 2007; Baptista et al., 2009).

Por meio da técnica LSSP-PCR, foram demonstrados polimorfismos intraespecíficos nos minicírculos do kDNA de L. (V.) braziliensis recuperadas de lesões de mucosa oral e nasal, detectando-se perfis divergentes em lesões de um mesmo paciente obtidas em um intervalo de um ano (Oliveira et al., 2010).

 

PCR ancorada a repetições de sequências

simples (SSR-PCR, sigla em inglês para Simple

Sequence Repeats-PCR)

Os genomas eucariotos apresentam grande quantidade de sequências repetidas, algumas mais complexas (minissatélites) e outras mais simples (microssatélites), sendo altamente polimórficos e portanto úteis para utilização como marcadores genéticos. Regiões que contêm sequências simples repetidas podem ser amplificadas individualmente por meio de PCR utilizando-se iniciadores específicos, complementares a sequências que as flanqueiam. Tais segmentos apresentam um polimorfismo resultante da presença de quantidades variáveis de elementos simples repetidos. Dessa forma, ‘ilhas’ microssatélites com quaisquer repetições simples podem ser consideradas um lócus alélico. Os polimorfismos são observados após eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida. Os loci SSR são codominantes. Como vantagem da técnica, pode-se citar o elevado conteúdo de polimorfismos. Por serem frequentes e distribuídos ao acaso, possibilitam uma ampla cobertura do genoma. Como limitação está a necessidade de desenvolvimento prévio dos marcadores, que envolve a construção de uma biblioteca de fragmentos genômicos pequenos para o organismo de interesse.

Embora já tenham sido identificados microssatélites contendo todas as combinações de bases, as repetições (CA)n parecem ser as mais comuns (Rossi et al., 1994). A técnica demonstrou também ser capaz de discriminar cepas de referência de L. (L.) amazonensis, L. (L.) chagasi, L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis, por intermédio da geração de perfis distintos. Os autores relataram uma sensibilidade comparável àquela observada para RAPD, porém com maior reprodutibilidade. Isolados asiáticos e africanos de L. (L.) tropica puderam ser avaliados quanto à variabilidade genética mediante tal técnica, demonstrando-se o agrupamento das amostras por área geográfica (Schwenkenbecher et al., 2006). A técnica SSR-PCR, aplicada a estudos em epidemiologia molecular de L.(L.) infantum exibiu também capacidade de discriminar genótipos dessa espécie identificados em cães e humanos (Bulle et al., 2002).

 

Sequenciamento de DNA, tipagem por

sequenciamento de multilocos (MLST, sigla em

inglês para Multilocus Sequence Typing) e

tipagem por multilocos de microssatélites

(MLMT, sigla em inglês para Multilocus

Microsatellite Typing)

Para estudos em epidemiologia molecular e genética evolutiva de patógenos, alvos genéticos específicos são inicialmente amplificados por PCR e posteriormente submetidos a sequenciamento. Sequências genômicas de ambos os espaçadores transcritos internos (ITS, sigla em inglês para Internal Transcribed Spacers) e da subunidade 5.8S do DNA ribossomal depositadas no GenBan foram analisadas (Dávila & Momen, 2000), demonstrando (i) a separação dos subgêneros L. (Leishmania) e L. (Viannia); (ii) dentro de L. (Leishmania) a discriminação entre espécies do Velho Mundo e aquelas pertencentes ao complexo L. mexicana; (iii) a separação dos complexos de espécies do Velho Mundo; (iv) separação de espécies dentro dos complexos. Os resultados não divergiram da classificação proposta por meio de MLEE.

Recentemente, sequências nucleotídicas de um fragmento de 1.380 pares de bases do gene que codifica a proteína hsp70 foram determinadas com o intuito de se avaliar a variabilidade genética de isolados de Leishmania. Essas, combinadas a sequências previamente obtidas, permitiram o estudo de 52 amostras de 17 espécies distintas. Os resultados permitiram o reconhecimento de apenas oito espécies, em vez das 17 previamente definidas por MLEE: L. (L.) donovani, L. (L.) major, L. (L.) tropica, L. (L.) mexicana, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) guyanensis e L. (V.) braziliensis (Fraga et al., 2010).

A técnica MLST mensura diretamente variações na sequência de nucleotídeos do DNA parasitário, em um grupo de genes específicos, denominados genes housekeeping (genes constitutivos, necessários para a manutenção das funções celulares basais), caracterizando isolados distintos segundo seus perfis alélicos particulares. A técnica envolve a realização de PCR, seguida de sequenciamento do DNA. Diferenças em nucleotídeos entre as amostras podem ser avaliadas para um número variável de genes, dependendo do grau de discriminação desejado. Ferramentas de biologia computacional são utilizadas para manejar, analisar e interpretar os dados obtidos.

A técnica MLST, entretanto, pode ser dificultada quando a espécie sob análise contém variação genética muito reduzida para diferenciar os isolados, como é o caso em alguns eucariotos. Nesses casos, é possível que os níveis de diversidade genética observados nos loci não sejam suficientes para permitir a discriminação de isolados por MLST.

Como alternativa para o problema, podem ser utilizados os marcadores MLMT. Essa técnica tem como loci-alvos repetições de dois, três ou quatro nucleotídeos (as repetições de microssatélites citadas anteriormente no item SSR-PCR). Tais repetições são bem mais variáveis do que os genes constitutivos, devido ao acúmulo progressivo de polimorfismos de tamanho ocasionados em consequência de erros da DNA polimerase durante a replicação do genoma. Os alelos de cada lócus são amplificados e estudados por sequenciamento, caracterizando-se os polimorfismos de tamanho.

Essa mesma técnica foi empregada para estudos de epidemiologia molecular na Índia, os quais incluíram a caracterização de 132 isolados de L. (L.) donovani obtidos de pacientes com calazar, leishmaniose cutânea pós-calazar e leishmaniose cutânea, revelando-se a similaridade de 125 cepas de origens geográficas e manifestações clínicas distintas, ou de sua sensibilidade aos antimoniais. A circulação de uma população estruturada (geneticamente homogênea) de parasitos na região sugeriu a introdução recente do patógeno e sua difusão epidêmica (Alam et al., 2009).

A técnica MLMT foi também empregada para a caracterização de isolados de L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) peruviana, tendo sido capaz de discriminar as diferentes espécies de acordo com a área geográfica e de detectar a estruturação populacional (Oddone et al., 2009).

 

Considerações finais

Diversas técnicas de biologia molecular têm sido empregadas em estudos epidemiológicos das leishmanioses tegumentar e visceral, do Novo e do Velho Mundo. Vários marcadores genéticos, com características distintas e graus de resolução variáveis têm sido empregados na detecção de diversidade genética intra e interespecífica, no intuito de se elucidar questões taxonômicas, evolutivas, epidemiológicas e mesmo clínicas, relacionadas à resistência aos antimoniais, à imunossupressão e às diferentes formas de apresentação da doença. Investigações nesse campo necessitam de uma abordagem que considere, de forma integrada, polimorfismos genéticos do patógeno, do hospedeiro e do vetor, incluindo suas interações (Tibayrenc, 1998).

Cabe ressaltar que, mesmo a despeito de questionamentos sobre distintos relógios moleculares ou características sinapomórficas dos marcadores moleculares, polimorfismos continuam sendo detectados em um ou ambos os genomas, nuclear e mitocondrial (Pacheco et al., 2000). Enfatizamos ainda que a plasticidade genotípica dos parasitos e vetores das leishmanioses, que possibilita a adaptação a condições adversas, pode estar associada à obtenção de vantagem seletivas em condições de estresse nos ciclos de transmissão. A esse ponto, duas questões emergem (Pacheco & Brito, 1999): estariam as populações (ou clones) de Leishmania evoluindo em direção a um aumento ou a uma redução nos níveis de heterogeneidade? Existiria uma evolução paralela dos genomas nuclear e mitocondrial ou uma possível interação entre ambos os elementos no parasito? Um ponto fundamental que emerge desse cenário está relacionado à relação parasito-hospedeiro. Se a entidade biológica em evolução é a linhagem clonal (Ayala, 1993), pode-se imaginar clones com diferentes características biológicas sendo misturados com a população total circulante, compartilhando diferentes fatores de virulência ou competindo por vantagens seletivas tais como distintas taxas de crescimento e tropismo.

Embora muito se tenha caminhado no sentido de uma melhor compreensão da história natural das leishmanioses, o horizonte à nossa frente está repleto de possibilidades para estudos genéticos de Leishmania. As leishmanioses são, em grande parte do planeta, doenças negligenciadas que afetam grupos populacionais de pequena visibilidade e o desenvolvimento de novas e mais eficazes possibilidades terapêuticas é uma necessidade evidente. A doença está também associada ao desflorestamento, apresentando taxas de incidência crescentes em regiões de expansão das fronteiras econômicas no Brasil, principalmente na Amazônia. As alterações climáticas determinadas pelo aquecimento global são fatores que poderão influenciar a distribuição de vetores e o surgimento de novos focos da doença. A pandemia de HIV/Aids leva à possibilidade de que as leishmanioses representem desafios crescentes em saúde pública em diversos países. Nesse contexto, várias questões necessitarão ser respondidas, muitas delas valendo-se da epidemiologia molecular. Mais recentemente, o sequenciamento dos genomas completos de L. (L.) infantum e L (V.) braziliensis (Peacock et al., 2007) contribui com a identificação de genes que são espécie-específicos ou estão sob pressão seletiva, fornecendo recursos para direcionar esforços na identificação de fatores intrínsecos do parasito que influenciam a infecção. Da mesma forma, elementos únicos ao gênero Leishmania poderão ser utilizados como alvos potenciais de novas drogas ou no desenvolvimento de vacinas.

 

Referências

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