12. Marcadores Moleculares Empregados no Estudo do Complexo Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae)

12. Marcadores moleculares

empregados no estudo do

complexo Lutzomyia

longipalpis (Diptera:

Psychodidae: Phlebotominae)

Luiz Guilherme S. R. Bauzer, Alexandre A. Peixoto

Adistribuição geográfica do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis s.l. (Lutz & Neiva, 1912), principal vetor de Leishmania infantum (considerada como sinônimo de Leishmania chagasi) nas Américas, compreende uma área que se estende do sul do México até o norte da Argentina, cobrindo assim uma variedade de hábitats (Martins, Willians & Falcão, 1978; Young & Duncan, 1994; Soares & Turco, 2003; Lainson & Rangel, 2005). Algumas populações desse vetor estão, portanto, separadas por cadeias montanhosas e inúmeras outras possíveis barreiras geográficas, climáticas e ecológicas que podem estar associadas a padrões de divergência populacional. E ainda, estudos de soltura e recaptura indicaram que o fluxo genético entre populações de Lu. longipalpis s.l. talvez seja limitado pela distância, já que os espécimes marcados revelaram um curto alcance de voo (Dye, Davies & Lainson, 1991; Morrison et al., 1993). Portanto, existe um considerável grau de isolamento entre certas populações de Lu. longipalpis s.l., o qual possivelmente resultou em um processo de divergência genética com potencial surgimento de novas espécies dentro desse complexo (Lanzaro et al., 1993; Alexander et al., 1998). E mais: populações locais podem ter experimentado diferentes padrões evolutivos, com possíveis implicações na capacidade de transmitir leishmaniose (Lanzaro & Warburg, 1995).

Nos mais diversos organismos, o processo de especiação não é necessariamente acompanhado por mudanças morfológicas. Assim, são comuns casos onde duas ou mais espécies morfologicamente idênticas (espécies crípticas) recebem o mesmo nome, apesar de satisfazerem o conceito biológico de espécies (Mayr, 1963). O desafio taxonômico imposto pelas espécies crípticas foi reconhecido há mais de trezentos anos (Winker, 2005), e o advento de técnicas moleculares permitiu o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção e diferenciação de espécies com similaridades morfológicas (Bickford et al., 2007).

Uma variedade de marcadores genéticos já foi empregada em populações de Lu. longipalpis s.l. de distintos países da América Latina, para melhor compreensão taxonômica desse importante inseto vetor. Entretanto, não há ainda um consenso quanto ao número e distribuição dos membros desse complexo de espécies, já que os trabalhos que empregam diferentes marcadores moleculares apresentam conclusões divergentes – revisão feita por Bauzer e colaboradores (2007). Isso sugere fortemente a ocorrência de eventos recentes, ou incipientes, de especiação dentro do complexo, com uma provável associação com introgressão (Araki et al., 2009). Muitos dados gerados até o momento indicam um nível de complexidade que se assemelha ao observado no complexo Anopheles gambiae s.l. e An. gambiae s.s. (Ayala & Coluzzi, 2005). Divergência genética entre populações do complexo Lu. longipalpis já foi estudada com base no emprego de diferentes técnicas e marcadores moleculares, tais como isoenzimas, Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) de DNA mitocondrial, Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD), microssatélites e sequenciamento de DNA nuclear e mitocondrial. Tais técnicas diferem em termos de sensibilidade, custo, reprodutibilidade e tempo de execução. Marcadores moleculares baseados em DNA são ferramentas particularmente úteis para o estudo de complexos de espécies, já que a variabilidade observada é normalmente maior do que aquela produzida por marcadores isoenzimáticos (Loxdale & Lushai, 1998).

Neste capítulo, procuramos revisar mais detalhadamente apenas os trabalhos que utilizaram DNA como ferramenta molecular para a elucidação do status taxonômico de Lu. longipalpis s.l.. Portanto, não fizemos uma revisão dos trabalhos que empregaram marcadores isoenzimáticos, embora muitos sejam citados ao longo do texto. Dentre as técnicas que utilizam DNA, também não discutimos os trabalhos envolvendo RAPD (Williams et al., 1990). Essa técnica foi bastante empregada, no passado, em muitos organismos e já foi também utilizada em Lu. longipalpis s.l. (Dias et al., 1998; Queiroz Balbino et al., 2006). Contudo, tem sido cada vez menos empregada nos dias atuais, por conta da sua reputação em relação a dois fatores: baixa reprodutibilidade – o que causa sérios problemas na comparação de resultados de diferentes estudos – e sua desvantagem em revelar somente marcadores dominantes.

Os tópicos seguintes apresentam resultados e conclusões obtidos com o emprego de alguns tipos de marcadores moleculares (DNA mitocondrial, genes envolvidos no controle do comportamento e microssatélites) em estudos de diferenciação genética do complexo Lu. longipalpis.

 

DNA Mitocondrial (mtDNA)

Um dos primeiros trabalhos a utilizar mtDNA como marcador molecular para o estudo do complexo Lu. longipalpis foi publicado por Soto e colaboradores (2001), tendo empregado um fragmento que consistia da metade 3’ do gene mitocondrial ND4 (subunidade quatro da NADH desidrogenase). Segundo os autores, o objetivo primário do estudo foi utilizar uma fonte adicional não relacionada às técnicas previamente empregadas para inferir divergência e especiação em Lu. longipalpis s.l., tais como isoenzimas (Lanzaro et al., 1993; Soto et al., 2001), morfometria (Dujardin et al., 1997), cariotipagem e bandeamento cromossômico (Yin et al., 1999). Foram utilizados espécimes de campo da Colômbia, Guatemala e Honduras, assim como espécimes de colônia do Brasil, Colômbia,

Costa Rica e Venezuela (Quadro 1).

Quadro 1 – Alguns dos principais marcadores moleculares

empregados em estudos de diferenciação genética entre espécies

do complexo Lu. longipalpis, com as respectivas localidades e

referências

Classe Marcador Localidades Referências

mtDNA ND4 Lutzomyia (Soto et al.,

longipalpis 2001) Tulumajillo (El

Progreso) –

Guatemala

Rancho Grande (La

Paz) – Honduras

San Francisco de

Coray (Valle) –

Honduras

Los Guatales

(Valle) – Honduras

Isla El Tigre (Valle)

– Honduras

Pavana (Choluteca)

– Honduras

Liberia

(Guanacaste) –

Costa Rica

Girón (Santander) –

Colômbia

El Callejon

(Cundinamarca) –

Colômbia

Neiva (Huila) –

Colômbia

El Batatillo (Trujillo)

– Venezuela

Sobral (Ceará) –

Brasil

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

mtDNA COI Lutzomyia (Arrivillaga

longipalpis et al., 2002, Bucaramanga 2003) (Santander) –

Colômbia

Neiva (Huila) –

Colômbia

Liberia

(Guanacaste) –

Costa Rica

Pavana (Choluteca)

– Honduras

Trujillo (Trujillo) –

Venezuela

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Baturité (Ceará) –

Brasil

Santarém (Pará) –

Brasil

Salvaterra, Ilha de

Marajó (Pará) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Pacaraima

(Roraima) – Brasil

Lutzomyia

pseudolongipalpis

Curarigua (Lara) –

Venezuela

El Paso (Lara) –

Venezuela

mtDNA Subunidade Lutzomyia (Arrivillaga

ribossomal longipalpis et al., 2003) 12S Bucaramanga

(Santander) –

Colômbia

Neiva (Huila) –

Colômbia

Liberia

(Guanacaste) –

Costa Rica

Pavana (Choluteca)

– Honduras

Trujillo (Trujillo) –

Venezuela

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Baturité (Ceará) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Pacaraima

(Roraima) – Brasil

Lutzomyia

pseudolongipalpis

Curarigua (Lara) –

Venezuela

El Paso (Lara) –

Venezuela

mtDNA Subunidade Lutzomyia Arrivillaga et

ribossomal longipalpis al., 2003) 16S Bucaramanga

(Santander) –

Colômbia

Neiva (Huila) –

Colômbia

Liberia

(Guanacaste) –

Costa Rica

Pavana (Choluteca)

– Honduras

Trujillo (Trujillo) –

Venezuela

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Baturité (Ceará) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Pacaraima

(Roraima) – Brasil

Lutzomyia

pseudolongipalpis

Curarigua (Lara) –

Venezuela

mtDNA Citocromo Lutzomyia (Hodgkinson

b longipalpis et al., 2002,

Natal (Rio Grande 2003; do Norte) – Brasil Coutinho-

Patos (Paraíba) – Abreu et al.,

Brasil 2008) João Pessoa

(Paraíba) – Brasil

Itamaracá

(Pernambuco) –

Brasil

Calumbi

(Pernambuco) –

Brasil

Juazeiro (Bahia) –

Brasil

Monte Santo

(Bahia) – Brasil

Feira de Santana

(Bahia) – Brasil

Pancas (Espírito

Santo) – Brasil

Gene nuclear period Lutzomyia (Araki et al.,

longipalpis 2009; Marajó (Pará) – Bauzer et

Brasil al., 2002a,

Sobral (Ceará) – 2002b;

Brasil Vigoder et *

Natal (Rio Grande al., 2010) do Norte) – Brasil

Teresina (Piauí) –

Brasil

Estrela de Alagoas

(Alagoas) – Brasil* Jacobina (Bahia) –

Brasil

Jaíba (Minas

Gerais) – Brasil* Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Pancas (Espírito

Santo) – Brasil

Barra de Guaratiba

(Rio de Janeiro) –

Brasil

Mesquita (Rio de

Janeiro) – Brasil

Lutzomyia cruzi

Corumbá (Mato

Grosso do Sul) –

Brasil

Gene nuclear cacophony Lutzomyia (Bottecchia

longipalpis et al., 2004) Sobral (Ceará) –

Brasil* Natal (Rio Grande

do Norte) – Brasil

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Gene nuclear paralytic Lutzomyia (Lins, Souza

longipalpis & Peixoto,

Sobral (Ceará) – 2008)

Brasil*

Microssatélites LIST6 002 Lutzomyia (Watts et al.,

(a) longipalpis 2005; LIST6 004 Maingon et Altagracia

(a) al., 2003) (Guárico) –

LIST6 006 Venezuela

(a) El Layero (Guárico)

LIST6 012 – Venezuela

(a) Guayabita (Aragua)

LIST6 029 – Venezuela

(a) Las Cabreras

(Nueva Esparta) –

Venezuela

Sobral (Ceará) –

Brasil* Marajó (Pará) –

Brasil

Natal (Rio Grande

do Norte) – Brasil

Jacobina (Bahia) –

Brasil

Lapinha (Minas

Gerais) – Brasil

Lutzomyia

pseudolongipalpis

La Rinconada,

Curarigua (Lara) –

Venezuela

Lutzomyia cruzi

Corumbá (Mato

Grosso do Sul) –

Brasil

Ladário (Mato

Grosso do Sul) –

Brasil

* Localidades com ocorrência de espécies simpátricas.

(a) Pares de iniciadores que flanqueiam cinco loci de

microssatélites dinucletotídicos (CA) , não ligados. n

As análises foram feitas com um fragmento de 618 pares de base e a diferenciação entre as populações foi estimada principalmente pelo índice de fixação Fst (Hudson, Slatkin & Maddison, 1992). Os resultados indicaram que algumas populações alopátricas eram suficientemente divergentes para representar espécies diferentes, segundo os autores. Cálculos feitos apenas para os espécimes de campo da América Central apontaram um efeito altamente significativo da distância geográfica na diferenciação do gene ND4. Contudo, uma alta diferenciação genética foi observada entre a população da Guatemala e as de Honduras, sugerindo ausência de fluxo gênico entre as populações relativamente próximas.

De todo modo os autores concluem que, com a possível exceção da população da Guatemala, a divergência entre as sequências das populações da América Central foi consistente com a existência de uma espécie única, porém estruturada. Análise de máxima parcimônia detectou quatro clados correspondentes ao norte da América do Sul, à América Central, ao Brasil e a uma população colombiana (Girón), que se mostrou mais relacionada com as populações brasileiras do que com as demais populações da América do Sul. Dentro do clado do norte da América do Sul, as sequências oriundas de El Batatillo (Venezuela) e aquelas de duas localidades da Colômbia central (El Callejon e Neiva) apresentaram valores suficientemente altos para sugerir que barreiras ao fluxo gênico pudessem existir entre elas, levando assim ao questionamento da coespecificidade dessas populações. Já na linhagem brasileira, houve grande diferenciação dos espécimes da colônia de Sobral quando comparados aos das colônias de Jacobina e Lapinha, o que levou os autores a também questionar a natureza coespecífica das populações brasileiras de Lu. longipalpis s.l..

Nos dois anos subsequentes, novos trabalhos foram publicados por Arrivillaga e colaboradores (2002, 2003) utilizando mtDNA como marcador molecular no estudo do complexo Lu. longipalpis. Nestes, sequências do gene citocromo c oxidase I (COI) foram empregadas na análise filogeográfica de populações de Lu. longipalpis s.l. de

cinco países da América Latina (ver Quadro 1). No total, 19 haplótipos foram revelados por análise de SSCP e confirmados por sequenciamento. Árvores construídas com base nos métodos de neighbor-joining e máxima parcimônia revelaram quatro clados entre as populações estudadas, que, de acordo com os autores, definem quatro diferentes espécies: espécie A (clado brasileiro, representado pelas populações de Lapinha, Salvaterra, Santarém, Jacobina e Baturité), espécie B (clado de Lara, representado pelas populações venezuelanas de Curarigua e El Paso), espécie C (clado cisandino, representado pelas populações de Trujillo, Bucaramanga, Neiva e Roraima) e espécie D (clado transandino, representado pelas populações de Pavana, Liberia, Bucaramanga e Trujillo). No entanto, esses dois últimos clados não foram tão fortemente apoiados pelos valores de bootstrap, e a ocorrência em simpatria de haplótipos próximos entre amostras de Bucaramanga e Trujillo também não deu apoio à monofilia dos clados trans e cisandinos.

Lanzaro e colaboradores (1993) já haviam demonstrado barreiras reprodutivas, com formação de machos híbridos estéreis, em cruzamentos recíprocos entre membros desses dois clados. Além disso, a noção de que os clados cis e transandinos representam espécies biológicas é apoiada por estudos de isoenzimas entre essas populações, em que foram revelados níveis de distância genética consistentes com o observado em espécies do gênero Lutzomyia (Lanzaro & Warburg, 1995; Arrivillaga et al., 2003; Lanzaro et al., 1998; Mutebi et al., 1998). Análise filogenética das sequências do gene COI, por máxima parcimônia, revelou relações próximas entre as populações brasileiras. Tais resultados concordaram com análises baseadas em variação de isoenzimas aplicadas às mesmas populações, com exceção da de Roraima, que não foi incluída nos estudos isoenzimáticos (Mukhopadhyay et al., 1998; Arrivillaga et al., 2003; Mutebi et al., 1999; Azevedo et al., 2000).

Apesar da caracterização de um clado brasileiro, o gene COI indicou a existência de pelo menos duas espécies no Brasil, visto que a população brasileira de Roraima está agrupada com a população de Neiva (Colômbia), formando o clado cisandino. A análise indicou também que a separação do clado de Lara dos demais é a mais antiga, já que ambos os métodos de neighbor-joining e máxima parcimônia o colocam em uma posição mais basal. Na verdade, a espécie que representa esse clado já tinha sido descrita morfologicamente, sendo chamada de Lutzomyia pseudolongipalpis (Arrivillaga & Feliciangeli, 2001).

Variações nos genes mitocondriais ribossomais 12S e 16S também foram utilizadas por Arrivillaga e colaboradores (2003), para esclarecer relações filogenéticas e taxonômicas entre algumas das 13 populações de Lu. longipalpis estudadas com o gene COI (ver

Quadro 1). Para os dois marcadores ribossomais, o polimorfismo foi detectado tanto por análise de SSCP quanto por sequenciamento. As análises filogenéticas das sequências de mtDNA ribossomal revelaram alto grau de homogeneidade entre amostras representativas de uma vasta área geográfica, contrastando com os resultados apontados com o marcador COI. Os autores sugerem que os resultados obtidos com a análise dos genes ribossômicos mitocondriais se devem à sua lenta taxa de evolução.

Outro marcador mitocondrial empregado nos estudos de genética de populações de Lu. longipalpis s.l. foi o gene citocromo b (cyt b), primeiramente utilizado por Hodgkinson e colaboradores (2003) em uma análise combinada de SSCP e de sequenciamento da sua porção 3’. O objetivo foi testar a confiabilidade da técnica SSCP aplicada ao cyt b na caracterização da variabilidade genética desse inseto vetor. Para tal, iniciadores de PCR foram desenhados com base na sequência consenso de táxons bem separados. Espécimes brasileiros de flebotomíneos foram coletados em Juazeiro e Natal

(ver Quadro 1), localidades com diferentes altitudes e características de vegetação, separadas por aproximadamente 715 quilômetros.

Comparações entre os haplótipos identificados por SSPC e suas respectivas sequências confirmaram a confiabilidade da técnica. Isso por que, além da detecção de diferenças nucleotídicas únicas em variantes SSPC, não houve variação nas sequências de espécimes com a mesma mobilidade. O alinhamento de sequências de 261 pares de base de 36 indivíduos identificou 16 sítios segregantes em um total de 21 haplótipos, revelando ainda seis haplótipos compartilhados pelas populações.

Uma vez confirmada a possibilidade do emprego desse marcador para o estabelecimento de padrões de variação genética entre populações de Lu. longipalpis s.l., o mesmo foi empregado em outro estudo feito por Hodgkinson e colaboradores (2003) com amostras de campo das populações de Natal, Itamaracá, Juazeiro, Monte

Santo, Feira de Santana e Pancas (ver Quadro 1), que representam um transecto geográfico da região leste do Brasil. Fragmentos de 261 pares de base, correspondentes à porção 3’ terminal do DNA mitocrondrial cyt b, foram alinhados e trinta haplótipos foram observados, de um total de 78 espécimes. Os autores notaram uma transição geográfica, a 10º de latitude sul, que marcou uma estruturação das populações analisadas. Somente as três populações ao norte do paralelo 10º S foram suficientemente homogêneas para indicar uma alta probabilidade de fluxo genético entre elas. Os autores concluíram ainda que, com exceção da população de Pancas, o padrão filogeográfico das populações amostradas não pôde ser atribuído ao isolamento simples por distância. A comparação par a par entre três populações ao sul do paralelo 10º S (Pancas, Monte Santo e Feira de Santana) apontou uma diferenciação não somente entre elas próprias, mas também entre cada uma destas e as populações do norte, indicando um fluxo genético limitado entre as amostras analisadas. Entretanto, os autores concluíram que a divergência genética entre as sequências representativas dos clados do norte e as do sul foi pequena, apontando para uma diferenciação geográfica intraespecífica.

Finalmente, uma recente análise de polimorfismos do gene mitocondrial cyt b foi feita por Coutinho-Abreu e colaboradores (2008) em um trabalho que teve como objetivo investigar o possível papel do rio São Francisco na definição da atual distribuição das espécies crípticas de Lu. longipalpis s.l. do leste do Brasil. A análise de variabilidade genética incluiu 29 haplótipos descritos anteriormente por Hodgkinson e colaboradores (2002, 2003) e mais cinco novos obtidos de amostras selvagens das populações de

Calumbi, João Pessoa e Patos, no Nordeste do Brasil (ver Quadro

1). Uma árvore neighbor-joining de distância genética baseada em valores de Fst (Hudson, Slatkin & Maddison, 1992) revelou dois clados: o primeiro incluiu as populações de Natal, Patos, Juazeiro, João Pessoa e Itamaracá; o segundo incluiu populações de Calumbi, Pancas, Monte Santo e Feira de Santana. O paralelo 10º S é a latitude aproximada do trecho onde o rio São Francisco deixou de correr no sentido sul-norte, desviando-se para leste durante a glaciação Mindel. Os resultados indicaram que todas as populações do primeiro clado se encontram ao norte do paralelo 10º S e as populações do segundo clado, com exceção da população de Calumbi, são encontradas ao sul do paralelo 10º S. Baseados no relógio molecular do cyt b, os autores estimaram um tempo de divergência entre os grupos de aproximadamente 0,45 milhão de anos, tempo este que coincide com o período em que o rio São Francisco mudou a direção de seu curso.

 

Genes nucleares envolvidos no

controle do comportamento

Em um grande número de insetos, sinais acústicos emitidos durante a corte/cópula atuam de forma importante no isolamento reprodutivo entre espécies próximas, um processo bem caracterizado em Drosophila (Kyriacou & Hall, 1980, 1982, 1986; Ritchie, Halsey & Gleason, 1999; Sakai & Ishida, 2001). Neste inseto modelo, period (per), um dos genes envolvidos com tal aspecto do comportamento reprodutivo se revelou um marcador molecular interessante para o estudo do processo de especiação (Peixoto et al., 1992; Hilton & Hey, 1996; Wang & Hey, 1996; Gleason & Powell, 1997; Lachaise et al., 2000). Esse gene, um dos componentes do relógio circadiano de Drosophila, foi identificado com base em mutações que alteravam os ritmos de emergência de pupas e atividade locomotora de moscas adultas (Konopka & Benzer, 1971). Como o gene per também controla diferenças espécie-específicas nos ritmos de som de corte entre D. melanogaster e suas espécies irmãs (Kyriacou & Hall, 1980, 1982, 1986; Ritchie, Halsey & Gleason, 1999), foi considerado um exemplo de gene de especiação (Coyne, 1992).

A comunicação acústica também é um aspecto do comportamento sexual de Lu. longipalpis s.l. (Araki et al., 2009; Ward et al., 1988; Souza et al., 2002, 2004) e, por isso, genes potencialmente envolvidos no controle desse sinal são marcadores moleculares promissores para o estudo da diferenciação genética de populações desse complexo de espécies de insetos vetores. Assim, Peixoto e colaboradores (2001) isolaram e clonaram um fragmento de cerca de 900 pares de bases de Lu. longipalpis s.l., homólogo ao gene per de Drosophila. Esse foi o primeiro marcador molecular associado ao comportamento sexual empregado para estudos do processo de especiação desse complexo. No primeiro estudo feito por Bauzer e colaboradores (2002a), foram analisadas três populações brasileiras, separadas por distâncias superiores a

800 quilômetros (Lapinha, Jacobina e Natal) (ver Quadro 1). Para tal, a variação molecular em um fragmento de per de 266 pares de base, contendo um íntron de 54 pares de base, foi analisada e empregada no cálculo do índice de fixação Fst (Hudson, Slatkin & Maddison, 1992). Uma alta divergência genética entre as amostras dessas três localidades foi detectada. Juntamente com dados de feromônios (Ward et al., 1988; Hamilton, Dawson & Pickett; 1996a, 1996b) e de som de cópula (Souza et al., 2002) obtidos para essas mesmas populações, os resultados indicaram que elas provavelmente representam três espécies crípticas. Na verdade, dados isoenzimáticos já tinham sugerido a existência de tais grupos, embora a divergência observada não tenha sido considerada alta o suficiente para indicar a existência de um complexo de espécies (Mukhopadhyay et al., 1998).

Em um segundo estudo, Bauzer e colaboradores (2002b) empregaram o mesmo fragmento de per para analisar amostras de

Sobral, estado do Ceará (ver Quadro 1). Lu. longipalpis s.l. apresenta um polimorfismo de manchas abdominais (Mangabeira, 1969) e, em Sobral, os machos podem apresentar um único par de manchas esbranquiçadas no quarto tergito abdominal ou podem apresentar também um par adicional de manchas no terceiro tergito (Ward et al., 1983). Esses fenótipos de manchas abdominais são denominados uma pinta (1P) e duas pintas (2P), respectivamente, e já foram amplamente analisados em estudos que procuravam demonstrar se esse era ou não um caráter espécieespecífico. Por exemplo, cruzamentos em laboratório foram realizados entre colônias oriundas de populações brasileiras simpátricas e alopátricas com diferentes padrões de pintas abdominais (Ward et al., 1983, 1988; Souza et al., 2008). Taxas de inseminação muito reduzidas foram observadas em cruzamentos entre duas colônias representativas dos dois tipos morfológicos de Sobral, sugerindo que elas poderiam representar espécies simpátricas. Contudo, foram também obtidas baixas taxas de inseminação entre amostras de populações que compartilhavam o mesmo fenótipo e taxas normais entre algumas colônias que diferiam no fenótipo de pintas, indicando que o padrão de pintas não era um caráter espécie-específico. Além disso, nos cruzamentos entre as formas 1P e 2P observaram-se machos carregando um fenótipo intermediário, no qual a mancha do terceiro tergito é menor e de tamanho variável.

Esse fenótipo intermediário foi encontrado em alta frequência em algumas localidades, apontando um polimorfismo intraespecífico (Ward et al., 1988, 1985). Entretanto, embora as pintas não possam ser normalmente usadas como um caráter espécie-específico, os mesmos estudos já citados indicaram que tal fenótipo podia ser útil para identificar espécies simpátricas em localidades onde fenótipos intermediários eram raros – por exemplo, em Sobral –, onde machos com fenótipo 1P e 2P produzem diferentes tipos de feromônios (Ward et al., 1988). A análise do gene per realizada por Bauzer e colaboradores (2002b) indicou uma grande diferenciação genética entre as amostras de Sobral, confirmando os dados prévios de cruzamentos e feromônios.

Além disso, estimativas de diferenciação genética par a par entre essa população e as de Jacobina, Lapinha e Natal revelaram que Sobral fenótipo 2P e Natal eram essencialmente o mesmo pool genético, e que Sobral fenótipo 1P era distinta de todas as outras analisadas até aquele momento, sendo um pouco mais próxima à de Lapinha, com a qual compartilhava o mesmo tipo de feromônio. Dois anos mais tarde, publicou-se um estudo com a caracterização do som de cópula dos machos fenótipo 1P e fenótipo 2P de Sobral (Souza et al., 2004), tendo os resultados concordado com o padrão de estruturação indicado pelos dados de per e feromônios.

Araki e colaboradores (2009) estenderam a análise desse fragmento do gene per para amostras de mais sete localidades brasileiras: Marajó, Teresina, Pancas, Mesquita, Barra de Guaratiba,

Estrela de Alagoas e Jaíba (ver Quadro 1); nestas duas últimas foram coletados machos com uma e duas pintas, sendo o fenótipo intermediário raro, tal qual observado em Sobral. Portanto, as amostras com fenótipo 1P e 2P de Estrela de Alagoas e Jaíba foram analisadas separadamente. Os valores dos índices de fixação Fst (Hudson, Slatkin & Maddison, 1992) computados indicaram uma diferenciação genética alta e significativa entre os machos 1P e 2P que ocorrem em Jaíba e Estrela de Alagoas (Araki et al., 2009). Genealogias foram construídas com as amostras de cada uma dessas localidades, revelando dois clados distintos que separavam a maioria das sequências das amostras de fenótipo 1P das de fenótipo 2P. Algumas poucas sequências de um fenótipo se misturavam ao segundo fenótipo e vice-versa, fornecendo possível evidência de retenção de polimorfismo ancestral ou introgressão entre as duas formas simpátricas.

Uma análise global com a inclusão das populações analisadas por Bauzer e colaboradores (2002a, 2002b) revelou que os machos com fenótipo 2P em Jaíba, Estrela de Alagoas e Sobral, assim como as amostras de Natal, Pancas e Marajó, são muito próximos geneticamente, com todos os valores de Fst computados par a par baixos ou não significativos. Os resultados indicaram ainda que as populações de Lapinha, Sobral 1P, Teresina e Jaíba 1P apresentam uma diferenciação genética entre elas que varia de baixa a moderada. Finalmente, as populações de Jacobina e Estrela 1P não só mostraram grande diferenciação genética entre elas próprias como também com todas as outras populações analisadas até aquele momento com o gene per (Araki et al., 2009; Bauzer et al., 2002a, 2002b).

Araki e colaboradores (2009) também compararam os resultados obtidos com o gene per com dados novos e previamente publicados acerca dos diferentes tipos de som de cópula e feromônios sexuais produzidos pelos machos (Araki et al., 2009; Souza et al., 2002, 2004; Hamilton, Dawson & Pickett, 1996a, 1996b; Hamilton, Brazil & Maingon, 2004; Hamilton et al., 2005). Essa análise integrativa revelou que as populações analisadas poderiam ser divididas em dois grandes grupos. O primeiro deles, que inclui as populações de Marajó, Sobral 2P, Natal, Estrela 2S, Jaíba 2P e Pancas, representaria uma das espécies do complexo que está distribuída principalmente ao longo da costa norte e nordeste do Brasil, atingindo o sudeste em regiões mais afastadas da costa. Além da proximidade genética revelada pelo gene per, essas populações compartilham o mesmo tipo de som de cópula (burst) e de feromônio (cembreno-1). As demais populações apresentam diferentes níveis de divergência genética e produzem diferentes tipos de feromônios e subtipos do som de cópula ‘pulsado’ (com padrão bem distinto do som tipo burst). Tais populações, portanto, são muito mais heterogêneas e representam provavelmente cinco espécies incipientes (Araki et al., 2009).

Finalmente, per foi recentemente empregado como marcador molecular por Vigoder e colaboradores (2010) em um estudo que integrou padrões de polimorfismo genético com diferenciação fenotípica de som de cópula em Lutzomyia cruzi (Mangabeira, 1938), uma espécie muito próxima a Lu. longipalpis s.l., também associada com a transmissão da leishmaniose visceral americana (Santos et al., 1998; Pita-Pereira et al., 2008). A análise do som de cópula revelou que machos de Lu. cruzi produzem som do tipo burst, similar àquele previamente caracterizado em seis populações de Lu. longipalpis s.l. (Natal, Marajó, Sobral 2P, Jaíba 2P, Estrela 2P e Pancas) (Araki et al., 2009; Souza et al., 2004). Contudo, Lu. cruzi produz o feromônio 9-metil-germacreno-B (Brazil & Hamilton, 2002), diferente do feromônio cembreno-1 encontrado nestas populações com som do tipo burst. A análise da diferenciação genética no gene per revelou uma divergência maior entre algumas populações de Lu. longipalpis s.l. que a observada entre algumas destas e Lu. cruzi, indicando que esta última é na verdade um membro do complexo Lu. longipalpis, confirmando resultados prévios obtidos em um estudo com microssatélites (Watts et al., 2005), a ser descrito na próxima sessão.

Diversos outros genes também envolvidos no controle do som de corte em D. melanogaster já foram identificados (Peixoto & Hall, 1998; Gleason, 2005). Dentre eles destacam-se cacophony (cac) e paralytic (para), que codificam canais iônicos dependentes de voltagem. O gene cac codifica um canal de cálcio (Smith et al., 1998) e já foi empregado como marcador molecular em estudo de diferenciação entre linhagens derivadas de uma população natural de D. melanogaster (Peixoto, Costa & Hall, 2000). Já o gene para codifica um canal de sódio (Loughney, Kreber & Ganetzky, 1989; Littleton & Ganetzky, 2000) e seus homólogos em outros insetos são sítios de mutações associadas com resistência a inseticidas (Loughney, Kreber & Ganetzky, 1989; Milani, 1956; Pittendrigh et al., 1997). Ambos os genes foram empregados como marcadores moleculares em estudos de diferenciação entre populações de Lu. longipalpis s.l. no Brasil. Bottecchia e colaboradores (2004) sequenciaram um pequeno íntron (~100 pb) do gene cac de indivíduos das populações alopátricas de Lapinha, Jacobina e Natal

e das populações simpátricas de Sobral (ver Quadro 1).

Esse íntron mostrou-se altamente polimórfico, incluindo eventos de inserção e deleção (indels). Observou-se uma grande diferenciação entre as amostras, num padrão similar ao observado anteriormente com o gene per (Bauzer et al., 2002a, 2002b). Comparação feita com o teste de Mantel apresentou significante correlação (r = 0,85) entre as estimativas de Fst baseadas nos dois loci entre as cinco populações analisadas em comum. Entretanto, o fluxo genético estimado entre as espécies crípticas de Sobral com o gene cac foi sete vezes maior do que aquele estimado com o gene per, indicando que o primeiro marcador é mais sujeito a introgressão do que o segundo. Já o outro marcador, para, foi utilizado por Lins, Souza e Peixoto (2008) para estudar a divergência entre as duas espécies simpátricas de Sobral. Os resultados indicaram este como o primeiro marcador a apresentar diferenças fixas entre as duas espécies. Comparados aos outros dois marcadores associados ao som, empregados no estudo de diferenciação genética desses insetos vetores (Bauzer et al., 2002a, 2002b; Bottecchia et al., 2004), para foi o que apresentou o menor nível de polimorfismo em Sobral. No entanto, o valor de Fst foi o mais alto até o momento, indicando o maior grau de diferenciação genética dentre esses três marcadores. A presença de diferenças fixas em para sinaliza que esse gene pode ser futuramente utilizado como um locus diagnóstico para identificar as fêmeas das duas espécies crípticas em Sobral, em estudos que se destinem a determinar possíveis diferenças na capacidade vetorial entre elas.

 

Microssatélites

Maingon e colaboradores (2003) utilizaram microssatélites, previamente isolados de Lu. longipalpis s.l. (Watts et al., 2001), para estudar a diferenciação das duas espécies simpátricas do complexo que ocorre na localidade brasileira de Sobral. Como mencionado antes, os machos dessa localidade produzem diferentes tipos de feromônios. Aqueles de fenótipo 1P produzem o feromônio 9-metil-germacreno-B e aqueles de fenótipo 2P produzem o feromônio do tipo cembreno-1 (Ward et al., 1988). Utilizando cinco loci de microssatélites, os autores genotiparam 190 indivíduos das duas espécies simpátricas do complexo Lu. longipalpis. Dois índices de fixação foram utilizados, R (Slatkin et al., 1995) e θ (Weir & ST ST Cockerham, 1984). Frequências alélicas altamente divergentes em dois dos cinco loci de microssatélites determinaram uma diferenciação genética significante para as comparações entre amostras com diferentes feromônios, independentemente do índice utilizado. O fato de que somente dois dos cinco loci de microssatélites analisados nas populações simpátricas de Sobral apontaram intensa diferenciação sugere que introgressão envolvendo os outros três loci pode ter ocorrido. Tais resultados se assemelharam aos obtidos com o complexo Anopheles gambiae, que indicaram taxas diferenciais de introgressão pelo genoma (Besansky et al., 2003; Stump et al., 2005) e concordam com as evidências de introgressão reveladas pelos genes nucleares envolvidos no comportamento (Bauzer et al., 2002b; Bottecchia et al., 2004).

Os resultados obtidos por Maingon e colaboradores (2003), portanto, confirmaram a existência de duas espécies crípticas naquela localidade. Além disso, a diferenciação genética observada nesses loci de microssatélites pôde ser usada na genotipagem não só de machos como também das fêmeas, que são morfologicamente idênticas, permitindo a identificação da espécie que produz 9-metil-germacreno-B com um grau de confiança de 100%, e para a espécie que produz cembreno-1, um grau de confiança de 86%. Os autores comentam que, com mais marcadores de microssatélites e uma amostra maior, tal genotipagem poderia ser explorada em outras populações ou espécies de Lu. longipalpis s. l.. Isso forneceria uma base para uma identificação molecular de fêmeas, o que facilitaria a abordagem de questões sobre possíveis consequências epidemiológicas associadas à subestruturação de Lu. longipalpis.

Um outro estudo que empregou microssatélites como marcadores moleculares foi conduzido por Watts e colaboradores (Watts et al., 2005), em que se investigou o padrão filogeográfico e possíveis relações com diferentes tipos de feromônios produzidos em 11

populações do Brasil e da Venezuela (ver Quadro 1). Além das amostras de Lu. longipalpis, foram incluídas amostras de Lu. pseudolongipalpis e Lu. cruzi. Dados genotípicos individuais foram obtidos de 493 indivíduos, gerando 89 alelos entre todos os cinco loci de microssatélites empregados. Diferenciação genética entre as amostras, investigada mediante o índice de fixação θ (Weir & ST Cockerham, 1984), foi acentuada para a maior parte das comparações par a par. Houve uma fraca relação entre a diferenciação genética e a distância geográfica, e somente quando as amostras que produzem o mesmo tipo de feromônio foram analisadas individualmente é que a separação geográfica passou a explicar uma porcentagem maior de diferença genética entre as populações.

A diferenciação genética entre as duas amostras de Sobral que produzem feromônios distintos foi maior do que muitas comparações entre amostras separadas por distâncias consideráveis. Uma árvore neighbor-joining, construída com base na análise de θ , separou as amostras em cinco clados. Dois destes ST

foram representados pelas espécies Lutzomyia cruzi (Brasil) e Lu. pseudolongipalpis (Venezuela), isoladamente. Um terceiro clado foi constituído por populações venezuelanas (Altagracia, Guayabita, El Layero, Las Cabreras), caracterizadas majoritariamente pela produção do feromônio 9-metil-germacreno-B. Um quarto clado agrupou as populações brasileiras de Jacobina, Lapinha e Sobral 1P, onde a primeira é a única caracterizada pelo feromônio 3-metil-α-himacaleno, enquanto as outras duas compartilham o feromônio 9-metil-germacreno-B. Finalmente, um quinto e bem distinto grupo foi composto de populações brasileiras que produzem feromônio do tipo cembreno-1 (Natal, Marajó e Sobral 2P).

Os autores concluíram que não somente há uma diferenciação genética entre as populações brasileiras, mas também que os tipos de feromônio moldam a estruturação genética dessas populações. Mencionaram ainda que os dados concordam com diferenças previamente descritas em som de cópula de machos, um outro fenótipo com potencial envolvimento na seleção sexual de Lu. longipalpis s.l. (Souza et al., 2002, 2004).

 

Comentários finais

Os marcadores moleculares utilizados nos estudos evolutivos do complexo Lu. longipalpis apontaram, de forma geral, um grau elevado de diferenciação genética entre as espécies crípticas. É provável que também existam diferenças em aspectos da capacidade vetorial. Nesse sentido, estudos de genética de populações utilizando marcadores moleculares envolvidos com os aspectos da biologia desses vetores que influenciam a transmissão da L. infantum são particularmente importantes. Um exemplo desse tipo de estudo, já realizado em Lu. longipalpis s.l., são os trabalhos envolvendo o peptídio maxadilan, um potente vasodilatador encontrado na saliva desses insetos (Lanzaro & Warburg, 1995; Warburg et al., 1994; Lanzaro et al., 1999; Yin, Norris & Lanzaro, 2000). Outros estudos evolutivos envolvendo genes que controlam a competência vetorial, escolha de hospedeiro (por exemplo, receptores olfativos) e a adaptação a ambientes modificados pelo homem são particularmente promissores.

Outra abordagem promissora será a utilização da genômica de populações e de análises multilócus no complexo Lu. longipalpis (Black et al., 2001; Luikart et al., 2003; Stinchocombe & Hoekstra, 2007; Mazzoni et al., 2008; Thomson, Wang & Johnson, 2010). A análise simultânea de um grande número de loci torna possível a separação de efeitos locus específicos (por exemplo, seleção natural) dos efeitos pangenômicos (por exemplo, deriva genética). O ponto crucial dessa separação é que os efeitos genômicos fornecem informações mais confiáveis acerca de eventos históricos e demográficos como, por exemplo, vicariância e gargalos populacionais. Já os efeitos locus específicos ajudam a identificar sinais de seleção natural em genes envolvidos com os mais variados processos de adaptabilidade, podendo incluir aqueles envolvidos na capacidade vetorial.

 

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