6. Aminoácidos e Proteases

Salvatore Giovanni De Simone

Os aminoácidos são indispensáveis para todos os organismos vivos e operam como blocos de construção de proteínas. Seu mecanismo de captação e suas vias metabólicas estão organizados diferentemente na biosfera e podem ser únicas para cada aminoácido e organismos. Contudo, a identificação das enzimas envolvidas e a construção da organização das diversas vias metabólica podem se constituir uma tarefa árdua e muitas vezes demorada. Nesse aspecto, os projetos de sequenciamento e anotação genômica de protozoários patogênicos concluídos como Leishmania sp. estão contribuindo significativamente para a identificação da capacidade enzimática dos parasitos, fato que nos permite realizar a reconstrução funcional das suas vias metabólicas.

A maioria dos microrganismos e as plantas produzem praticamente todos os vinte aminoácidos conhecidos de que necessitam para sua sobrevivência. Entretanto, mamíferos, incluídos os seres humanos, e os parasitos, de maneira geral, podem produzi-los parcialmente. As diferenças entre os diversos organismos vão desde o modo de captação exógena desses substratos proteicos (que pode ser distinto em seus vários estágios de desenvolvimento) até a capacidade metabólica intracelular de assimilação, utilização, interconversão e síntese de aminoácidos. Neste capítulo, procuramos descrever o conjunto de ações integradas do metabolismo de aminoácidos essenciais à sobrevivência dos diversos estágios de desenvolvimento de Leishmania sp. Tais estágios vão desde a assimilação, transporte e ação de proteases até a oferta intracelular de aminoácidos para sua sobrevivência e multiplicação.

Assimilação e transporte de

aminoácidos

Os aminoácidos e os lipídeos são as principais fontes de carbono para os amastigotas. Tomando-se como base o conhecimento das necessidades dos estágios cultiváveis in vitro e a reconstrução do metaboloma utilizando ferramentas computacionais (Ivens et al., 2005; Opperdoes & Coombs, 2007), é possível hoje inferirmos que além dos outros nutrientes, os amastigotas captam pelo menos dez dos aminoácidos essenciais do fagolisossoma dos macrófagos (McConville et al., 2007).

Os aminoácidos existentes no interior dos fagolisossomas são obtidos pelos macrófagos, por meio de proteólise de proteínas exógenas e de autofagia, sendo captadas pelos amastigotas por intermédio de transportadores específicos.

Os aminoácidos essenciais e os não essenciais, mais ornitina, aldometionina e treonina, são transportados especificamente e distintamente (essenciais versus não essenciais) por transportadores denominados de permeases existentes em sua membrana plasmática. O transportador AAP3 para a arginina, e AAP7 para a lisina, foi recentemente clonado (Shaked-Mishan et al., 2006).

A interface entre os amastigotas e os fagolisossomas são o lúmen e a membrana limitante dos fagolisossomas. Portanto, durante seu estágio intracelular as amastigotas de Leishmanias utilizam esse

caminho para assimilar seus aminoácidos (Figura 1).

Figura 1 – Assimilação de aminoácidos por amastigotas

intracelulares

 

Os nutrientes essenciais, cátions e outras fontes de carbono

chegam ao fagolisossomas valendo-se da via endocítica ou pelo citosol dos macrógafos. A captação de aminoácidos por amastigotas

é feita mediante permeases, proteínas transportadoras específicas

da membrana do parasito. Outro mecanismo existente envolve a

captação de macromoléculas (proteínas, DNA, carboidratos) e é

realizado por endocitose.

Fonte:adaptada de McConville et al., 2007.

Em promastigota, existem pelas menos duas hipóteses, entretanto a maioria das opiniões aponta para o caminho lisossomal e envolvimento do tráfego de membrana de constituintes proteicos. Contudo, diversas enzimas das classes cisteína e serina-proteases intracelulares não lisossomais foram purificadas de sobrenadantes de cultura, e embora a função biológica não tenha ainda sido esclarecida, observações indicam uma ação sobre substratos proteicos que aumentariam o pool de aminoácidos para fins nutricionais.

 

Transportadores de aminoácidos

As Leishmanias sintetizam um subconjunto de aminoácidos (não essenciais), mas outros devem ser importados. As proteínas que realizam tal função são denominadas de permeases. Essas proteínas membranares estão amplamente distribuídas em células eucarióticas e, além de ter a função de assimilar aminoácidos necessários às múltiplas funções biológicas, assimilam aminoácidos como precursores para a biossíntese de proteínas e outras vias biossintéticas, como poliaminas e pirimidinas.

Mesmo para aminoácidos sintetizados por uma célula, podem existir permeases que complementam o abastecimento necessário para a biossíntese. Transportadores de aminoácidos representam uma das maiores famílias de permeases codificadas dentro do genoma de muitos eucariotos, e estão distribuídas em muitas

classes e superfamílias (<www.bioparadigms.org/slc/menu.asp>). Na verdade, entre os parasitos cujos genomas foram sequenciados (L. major, T. brucei e T. cruzi), o maior grupo de transportadores de aminoácidos são as permeases (3-40 genes), com a possível exceção dos transportadores ABC. Vários transportadores de aminoácidos têm sido extensivamente estudados em alguns microrganismos como leveduras e em mamíferos, mas há escassez de conhecimento a respeito dessa família de proteínas entre os protozoários parasitários.

O primeiro gene transportador de aminoácidos de Leishmania sp. clonado e funcionalmente caracterizado foi o transportador de arginina AAP3 de L. donovani (LdAAP3) (Shaked-Mishan et al., 2006). A proteína pertence à superfamília auxina aminoácido permease (AAP), no entanto os membros desta família em Leishmania são bastante divergentes e representam um clã em separado. A arginina é um aminoácido essencial e deve ser assimilado do meio onde o parasito estiver. Este aminoácido é usado apenas para a síntese de proteínas e como precursor para a síntese de poliaminas. O transporte e os níveis de RNAm da proteína transportadora LdAAP3 aumentaram cerca de cinco vezes quando parasitos deficientes em Arg foram colocados em contato com o aminoácido (Darlyuk et al., 2009). Da mesma forma, o aumento da expressão da proteína LdAAP3 foi abolida, quando o equilíbrio intracelular foi atingido. Tais observações sugerem que o parasito, diante das necessidades intracelulares, aumenta ou diminui o transporte de Arg para manter a homeostase. Recentemente, um gene transportador de lisina de L. donovani (LdAAP7) e seu ortólogo em T. cruzi (TcAAP7) foram clonados e funcionalmente expressos. A incapacidade de suprimir o gene LdAAP7 sugere que este seja o único transportador de lisina em L. donovani e que tal permease é essencial para promover a captação deste aminoácido.

 

Oferta intracelular de aminoácidos

 

Construindo vias metabólicas na era genômica

Pelo menos três projetos de sequenciamentos genômicos de Leishmania e outros tantos de tripanossomatídeos e protozoários patogênicos foram concluídos, e as informações geradas estão nos fornecendo dados para uma reconstrução metabólica. A anotação de genomas e reconstrução metabólica é um esforço complementar necessário que requer subsequente isolamento das enzimas e caracterização de suas funções/atividades enzimáticas.

Quando um genoma é totalmente sequenciado e necessário ajustar os genes identificados ao seu contexto funcional. Essa etapa é limitada pela exatidão da anotação dos genes. A procura para o reconhecimento do produto do gene começa com a identificação de quadros de leitura abertas, seguida pela identificação das proteínas codificadas. Algoritmos computacionais são então utilizados para permitir diferentes níveis de automação do processo, entretanto tais algoritmos apresentam desempenho variável perante diferentes genomas ao tentar identificar genes. Portanto, as previsões mais confiáveis são as daqueles que utilizam uma inspeção manual. A identificação final do produto do gene, porém, só é alcançada pela caracterização bioquímica e molecular. Contudo, uma vez que a anotação dos genes esteja disponível, podemos classificar seu produto (de acordo com o seu papel inferido) e realizar a reconstrução de aspectos da biologia do organismo.

Leishmania e Trypanosoma evoluíram de um ancestral comum e compartilham muitas características. Assim, era de se esperar que muitos dos genes de diferentes tripanossomatídeos fossem ortólogos, como já foi comprovado (El-Sayed et al., 2005). No entanto, existem algumas diferenças biológicas substanciais entre tripanossomatídeos, e estas podem ser ilustradas considerando-se suas estratégias de história de vida. Notavelmente, as leishmânias se desenvolvem dentro de um vacúolo parasitóforo presente em células mononucleares de um mamífero hospedeiro, portanto adaptado para alcançar esse nicho apropriado metabolicamente à sua sobrevivência. Desse modo, acreditase que a capacidade metabólica de amastigotas evoluiu para garantir que tal estágio estivesse totalmente adaptado para a sua existência intracelular.

Da mesma forma, promastigotas estão adaptados à vida em diferentes partes das glândulas salivares do inseto vetor (exceto para o complexo de L. braziliensis). Além disso, flebotomíneos diferem dos vetores de tripanossomos em sua biologia (ex., sua fonte de alimento), acarrentando implicações para o parasito do gênero Leishmania dentro deles. Há agora informações completas sobre os genes de Leishmania e isso deve ajudar os pesquisadores a deduzir as suas adaptações para cada uma das fases do seu ciclo de vida. Todavia, ainda não se sabe quando, no ciclo de vida de muitos dos genes, são funcionalmente importantes. Presumivelmente, essas análises serão concluídas em breve, embora seja duvidoso que as análises globais de transcriptomas e proteômas possam fornecer todas as respostas, tornando-se necessário um estudo detalhado de grupos de genes por longos anos. Além disso, o conhecimento dos ambientes em que as diferentes formas do parasito residem, como o vacúolo parasitóforo, continua pobre, fato que limita a capacidade dos pesquisadores para imitar essas condições experimentalmente. É sabido que existe uma variação de pH entre o amastigota que reside em um ambiente ácido, enquanto acredita-se ser o hábitat de promastigotas mais próximo de neutro. Isso tem implicações na aquisição de nutrientes (Burchmore & Barrett, 2001), embora o pH interno de ambas as formas do parasito deva girar em torno de neutro. Outro aspecto que nos parece ser importante na definição das rotas/vias metabólicas é a disponibilidade de O e CO . Amastigotas e promastigotas 2 2 respondem, metabolicamente, de forma diferente diante da disponibilidade de gás (Hart & Coombs, 1981; Darling et al., 1989) e das diferenças dos ambientes em que residem.

 

Genômica e metabolismo de aminoácidos

Os resultados das análises de bioinformática do genoma de Leishmania braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania amazonensis e Leishmania major podem ser encontrados em bases de dados genômicos. O genoma de L. major apresenta 36 cromossomos (32,8 megabase, 911 genes RNA, 39 pseudogenes) que comportam 8.272 genes codificadores de proteínas (3.083 cluster e 662 famílias). Apenas 36% desses genes puderam ser relacionados à sua possível função biológica e um pouco menos de 2% corresponde a proteases (El-Sayed et al., 2005). As sequências de L. infantum e L. amazonensis ainda não estão concluídas. Nessa

fase, a base de dados Merops (<www.merops.ac.uk>) aponta para 56-84 genes de proteases identificadas nas três primeiras espécies de Leishmania e 18 genes para enzimas do metabolismo de aminoácidos (L. infantum), entretanto uma análise mais aprofundada das sequências de nucleotídeos necessitará ser realizada e revista ao longo dos próximos anos. Como as proteases estão diretamente envolvidas na manutenção do pool intracelular de aminoácidos, será apresentada a seguir uma breve descrição das principais proteases caracterizadas em Leishmania sp. até o momento.

 

Proteases

A clivagem proteolítica de ligações peptídicas é uma das mais frequentes e importantes modificações póstraducionais de proteínas. As peptidases (proteases) recebem o prefixo ‘endo’ quando clivam ligações no meio de cadeias polipeptídicas, podendo neste caso serem chamadas também de proteinases, e o prefixo ‘exo’ quando clivam ligações em uma das extremidades da cadeia polipeptídica, compreendendo as chamadas ‘amino’ e carboxipeptidases. Provavelmente, o maior progresso no estudo de proteases tenha sido o estabelecimento de uma classificação racional baseada na comparação dos sítios ativos, mecanismo de ação e estrutura tridimensional. As seis classes reconhecidas pela International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) são: serina, cisteína, aspártico, metaloprotease e mais recentemente glutâmico e treonina. Posteriormente, foram definidas famílias para agrupar proteases que teriam descendido de um ancestral comum por evolução divergente.

Cisteína-peptidases

As cisteína-peptidases formam um grupo de enzimas que contém um resíduo de Cys25 localizado no sítio ativo. A catálise ocorre via um intermediário tiol-éster e é facilitada pelas cadeias laterais de His 159 158 e Asp(Asn). Em geral, estão localizadas no citosol e em compartimentos lisossomais/megassomas.

Uma análise detalhada do recém-concluído genoma de L. major revelou a presença de genes que codificam um total de 65 cisteína-peptidases, que podem ser agrupadas em quatro clãs e 13 famílias. Muitas dessas enzimas do parasito são suscetíveis de desempenhar papéis cruciais no hospedeiro. No entanto, a maioria dos estudos tem-se concentrado em apenas três tipos de cisteína-peptidases, designadas como: (i) cisteína-peptidases A (CPA), CPB e CPC, pertencentes ao Clan CA da Família C1 (papaína-símile); (ii) calpain-símile, pertencente à família C2; e (iii) metacaspase, da família C14, que tem alta atividade peptidásica (Robertson &

Coombs, 1990) (Figura 2).

Figura 2 – Clãs e famílias de proteases em Leishmania sp. Os

números entre parênteses correspondem ao número de espécies

moleculares de cada família

As catepsinas L-símiles correspondem à maioria da atividade detectada e assim designada peptidases cisteína-Tipo I. Essas enzimas são encontradas em L. major e em L. mexicana e são codificadas por genes multicópia (oito na primeira e 19 na segunda), apresentando uma extensão C-terminal incomum. Embora o maior nível de atividade tenha sido identificado nas formas amastigotas, os dois primeiros genes são predominantemente transcritos em promastigotas metacíclicos. Uma organização genômica similar de genes catepsina-L, como foi descrito em L. pifanoi, ocorre em L. donovani (Mottram, Coombs & Alexander, 1994). Peptidases CPA (Tipo II) também apresentam homologia com a catepsina L, uma enzima codificada por um único gene exemplar, e têm sido detectadas nas formas infectantes (amastigotas e promastigotas metacíclicos) de L. mexicana e L. major.

Cisteína-peptidase C (CPC) ou peptidase Tipo III é uma enzima catepsina B-símile expressa por um gene único em todas as fases de desenvolvimento de L. mexicana e de L. major (Mottram, Coombs & Alexander, 1994; Coombs & Mottram, 1997; Mottram et al., 1989). Cisteína-peptidases parecem ser relevantes para os vários aspectos do ciclo de vida de Leishmania e da relação parasito-hospedeiro. Entre outros, as cisteína-peptidases participam da nutrição do parasito, desempenham um papel essencial na bem-sucedida invasão de macrófagos e participam dos mecanismos de escape do sistema imune (Mundodi et al., 2002).

Além disso, parece que as CPBs são importantes fatores de virulência que modulam a resposta imune do hospedeiro, facilitando o crescimento intracelular do parasito. A multiplicidade dos genes pode atuar como um mecanismo que garanta a síntese de grandes quantidades da enzima. As isoenzimas CPB caracterizadas até agora são altamente conservadas, mas algumas diferenças de atividade são evidentes, demonstrando que as poucas variações de aminoácidos nas posições estratégicas são realmente importantes na modificação das especificidades de substrato das isoenzimas, os quais podem fornecer ao parasito uma ampla gama de atividades hidrolíticas (Juliano et al., 2004).

As CPBs de L. mexicana estão confinadas nos lisossomas das formas amastigotas, sendo também encontradas no compartimento multivesicular túbulo-lisossoma de promastigotas. Entretanto, a rota do tráfego das cisteínapeptidases de Leishmania parece envolver, além dos lisossomas, a bolsa flagelar e o caminho endosomal (Brooks et al., 2000; McConville et al., 2002). Um modelo de

processamento e tráfego é apresentado na Figura 3. Estudos sobre o efeito de inibidores de cisteína-peptidase apontaram que, independentemente da química do inibidor, as alterações morfológicas produzidas no parasito foram semelhantes, mesmo sem se levar em conta a eficácia e os inibidores testados (Selzer et al., 1999).

Figura 3 – Modelo de processamento de cisteína-proteases e

tráfego, sobreposto a uma micrografia eletrônica de transmissão de

amastigotas de Leishmania

 

A rota principal do tráfego proposta envolve zimogênio (3) em

vesículas produzidas a partir do complexo de Golgi (amarelo) que se

move para fusão com a bolsa flagelar. Após a ligação a um possível

receptor da bolsa flagelar (representado por linhas pretas que se estendem desde a membrana da bolsa flagelar), a protease cisteína é ativada para a forma madura (1) e, em seguida, transportada para

o lisossoma/megassoma (2). Um segundo possível caminho

(indicado com um ponto de interrogação) envolve o tráfego direto de

vesículas (3) do lisossomo com a ativação do zimogênio.

Abreviações: F – flagelo; I – corpo de inclusão (lipídeos); CT –

cinetoplasto; M – mitocôndria; N – o núcleo

Fonte: adaptada de Brooks, 2000.

Calpaínas são peptidases neutras da família C2 presentes em uma variedade de organismos, incluindo Leishmania spp., e estão envolvidas em diversos processos celulares, como: apoptose, transdução de sinal, diferenciação celular e remodelação do citoesqueleto. Sao enzimas não lisossomais ativadas alostericamente por Ca2+. Cerca de 27 genes que codificam para calpaínas-símiles foram identificados nos genomas de Leishmania spp. (L. major, L. infatum e L. braziliensis) finalizados ou em progresso, entretanto, em sua maioria suas funções biológicas permanecem desconhecidas.

Serina-peptidases (EC 3.4.21)

A maior família de peptidases corresponde à família da quimiotripsina (S1). O marco central do sítio ativo destas enzimas é a tríade catalítica Asp 102 57 195 , His e Ser (baseado na numeração da quimiotripsina). A catálise procede via um intermediário de estado de transição tetraédrico durante os estágios de acilação e deacilação. O mesmo tipo de mecanismo está envolvido em todas as reações de serina-proteases. Nosso entendimento atual do mecanismo de ação dessas enzimas é ilustrativo de todo o grupo de enzimas envolvidas na transferência de fragmentos, apesar de que, nesse caso, a transferência é para a água. A transferência intermediária da porção acila de um substrato para formar uma ligação covalente com um grupo funcional da enzima é um aspecto

comum entre as serina-proteases e outras transferases (Figura 4).

Figura 4 – Mecanismo catalítico das serina-proteases

 

Os genomas de Leishmania sp. concluídos até o momento estimam que esses parasitos apresentam cerca de 13 diferentes serina-proteases, distribuídas pelas famílias S8, S9, S10, S26, S51,

S54 e S59 (Figura 2). Foram identificados genes que codificam para uma família de subtilisina-símile, prolil oligopeptidase, uma peptidase sinal tipo I, uma subunidade reguladora do proteassoma 26S, uma serina carboxipeptidase, uma nucleoporina homóloga e uma família serina-peptidase intramembranares (romboidas-símiles ortólogas). A família prolil oligopeptidase (Peptidase família S9) inclui a prolil oligopeptidase B (subfamília Peptidase S9a), dipeptidil peptidase IV (Peptidase S9b subfamília), peptidase acilaminoacil (subfamília Peptidase S9c) e glutamil peptidase (subfamília Peptidase S9D) (Rawlings, Morton & Barrett, 2006). Essa família de enzimas é diferente da clássica família de proteases serina, tripsina e subtilisina, em que as enzimas clivam substratos peptídicos, excluindo-se apenas as proteínas de grande porte (Gerczei, Keseru & Naray-Szabo, 2000). As enzimas consistem em um domínio peptidase com uma hidrolase b/enovelada e sete domínios β-hélice (Fülöp, Böcskei & Polgár, 1998; Gerczei, Keseru & Naray-Szabo, 2000; Rea & Fülöp, 2006).

O genoma de L. major codifica para uma prolil oligopeptidase (Q4Q080, família S9a), duas oligopeptidases B (Q4QHU7 e Q4QJ45, família S9a) e duas serina-peptidases (Q4Q4J7 e Q4QGF5, família S9D). Nenhum dos componentes da subfamília S9c foi encontrado. As oligopeptidases B clivam em resíduos de arginina e lisina (Pacaud & Richaud, 1975; Polgár, 2002), embora apresentem maior eficiência catalítica em substratos dibásico (Ashall et al., 1990; Polgár, 1997; Morty, Fülöp & Andrews, 2002; Hemerly et al., 2003).

Apesar de as serina-peptidases serem o maior grupo de proteases investigadas, apenas alguns membros dessa classe de peptidase foram bem caracterizadas em Leishmania sp. (Silva-Lopez & De-Simone, 2004b). Destas, apenas duas têm sido mais bem estudadas: oligopeptidase B (OpB) e PoP-Tc80, enzimas citoplasmáticas e membros da família das prolil oligopeptidases (PoP) (CE 3.4.21.83; clã SC, família S9).

No genoma de L. major foram identificadas também duas oligopeptidases B. OpB de L. major foi a primeira a ser identificada (Rafati et al., 2004) e, em seguida, reanotada no banco de dados genômicos (Ivens et al., 2005). As outras oligopeptidases B identificadas apresentam diferenças significativas em relação à primeira e, assim, foram denominado OpB-símile.

Os componentes dessa família apresentam atividade proteolítica sobre peptídeos de baixa massa molecular, além de especificidade do tipo tripsina-símile, isto é, atuam clivando ligações peptídicas carboxila terminal de resíduos básicos (Morty et al., 1999). Duas OpB (OpB-símile e OpB-2) foram identificadas no genoma de L. major e confirmadas experimentalmente mediante clonagem por nosso grupo (Guedes et al., 2008; Guedes et al., 2010). Em T. cruzi, a oligopeptidase B (PoP-TC) está diretamente envolvida no estabelecimento da infecção, modulando a atividade de cálcio a partir de uma molécula precursora citosólica (Tardieux et al., 1992).

Outra enzima identificada foi a S26-peptidase sinal (EC 3.4.21.89) tipo I, (26-Spase-I), membro da família de proteases associadas à membrana, cuja função é clivar o peptídeo sinal N-terminal das proteínas que são translocadas através das membranas biológicas. O gene que codifica essa proteína foi identificado em L. infatum, L. major e L. donovani, entretanto tem sido classificada como aspártico-protease (Rafati et al., 2004). As Spases-I são proteases únicas, que utilizam uma serina no lugar da lisina e um mecanismo de díade catalítica no lugar da clássica tríade catalítica Asp/His/Ser das serina-proteases. Compare o mecanismo catalítico das serina e

aspártico-proteases descrito neste capítulo (Figura 4) para verificar a diferença. Portanto, estamos descrevendo tal enzima como uma possível serina-protease, mas existe a possibilidade de pertencer à classe aspartil protease pelas observações dos autores (Taheri et al., 2010). Porém, devido à sua homologia e o novo conhecimento desse grupo de proteases, acreditamos que em breve deverá ser reclassificada.

Embora a Spase-I bacteriana seja monomérica, peptidases-sinal de células eucarióticas comumente funcionam como complexos oligoméricos contendo duas cópias divergentes do monômero catalítico. Estes são denominados de peptidases-sinal IMP1 e IMP2 da membrana mitocondrial interna, os quais removem peptídeos-sinal de proteínas codificadas para as membranas nucleares e mitocondriais. Além disso, dois componentes da peptidase-sinal do retículo endoplasmático (RE) em mamíferos (18-kDa e 21-kDa) pertencem a essa família e processam muitas proteínas que penetram o RE para retenção ou exportação para o Golgi, vesículas secretoras, membrana plasmática ou vacúolo. Um membro atípico da família Spase tipo S26-I é a peptidase Traf, que tem a notável atividade de produzir uma proteína cíclica do sistema pilina de Pseudomonas.

Até o momento três serina-proteases (Silva-Lopez & De-Simone, 2004a, 2004b; Silva-Lopez, Pinto Coelho & De-Simone, 2005), que diferem de outras serina-proteases isoladas de Leishmania (Ribeiro de Andrade et al., 1998), foram caracterizadas enzimaticamente. Uma serina-protease solúvel em detergente (LSP-I) apresenta atividade máxima em 28o C e pH7, sendo sensível a variações de temperatura. Essa enzima tem características de uma 26-Spase-I e está associada a membranas celulares (Silva-Lopez & De-Simone, 2004a), entretanto a sua função celular não está clara. Uma segunda serina-protease solúvel (LSP-II) também com atividade ótima a 28 o C, porém com distinta localização celular, foi isolada (Morgado-Díaz et al., 2005). A localização entre o núcleo e a bolsa flagelar sugere sua associação a processos endocíticos/exocíticos (McConville et al., 2002; Webster & Fish, 1989). A terceira serina-protease (LSP-III) foi purificada do sobrenadante de cultura de promastigotas e apresenta uma boa estabilidade térmica. Anticorpos anti-LSPIII reagiram contra LSP-I sugerindo similaridade estrutural e de localização celular. Em amastigotas, a enzima também foi encontrada em estruturas eletrodensas correspondendo a megassomos, sítios de atividade proteolítica em Leishmania envolvidos em processos de diferenciação e sobrevivência intracelular (Ueda-Nakamura et al., 2002). Podemos então concluir que a LSP-III é uma enzima secretada, podendo estar, portanto, associada à virulência e/ou patogenicidade. Além disso, o fato de essa enzima estar colocalizada em megassomas com outras proteases poderá possibilitar a compreensão do tráfego intracelular de material proteico, evento fundamental para manter o ciclo de vida do parasito (Silva-Lopez & De-Simone, 2004a). Outro fato de extrema importância, comum entre as novas serina-proteases caracterizadas, é a modulação negativa da atividade enzimática por Ca2+, o que contrasta com o efeito modulador de serina-proteases de mamíferos, como tripsina e quimiotripsina pancreáticas que requerem Ca 2+ para sua atividade.

Metalopeptidases (CE 3.4.24)

Metaloproteases são endopeptidases que possuem como componente ativo um átomo de metal de transição, normalmente zinco. Cerca de 16 famílias de metaloproteases foram identificadas nos genomas de Leishmania sp., dentre estas encontra-se a dipeptidil-peptidase II (família M49), enzima que aparentemente está ausente em tripanossomas, aminopeptiases, carboxipeptidases e dipeptidases, enzimas muito pouco estudadas. A gp63 é a enzima de Leishmania sp. melhor caracterizada e tem recebido distintos nomes ao longo de sua caracterização; PSP (peptidase superfície promastigota) e leishmanolisina, embora a denominação ‘principal peptidase de superfície’ (MSP) tenha sido escolhida por estar em conformidade com as recomendações da nomenclatura de genes e proteínas de tripanossomatídeos (Clayton et al., 1998). A MSP (EC 3.4.24.36) é um metalopeptidase com uma sequência de ligação de Zn His-Glu-XX-His (motivo HEXXH, código de letra única) e mais um resíduo C-terminal – o terceiro ligante de zinco. Essa endopeptidase pertence à família M8 e sua estrutura terciária coloca esta família no clã MA, subclã das metzincinas, MA(M) (Schlagenhauf, Etges & Metcalf, 1998). O mecanismo de ação e a especificidade de substrato dessa peptidase são semelhantes aos outros membros da família, sendo ativa em uma ampla faixa de pH. Todas as MSPs de Leishmania sp. estudadas até esta data apresentam alta similaridade (Yao, Donelson & Wilson, 2003) e em promastigotas estão ancoradas por meio de glicosilfosfatidilinositol (GPI).

A expressão da enzima encontra-se aumentada em promastigotas metacíclicos e pode ser um ligante envolvido na interação do parasito com os sistemas de defesa do hospedeiro, incluindo os componentes do sistema complemento e macrófagos. Uma quantidade significativa de MSP está presente no meio extracelular por procedimento autoproteolítico (McGwire et al., 2002) ou secreção (Ellis et al., 2002).

Duas aminopeptidases, a leucilaminopeptidase (LAP) e a metionina aminopeptidase-2 (MetAP2), foram identificadas em Leishmania sp.. A primeira foi clonada e caracterizada bioquimicamente de L. amazonensis, L. donovani e L. major (Morty et al., 1999). A enzima está localizada no citosol de todas as fases do ciclo de vida do parasito e catalisa a remoção de resíduos N-terminais de peptídeos e proteínas. Filogeneticamente é a mais divergente evolutivamente da família M17, incluindo os homólogos de organismos procarióticos e eucarióticos. Além da indicação de que o zinco é o cofator, sua atividade foi demonstrada exclusivamente em substratos sintéticos contendo resíduos leucina, metionina e cisteína, que representam a especificidade de substrato para qualquer LAP conhecida.

Metionina aminopeptidase-2 (MetAP2) é uma enzima monomérica, contendo cobalto. Ela é responsável pela hidrólise do resíduo de metionina iniciador da maioria das proteínas recém-sintetizadas. Essa enzima é fundamental para o crescimento celular e está presente em todos os organismos. A impossibilidade da remoção da Met N-terminal das proteínas recém-sintetizadas acarreta um produto normalmente inativo, fato que leva a um crescimento mais lento ou à letalidade (Lowther & Matthews, 2000). A caracterização fina da enzima MetAP2 e aminopeptidase-básica de tripanossomatídeos ainda não foi realizada, embora sua presença tenha sido detectadas por meio de inibidores específicos. Aspártico-proteases (EC 3.4.23)

Em geral, aspártico-proteases (EC 3.4.23) (EC number = número de classificação da função enzimática, conferido pela Comissão Internacional de Enzimas) são enzimas bilobuladas homólogas com seu centro ativo, constituído de dois resíduos de ácido aspártico (32 e 215; numeração da pepsina suína) distribuídos geometricamente e unitariamente em cada lóbulo. A maioria dessa classe de enzimas pertence à família da pepsina que inclui enzimas digestivas (pepsina, quimosima, catepsinas lisossomais D) e de processamento (renina) e algumas proteases fúngicas (penicillopepsin, rhizopuspepsin, endothiapepsin). A segunda família compreende proteases virais, como a retropsina do vírus causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV/Aids). As retropepsinas, quando sintetizadas, são monoméricas; entretanto, durante a maturação, se dimerizam formando a enzima ativa. Esta família de proteases tem sido muito pouco estudada em tripanossomatídeos e outros agentes parasitários, principalmente por conta de sua pouca relação estrutural. No entanto, felizmente, mais recentemente, tem suscitado um renovado interesse em razão da possibilidade de serem alvos para o desenvolvimento de novos fármacos.

Contrastando com a serina e a cisteína-proteases, a catálise por aspártico-proteases não envolve um intermediário covalente, mas um intermediário tetraédrico. O ataque nucleofílico é atingido pela transferência simultânea de dois prótons: um de uma molécula de água para a díade dos dois grupos carboxilas e um segundo da díade ao oxigênio da carbonila do substrato. Essa catálise ácida-base geral pode ser denominada de mecanismo push-pull e leva à formação não covalente de um intermediário tetraédrico.

Em humanos essa classe de proteases está envolvida em diferentes processos celulares, desde a clivagem de proteínas com finalidade nutricional até processamento e maturação de proteínas intracelulares e intramembranares.

O genoma de L. infantum, L. major e L. amazonensis (dados não mostrados) prevê a sequência gênica de duas aspartil-proteases. Contudo, até o momento somente uma única atividade enzimática foi detectada em sobrenadantes de extratos celulares usando inibidores enzimáticos (Alves et al., 2005). Nosso grupo, entretanto, identificou, isolou e caracterizou bioquímica e estruturalmente duas distintas aspartil-proteases, uma associada à membrana celular e outra a organelas intracelulares que apresentam distintas especificidades de clivagem [dados do autor não publicados]. Da mesma forma duas distintas atividades foram recentemente descritas em T. cruzi, uma solúvel e outra associada a estruturas membranares (Pinho et al., 2009).

Existe, porém, a possibilidade da existência em Leishmania sp. de uma terceira aspartil protease denominada de peptidase peptídeo sinal (PPS) (Rafati et al., 2004; Taheri et al., 2010).

Tais enzimas são conservadas evolutivamente, apresentando representantes em eucariotos superiores, fungos, protozoários, arachea e plantas. As PPSs têm uma relação funcional com a família das presenilinas (PS) aspartilprotease, mas diferem entre si estruturalmente e em vários outros aspectos fundamentais. Tanto as PSs quanto as PPSs clivam proteínas transmembranares, sendo que as PSs clivam proteínas transmembrares tipo-1 enquanto as PPSs clivam proteínas transmembrana tipo-2. Essa classificação corresponde ao sentido de exposição estrutural do domínio catalítico

(Figura 5).

Figura 5 – Representação esquemática da localização membranar

das possíveis estruturas (A) e sentido hidrolítico (B) das presenilina

(PS) e peptidase peptídeo-sinal (PPs) de Leishmania sp.

 

A homologia global entre as PPSs e as PSs é quase nula, todavia as PSs parecem ser proteínas membranares de passo único, enquanto as PPSs de multipasso. As PSs contêm YD e as PPSs GxGD adjacente às membranas e um motivo PAL perto do COOH-terminal conservado de função desconhecida. Diferem quanto à orientação dos domínios transmembrana do sítio ativo (YD e GxGD). Nas PPSs o sítio está invertido em relação às PSs, fato diretamente relacionado à topologia e ao acesso aos substratos

(Figura 5).

As PSs atuam como proteases somente quando associadas ao complexo gama-secretase. Tanto em Leishmania sp. quanto em humanos o papel biológico das PPSs é desconhecido, e apenas alguns substratos endógenos foram identificados em humanos. No entanto, há evidências de que os membros dessa família possam regular processos essenciais tanto fisiologicamente como fisiopatologicamente.

 

Complexos proteicos associados à

transformação proteica e

metabolismo de aminoácidos

 

Proteassoma

É um complexo proteico multienzimático abundante e solúvel presente no citoplasma celular e em outros compartimentos celulares. Tem a função básica de hidrolisar proteínas selecionadas ou anormalmente formadas, a pequenos peptídeos de 3-20 resíduos, os quais são posteriormente transformados em aminoácidos simples por outras enzimas metabólicas. Esse complexo corresponde a aproximadamente 1% do conteúdo total das proteínas celulares e forma subpopulações com composições diferentes de acordo com a fonte de isolamento ou localização.

Tem sido apontado que os proteassomas podem também estar envolvidos na regulação de importantes processos celulares, incluindo a expressão gênica, a progressão do ciclo celular, diferenciação celular e infectividade (Kisselev & Goldberg, 2001).

A proteína que vai ser fragmentada necessita ser reconhecida e direcionada ao sítio da clivagem. O processo de marcação é denominado de ubiquitinação. Nesse processo, as proteínas celulares alvo de degradação são marcadas com a ubiquitina, uma proteína composta por 76 aminoácidos. Essa ligação é iniciada entre a glicina carbóxi-terminal da ubiquitina e o grupo ε-amino da lisina na proteína-alvo que deve ser eliminada. Posteriormente, outras ligações similares entre o carbóxi-terminal da ubiquitina com o grupo ε-amino da lisina de outra molécula de ubiquitina ocorre para formar cadeias poliubiquitinadas. Em algumas proteínas (por exemplo, quando há falta de lisina em proteínas), a poliubiquitinação pode ocorrer no resíduo amino terminal. Além disso, o resíduo de lisina onde ocorre poliubiquitinação é importante porque pode atuar como um sinal de degradação mediada pelo proteassoma. A ubiquitinação em outros resíduos de lisina (Lys-63, por exemplo) pode atuar como um sinal para reparo do DNA, ativação de fatores de transcrição etc. Contudo, a monoubiquitinação de proteínas pode ter outras funções, como por exemplo, endocitose.

No gênero Leishmania, o proteassoma tem sido estudado em L. mexicana (Robertson, 1999), L. donovani (Christensen et al., 2000) e L. chagasi (González et al., 1996; Silva-Jardim, Orta & Ramalho-Pinto, 2004). O proteassoma de L. mexicana se assemelha em tamanho ao de outras espécies, mas parece diferir estruturalmente dos proteassomas de vertebrados.

Apresenta um coeficiente de sedimentação de 20S, massa molecular de 670 kDa (Robertson, 1999) e é composto de pelo menos dez subunidades distintas de 32 kDa. Na presença de adenosina-trifosfato (ATP), sua massa molecular aumenta para 1.200 kDa. O proteassoma 20S purificado de formas promastigotas de L. chagasi apresenta seis proteínas com massas moleculares de 22-35 kDa semelhantes às encontradas para as subunidades de L. mexicana (Robertson, 1999), T. Cruzi (Christensen et al., 2000) e T. brucei (El-Sayed et al., 2005). Tal comportamento se assemelha à de outras espécies eucarióticas, no entanto o proteassoma de L. mexicana tem uma especificidade de substrato mais parecida com a dos proteassomas de eucariontes.

O proteassoma de L. chagasi, assim como outros proteassomas 20S, exibe maior atividade de tripsina em comparação com a atividade quimiotripsina-símile e hidrolisam, substratos com resíduos

volumosos na posição P1 (Figura 6). Em L. mexicana essa posição é ocupada por resíduos hidrofóbicos, básicos e ácidos. Diferentemente, o proteassoma de L. mexicana tem maior atividade quimiotríptica (Robertson, 1999). Tal hipótese é apoiada por experimentos realizados com inibidores específicos da atividade proteassômica, como N-carbobenzoxil-Leu-Leu-leucinal (MG132) e lactacistina (Rock & Goldberg, 1999).

Figura 6 – Representação esquemática do proteassoma 26S de

Leishmania sp.

 

Complexo gama-secretase

O complexo gama-secretase tem características multiproteicas e se encontra presente nas membranas de todos os tipos celulares (desde bactérias até células eucariontes superiores). Tem a função de realizar o processamento seletivo e a maturação de um conjunto de proteínas, em eucariotos superiores denominadas tipo I, endereçadas à membrana plasmática. A composição qualitativa e quantitativa das proteínas do complexo é variável na escala evolutiva. Em eucariotos esse complexo é composto pelas proteínas presenilinas (PSs), nicastrin (Nic), Aph-1 e Pen-2 (detalhes sobre

estas duas últimas, ver legenda da Figura 7). A PS apresenta os dois aspartatos que formam o sítio catalítico. Ela é sintetizada como uma holoproteína que é clivada pós-traducionalmente em um fragmento N-terminal (FNT) e em um FCT, os quais permanecem vinculados como um heterodímero.

Figura 7 – Modelo da possível organização das proteínas

membranares que compõem o complexo gama-secretase de

Leishmania sp.

 

A, C, D – vista lateral; e C – vista de cima.

Aph-1 (faringe-anterior defeituosa 1) – produto do gene da

proteína originalmente identificado na via de sinalização Notch em

Caenorhabditis elegans como um regulador da localização celular

da nicastrina.

Pen-2 (intensificador de presenilina 2) – proteína componente de

regulação do complexo gama-secretase.

Discute-se muito como o processamento proteolítico pode ocorrer em um ambiente hidrofóbico como a membrana celular, entretanto o conhecimento hoje existente desse complexo advém dos estudos realizados até então com C. elegans e células humanas. Esta última está relacionada à doença de Alzheimer e a eventos de transducção de sinal. Nosso grupo tem-se dedicado ao conhecimento e ao mecanismo de ação dessa classe de proteases há alguns anos e, recentemente, conseguiu identificar a presença e a localização celular de todas as proteínas Aph1B, PS-1, PS-2, Nic, Pen-2 que compõem o complexo gama-secretase em Leishmania sp. [dados do autor não publicados]. No momento, estamos solicitando a reanotação das sequências no banco de dados. A grande dificuldade inicial foi a baixa homologia existente entre os componentes dessa classe de proteases, todavia, a descoberta de alguns domínios específicos na estrutura permitiram sua identificação inequivocadamente. Apesar da grande importância fisiológica e na relação parasito-hospedeiro que esse conjunto de proteínas possa ter, uma discussão aprofundada desse complexo foge ao escopo deste capítulo, uma vez que o conhecimento em Leishmania é muito pouco.

 

Oxidação de aminoácidos

Classicamente, a degradação metabólica dos α-aminoácidos inicia-se com a remoção do grupo α-amino, como amônia ou acetato, e pode ser excretado por peixes e outros animais aquáticos. Organismos terrestres, contudo, convertem amônia em componentes não tóxicos como ureia (mamíferos) ou ácido úrico (pássaros e répteis). O esqueleto de carbono remanescente do aminoácido é frequentemente o α-cetoácido, que é então convertido em intermediário capaz de ser assimilado pelo ciclo de Krebs. Entretanto, organismos inferiores, como as Leishmanias, apresentam particularidades em seu metabolismo oxidativo de aminoácidos quando comparados a esses organismos e a outros tripanossomatídeos. Para fins didáticos, discutiremos individualmente os principais aminoácidos que sofrem oxidação,

estando demonstrada na Figura 8 a inter-relação metabólica.

Figura 8 – Metabolismo de aminoácidos de L. major, T. brucei e T.

cruzi

Em preto, estão assinadas as rotas compartilhadas pelos três

tripanossomatídeos. Em cinza, estão anotadas tanto as enzimas

ausentes do metabolismo de aminoácidos como as do ciclo do

glioxilato e ureia (estão presentes na maioria dos outros eucariotos).

A chave indica as diferenças entre L. major, T. brucei e T. cruzi. Os

pontos de interrogação representam os passos em que não houve

uma identificação inequívoca do gene.

Abreviações: Acac – acetoacetato; AdoMet – adenosilmetionina; B

– biopterina; Cit – citrulina; FHD – diidrofolato; HMGCoA – CoA

hidroximetilglutaril; OAA – ácido oxalacético; Orn – ornitina; PGA –

ácido fosfoglicérico; forma – qH2B quinoide de diidrobiopterina; THF

– tetraidrofolato.

Fonte: adaptada de Opperdoes & Coombs, 2007.

Prolina – as enzimas-chave prolina-oxidase e D-1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase foram identificadas nas três espécies de Leishmania cujo genoma foi completado. Como essas enzimas foram também identificadas em T. cruzi e em T. brucei, podemos afirmar que a oxidação da prolina ocorre de maneira semelhante nos três tripanossomatídeos.

Metionina – as enzimas mitocondriais metilmalonil epimerase-CoA (MME-CoA) e metilmalonil mutase-CoA (MMM-CoA) são necessárias para oxidar o 2-cetobutirato (CB) a succinil-CoA. Estas enzimas estão ausentes em T. cruzi e T. brucei, porém foram identificadas em Leishmania major, fato que sugere que a oxidação completa da metionina ocorre somente em Leishmania sp.

Treonina – Leishmania dispõe de duas rotas para metabolizar a treonina. Na primeira, pode converter treonina THF por uma via dependente de glicina usando a enzima serina hydroximetiltransferase (SHMT) (também conhecida como treonina aldolase). Além da desmetilação da serina, a SHMT também é capaz de desfazer a ligação Ca-Cb da treonina. A glicina resultante pode ser convertida a piruvato por THF-dependente do sistema de clivagem da glicina SCG), seguido por uma serina/treonina desidratase (STD). Alternativamente,

pode converter desidratase treonina para 2-cetobutirato, que

depois é oxidado a succinil-CoA (Figura 9).

Figura 9 – Metabolismo da treonina em L. major comparada ao

metabolismo em T. cruzi e em T. brucei

 

Destacamos a rota do cetobutanoato (verde) em L. major,

enquanto em T. brucei e em T. cruzi (laranja) ocorrem à via do

aminoacetona. Nota-se também, em T. brucei, a ausência de

enzimas necessárias ao metabolismo da treonina (violeta).

O T. brucei não dispõe de desidratase e SHMT. Ele parece metabolizar a treonina usando o caminho alternativa da aminoacetone, que envolve uma treonina desidrogenase (TDH) mitocondrial e um sintase aminoacetone (2-amino-3-CoA ligase cetobutirato). Esta é também a principal via de degradação de treonina em mamíferos, mas não é operacional em Leishmania por causa da ausência do TDH mitocondrial.

Leucina – este aminoácido pode sofrer tanto transaminação a 2-cetoisocaproato por uma aminotransferase citoplasmática quanto pode ser oxidado por uma acil-CoA desidrogenase de cadeia-curta-ramificada mitocondrial, uma carboxilase e uma hidratase para hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA).

A enzima seguinte (liase HMGCoA) da via oxidativa clássica não está presente em L. major. Sendo assim, a HMG-CoA é utilizada preferencialmente pela via de síntese de isoprenoides. A presença dessa via metabólica foi demonstrada experimentalmente em L. major (Ginger et al., 2000, 2001). Em T. cruzi e T. brucei, a HMG-CoA segue a via clássica de oxidação, sendo a Leu clivada em acetil-CoA e acetoacetato.

Aminoácidos não comuns/ciclo da ureia – a presença de um ciclo da ureia totalmente funcional em Leishmania sp. está descartada, entretanto várias enzimas deste ciclo foram identificadas em L. major. A primeira enzima, carbamoilfosfato-sintetase está presente tanto em L. major, quanto em T. cruzi e em T. brucei, mas a sintase e a arginase foram identificadas apenas em L. major. Este fato indica que a arginina, a ornitina e a ureia podem ser formadas apenas pela Leishmania, e não por T. brucei e por T. cruzi.

Tais observações esclarecem uma antiga discussão sobre a excreção de ureia/amoníaco por espécies de tripanossomatídeos (Yoshida & Camargo, 1978). Entretanto, esse fato pode ter relação com a presença do estágio do parasito no vacúolo parasitóforo, que apresenta um ambiente ácido e consequentemente incompatível com a liberação de amônia, os quais poderiam afetar o pH de hidrólise de certas enzimas proteolíticas. Isso também pode refletir a utilização de aminoácidos do vacúolo por amastigotas.

A ornitina descarboxilase, alvo da droga antitripanossoma – difluorometilornitina –, encontra-se presente tanto em L. major quanto em T. brucei (mas não em T. cruzi). Entretanto, a falta de eficácia da droga contra a Leishmania parece estar relacionada tanto com o transportador do parasito quanto com o ambiente em que vivem, em vez da ausência da enzima-alvo (Müller et al., 2001).

 

Síntese de aminoácidos

Humanos são capazes de sintetizar 11 dos 20 aminoácidos, ao passo que as leishmânias 13 dos 20 aminoácidos. Portanto, os outros 7-9 aminoácidos necessitam ser assimilados por meio da nutrição. A capacidade de síntese de aminoácidos por Leishmania sp. está limitada aos não essenciais, mais a treonina e a metionina. A maioria dos genes que codificam as enzimas envolvidas na síntese desses aminoácidos foram claramente identificadas nos genomas completados até então.

Serina – -3-fosfoglicerato desidrogenase é a primeira enzima D

da síntese da serina. Está presente em L. major, mas ausente em T. cruzi e em T. brucei, fato que indica diferenças em sua capacidade de sintetizar este aminoácido. Cisteína – a cisteína pode ser produzida pela cisteína-sintase, com a eventual participação da 3-sulfotransferase mercaptopiruvato (STMP). Ambas as enzimas foram identificadas em L. major e seus genes estão também presentes em T. cruzi. Além disso, a cisteína pode ser gerada a partir da homocisteína pela rota da transulfuração, presente tanto em T. cruzi quanto em T. brucei.

Em L. major e T. cruzi, a glicina e a serina podem ser convertidas pela ação do STMP, conforme detalhado anteriormente.

Alanina/Aspártico/Asparagina – a alanina é formada com base no piruvato, pela alanina-aminotransferase citosólica. Já o aspartato e a asparagina podem ser formados, respectivamente, tendo por base o oxaloacetato, pela enzima aspartato aminotransferase mitocondrial e uma asparagina sintetase. Essas enzimas estão presentes também em T. cruzi e

em T. brucei. No entanto, a conversão da asparagina para aspartato não ocorre em T. brucei. Prolina/Glutâmico – a capacidade de Leishmania sp. sintetizar prolina difere substancialmente dos outros tripanossomatídeos. A síntese da -prolina e -glutamato ocorrem por meio de γ-L L

glutamil-fosfato e -1-pirrolina-5-carboxilato, pelas enzimas γ-D

glutamil quinase, γ-glutamil fosfato redutase e -pirrolina-5-D carboxilato redutase.

Em eucariotos superiores, as duas primeiras reações são realizadas normalmente pela enzima bifuncional pirrolina-5-carboxilato sintetase. No entanto, em procariontes, tais atividades são codificadas por distintos genes. O gene correspondente é encontrado em L. major (e em T. cruzi, mas não em T. brucei).

A terceira atividade é catalisada por uma enzima independente e seu gene está presente em todos os três tripanossomatídeos. Dessa forma, Leishmania e T. cruzi são capazes de sintetizar prolina a partir do glutamato, ao passo que T. brucei não terá tal capacidade.

Curiosamente, os genes que codificam as enzimas γ-glutamil quinase e γ-glutamil-fosfato redutase também estão presentes em L. major, mas não em T. cruzi e em T. brucei. A reconstrução filogenética indicou que essas duas enzimas têm origem bacteriana, enquanto a pirrolina-5-carboxilato sintetase bifuncional é de origem eucariótica.

Lisina/Treonina/Metionina/Aspártico – a síntese dos aminoácidos essenciais lisina, treonina e metionina, com base no ácido aspártico, como ocorre em alguns organismos, parece não existir ou é incompleta em todos os três tripanossomatídeos. Os genes que codificam a aspartato-quinase (AK) e a aspartato-semialdeído desidrogenase (AAD) não foram detectados em Leismania sp. Sendo assim, a síntese ‘de novo’ de aspartato parece não ocorrer. L. major parece ser capaz de sintetizar tanto a metionina quanto a treonina a partir de semialdeído aspartato, mas tal conversão parece estar ausente nos dois outros tripanossomatídeos.

Aminoácidos aromáticos/ramificados/Lisina/Histidina – os aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr ou Trp), os aminoácidos ramificados (Leu, Ile e Val) e a Lys e His não são sintetizados tanto por Leshmania sp. quanto T. cruzi e T. Brucei, por conta da ausência dos respectivos genes. Portanto, para serem utilizados em suas proteínas, necessitam ser assimilados do meio externo.

 

Conclusões e perspectivas

A conclusão dos vários genomas de Leishmania sp. e de outros parasitos tem trazido avanços importantes no conhecimento do metabolismo geral dos diversos organismos. Entretanto, a anotação de genomas de parasitos não é simples por conta da sua grande divergência e viés de composição e, portanto, suscetíveis a pequenas modificações à medida que são determinadas as funções dos genes não identificados nas primeiras rodadas/análises.

Para alguns procariotos de interesse industrial significativo, a reconstrução de redes metabólicas já provou ser útil, por exemplo, no aumento da produção de um produto metabólico desejado. No contexto de um organismo patogênico como Leishmania sp., a reconstrução metabólica teria o potencial de desempenhar um importante papel para se entender a biologia do parasito e na descoberta de alvos ou estratégias para o desenvolvimento de novos medicamentos.

Deu-se início ao sequenciamento de projetos genômicos de Leishmania sp., os quais necessitam ser incrementados em razão da grande variabilidade de espécies. Além disso, os genomas de Leishmania existentes hoje nos bancos de dados foram feitos com o uso de espécies isoladas de invertebrados. Agora, os esforços em curso direcionam-se para dar sentido a essa massa de informações em termos de produtos codificados e suas interações no crescimento, desenvolvimento e sobrevivência. Em relação ao metabolismo proteico geral, em Leishmania evidenciam-se três distintos mecanismos proteolíticos de processamento de proteínas: os eventos que ocorrem no interior dos fagolisossomas; os dependentes dos proteassomas; e agora, os dependentes do complexo gama-secretase. Embora cada um tenha especificidade funcional, todos estão interligados por meio de blocos de construção das proteínas, os aminoácidos. Tais elementos tem enorme importância tanto para a síntese de proteínas endógenas, quanto para poliaminas e outros compostos essenciais à sobrevivência do parasito, além de funcionarem como osmólitos.

Como já apresentado, parece que existe uma constância qualitativa das enzimas transportadoras e de oxidação e síntese de aminoácidos identificadas, entre as três espécies de Leishmania e variações importantes com outros flagelados. Da mesma forma, esse fato ocorre também com proteases, proteassomas e com os complexos membranares proteicos. Contudo, diferenças estruturais são evidentes em quase todas essas proteínas, que, de certa forma, podem funcionar como alvos para o desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, como as propriedades funcionais desses grupos especiais de proteínas são estritamente dependentes de sua estrutura, a função biológica final, em termos de atividade, pode estar aumentada ou diminuída entre as várias espécies. Consequentemente, tal circunstância pode ocasionar modulação de comportamento – isto é, maior ou menor agressividade ou patogenicidade, quer seja no invertebrado vetor, quer no hospedeiro definitivo –, expressa ou evidenciada na relação hospedeiro-parasito e, por conseguinte, na forma ou no fenótipo da doença.

 

Referências

ALVES, C. R. et al. Leishmnaia amazonensis: early proteinase activities during promastigote-amastigote differentiation in vitro. Experimental Parasitology, 109: 38-48, 2005.

ASHALL, F. et al. Substrate specificity and inhibitor sensitivity of a trypanosomatid alkaline peptidase. Biochimica et Biophysica Acta, 1.035: 293-299, 1990.

BROOKS, D. R. et al. Processing and trafficking of cysteine proteases in Leishmania mexicana. Journal of Cell Science, 13: 4.035-4.041, 2000.

BURCHMORE, R. J. & BARRETT, M. P. Life in vacuoles-nutrient acquisition by Leishmania amastigotes. International Journal for Parasitology, 31: 1.311-1.320, 2001.

CHRISTENSEN, C. B. et al. Molecular characterization of a Leishmania donovani cDNA clone with similarity to human 20S proteasome a-type subunit. Biochimica et Biophysica Acta, 1.500: 77-87, 2000.

CLAYTON, C. et al. Genetic nomenclature for Trypanosoma and Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology, 97: 221-224, 1998.

COOMBS, G. H. & MOTTRAM, J. C. Parasite proteinases and amino acid metabolism: possibilities for chemotherapeutic exploitation. Parasitology, 114, supl.: S61-S80, 1997.

DARLING, T. N. et al. Carbon dioxide abolishes the reverse Pasteur effect in Leishmania major promastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology, 33: 191-202, 1989.

DARLYUK, I. et al. Arginine homeostasis and transport in the human pathogen Leishmania donovani. The Journal of Biological Chemistry, 284: 19.800-19.807, 2009.

ELLIS, M. et al. Processing and trafficking of Leishmania mexicana GP63: analysis using GPI8 mutants deficient in glycosylphoaphatidylinositol protein anchoring. The Journal of Biological Chemistry, 277: 27.968-27.974, 2002.

EL-SAYED, N. M. et al. Comparative genomics of trypanosomatid parasitic protozoa. Science, 309: 404-409, 2005.

FÜLÖP, V.; BÖCSKEI, Z. & POLGÁR, L. Prolyl oligopeptidase: an unusual â-propeller domain regulates proteolysis. Cell, 94: 161-170, 1998.

GERCZEI, T.; KESERU, G. M. & NARAY-SZABO, G. Construction of a 3D model of oligopeptidase B, a potential processing enzyme in prokaryotes. Journal of Molecular Graphics and Modelling, 18: 7-17, 2000.

GINGER, M. L. et al. Utilization of leucine and acetate as carbon sources for sterol and fatty acid biosynthesis by Old and New World Leishmania species, Endotrypanum monterogeii and Trypanosoma cruzi. European Journal of Biochemistry, 267: 2.555-2.566, 2000.

GINGER, M. L. et al. The biosynthetic incorporation of the intact leucine skeleton into sterol by the trypanosomatid Leishmania mexicana. The Journal of Biological Chemistry, 276: 11.674-11.682, 2001.

GONZÁLEZ, J. et al. Proteasome activity is required for the stage-specific transformation of a protozoan parasite. The Journal of Experimental Medicine, 184: 1.909-1.918, 1996.

GUEDES, H. L. M. et al. Oligopeptidase B-2 from Leishmania amazonensis with an usual C-terminal extension. Acta Parasitology, 53: 197-204, 2008.

GUEDES, H. L. M. et al. Serine proteases of Leishmania amazonensis as immunomodulatory and disease-aggravating components of the crude LaAg. Vaccine, 28: 5.491-5.495, 2010.

HART, D. T. & COOMBS, G. H. The effects of carbon dioxide and oxygen upon the growth and in vitro transformation of Leishmania mexicana mexicana. Molecular and Biochemical Parasitology, 4: 1.117-1.174, 1981.

HEMERLY, J. P. et al. Subsite specificity (S3, S2, S1’, S2’ and S3’) of oligopeptidase B from Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei using fluorescent quenched peptides: comparative study and identification of specific carboxypeptidase activity. The Biochemical Journal, 373: 933-939, 2003.

IVENS, A. C. et al. The genome of the Kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science, 309: 436-442, 2005.

JULIANO, M. A. et al. Differences in substrate specificities between cysteine protease CPB isoforms of Leishmania mexicana are mediated by a few amino acid changes. European Journal of Biochemistry, 271: 3.704-3.714, 2004.

KISSELEV, A. F. & GOLDBERG, A. L. Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chemistry and Biology, 8: 739-758, 2001.

LOWTHER, W. & MATTHEWS, B. W. Structure and function of the methionine aminopeptidases. Biochimica et Biophysica Acta, 1.477: 157-167, 2000.

McCONVILLE, M. J. et al. Secretory patway of trypanosomatid parasite. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66: 122-154, 2002.

McCONVILLE, M. J. et al. Living in a phagolysosome; metabolism of Leishmania amastigote. Trends in Parasitology, 23: 368-375, 2007.

McGWIRE, B. S. et al. Extracellular release of the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked Leishmania surface metalloprotease, gp63, is independent of GPI phospholipolysis: implications for parasite virulence. Journal of Biological Chemistry, 277(11): 8.802-8.809, 2002.

MORGADO-DÍAZ, J. A. et al. Subcellular localization of an intracellular serine protease of 68 kDa in Leishmania (Leishmania) amazonensis promastigotes. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 100: 377-383, 2005.

MORTY, R. E.; FÜLÖP, V. & ANDREWS, N. W. Substrate recognition properties of oligopeptidase B from Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 184: 3.329-3.337, 2002.

MORTY, R. E. et al. Oligopeptidase B from Trypanosoma brucei, a new member of an emerging subgroup of serine oligopeptidases. The Journal of Biological Chemistry, 274: 26.149-26.156, 1999.

MOTTRAM, J. C.; COOMBS, G. H. & ALEXANDER, J. Cysteine peptidases as virulence factors of Leishmania. Current Opinion in Microbiology, 7: 375-381, 2004.

MOTTRAM, J. C. et al. A cysteine proteinase cDNA from Trypanosoma brucei predicts an enzyme with an unusual C-terminal extension. Febs Letter, 258: 211-215, 1989.

MÜLLER, S. et al. Targeting polyamines of parasitic protozoa in chemotherapy. Trends in Parasitology, 17: 242-249, 2001.

MUNDODI, V. et al. Genomic organization and functional expression of differentially regulated cysteine protease genes of Leishmania donovani complex. Gene, 282: 257-265, 2002.

OPPERDOES, F. R. & COOMBS, G. H. Metabolism of Leishmania: proven and predicted. Trends in Parasitology, 23: 150-158, 2007.

PACAUD, M. & RICHAUD, C. Protease II from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry, 250: 7.771-7.779, 1975.

PINHO, R. T. et al. Trypanosoma cruzi: isolation and characterization of aspartyl proteases. Experimental Parasitology, 122:128-133, 2009.

POLGÁR, L. A potential processing enzyme in prokaryotes: oligopeptidase B, a new type of serine peptidase. Proteins, 28: 375-379, 1997.

POLGÁR, L. The prolyl oligopeptidase family. Cellular and Molecular Life Sciences, 59: 349-362, 2002.

RAFATI, S. et al. Type I signal peptidase from Leishmania is a target of the immune response in human cutaneous and visceral leishmaniosis. Molecular & Biochemical Parasitology, 135: 13-20, 2004.

RAWLINGS, N. D.; MORTON, F. R. & BARRETT, A. J. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Research, 34: D270- D272, 2006.

REA, D. & FÜLÖP, V. Structure-function properties of prolyl oligopeptidase family enzymes. Cell Biochemistry and Biophysics, 44: 349-365, 2006.

RIBEIRO DE ANDRADE, A. et al. Leishmania (Leishmania) amazonensis: purification and enzymatic characterization of a soluble serine oligopeptidase from promastigotes. Experimental Parasitology, 89: 153-160, 1998.

ROBERTSON, C. D. The Leishmania mexicana proteasome. Molecular and Biochemical Parasitology, 103: 49-60, 1999.

ROBERTSON, C. D. & COOMBS, G. H. Characterization of three groups of cysteine proteinases in the amastigotes of Leishmania mexicana mexicana. Molecular and Biochemical Parasitology, 42: 269-276, 1990.

ROCK, K. L. & GOLDBERG, A. L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides. Annual Review of Immunology, 17: 739-779, 1999.

SCHLAGENHAUF, E.; ETGES, R. & METCALF, P. The crystal structure of the Leishmania major surface proteinase leishmanolysin (gp63). Structure, 6: 1.035-1.046, 1998.

SELZER, P. M. et al. Cysteine protease inhibitors as chemotherapy: lessons from a parasite target. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96: 11.015-11.022, 1999.

SHAKED-MISHAN, P. et al. A novel high-affinity arginine transporter from the human parasitic protozoan Leishmania donovani. Molecular Microbiology, 60: 30-38, 2006.

SILVA-JARDIM, I.; ORTA, M. F. & RAMALHO-PINTO, F. J. The Leishmania chagasi proteasome: role in promastigotes growth and amastigotes survival within murine macrophages. Acta Tropica, 91: 121-130, 2004.

SILVA-LOPEZ, R. E. & DE-SIMONE, S. G. A serine protease from detergent soluble extract of Leishmania (Leishmania) amazonensis. Zeitschrift für Naturforschung. C, 59c: 590-598, 2004a.

SILVA-LOPEZ, R. E. & DE-SIMONE, S. G. Leishmania (Leishmania) amazonensis: Purification and characterization of a promastigote serine protease. Experimental Parasitology, 107: 173-182, 2004b.

SILVA-LOPEZ, R. E.; PINTO COELHO, M. G. & DE-SIMONE, S. G. Purification of an extracellular serine protease from Leishmania (Leishmania) amazonensis. Parasitology, 130: 1-13, 2005.

TAHERI, T. et al. Leishmania major: disruption of signal peptidase type I and its consequences on survival, growth and infectivity. Experimental Parasitology, 126: 135-145, 2010.

TARDIEUX, L. et al. Lysosome recruitment and fusion are early events required for trypanosome invasion of mammalian cells. Cell, 71: 1.117-1.130, 1992.

UEDA-NAKAMURA, T. et al. Expression and processing of megasome cysteine proteinases during Leishmania amazonensis differentiation. Parasitology Research, 88: 332-337, 2002. WEBSTER, P. & FISH, W. R. Endocytosis by African trypanosomes. II. Occurrence in different life-cycle stages and intracellular sorting. European Journal of Cell Biology, 49: 303-310, 1989.

YAO, C.; DONELSON, J. E. & WILSON, M. E. The major surface protease (MSP or GP63) of Leishmania sp. Biosynthesis, regulation of expression, and function. Molecular and Biochemical Parasitology, 132: 1-16, 2003.

YOSHIDA, N. & CAMARGO, E. P. Ureotelism and ammonotelism in trypanosomatids. Journal of Bacteriology, 136: 1.184-1.186, 1978.