Parte V – Modelos Experimentais no Estudo das Leishmanioses do Continente Americano

Parte V - Modelos

experimentais no estudo das

Leishmanioses do Continente

Americano

 

16. Modelos experimentais na

Leishmaniose Visceral

Renato Porrozzi, Amanda dos Santos Cavalcanti, Elisa Cupolillo

Aleishmaniose visceral (LV) é uma doença que acomete o homem e outros animais e está associada à infecção por Leishmania (Leishmania) donovani ou Leishmania (Leishmania) infantum (sin. L. chagasi), que é normalmente fatal se não tratada. Embora a sinonímia de L. chagasi em relação a L. infantum já seja bastante aceita, neste capítulo utilizaremos os dois nomes, mantendo a nomenclatura utilizada na fonte bibliográfica. Essas espécies de Leishmania acometem os tecidos componentes do sistema fagocítico mononuclear (SFM), principalmente baço, fígado e medula óssea. Clinicamente a leishmaniose visceral humana (LVH), também chamada de calazar, caracteriza-se por abdômen protuso, principalmente associado à hepatoesplenomegalia, febre prolongada, perda de peso, anemia progressiva, leucopenia e hipergamaglobulinemia. Até o momento não existe vacina disponível contra LV, sendo as drogas mais comumente utilizadas no tratamento os antimoniais pentavalentes (Glucantime®, Pentostam®), a anfotericina B, a pentamidina e a miltefosina. Entretanto, tais drogas estão associadas ao desenvolvimento de resistência e toxicidade (Croft & Engel, 2006). Mais recentemente, a coinfecção Leishmania-vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) tornou-se um importante fator em que pacientes soropositivos são mais suscetíveis ao parasito (Del-Giudice et al., 2002).

Infecções experimentais em voluntários humanos, com cepas do parasito que causam leishmaniose visceral utilizando amastigotas obtidas de tecido animal ou promastigotas de cultura, não foram bem-sucedidas. A primeira tentativa eficaz de infecção experimental em seres humanos ocorreu em pacientes com doenças incuráveis inoculados com altas doses infectantes de L. donovani via intramuscular, na qual foi possível isolar parasitos do sangue seis meses após a infecção. Entretanto, os pacientes nunca apresentaram nenhum sinal típico de calazar, provavelmente em razão de particularidades na suscetibilidade dos seres humanos envolvidos, como doenças concomitantes, malnutrição etc. (Melby, 1991). A infecção experimental de seres humanos pode contribuir significativamente para o avanço dos conhecimentos sobre a imunopatogênese da infecção por Leishmania, porém, aspectos éticos limitam esse tipo de estudo.

 

Modelos de animais experimentais

para a Leishmaniose Visceral

Grande parte dos conhecimentos sobre a imunopatologia do hospedeiro durante a LV vem de estudos realizados em modelos experimentais utilizando animais, principalmente pela necessidade de procedimentos invasivos para a obtenção de tecidos infectados. A maioria dos conhecimentos foi gerada tendo por base quatro modelos animais. De acordo com dados pesquisados na base de dados PubMed, quando da elaboração deste capítulo, nos últimos dez anos os camundongos foram os animais mais utilizados, tendo sido citados em 60,56% dos artigos publicados, seguidos por hamsters (25,23%), cães (20,18%) e primatas não humanos (3,3%). Outras espécies animais, como asininos (Cerqueira et al., 2003) e suínos (Moraes-Silva et al., 2006), já foram utilizadas em infecções experimentais por Leishmania spp., mas não foram capazes de reproduzir a infecção, sendo descartado seu uso como modelo experimental.

Diversos fatores influenciam na suscetibilidade das diferentes espécies animais às leishmânias viscerotrópicas, entre os quais estão via e quantidade do inóculo, cepas do parasito e fatores genéticos do hospedeiro.

 

Hamster

O hamster dourado da Síria (Mesocricetus auratus) é altamente suscetível às leishmânias viscerotrópicas, representando um dos modelos mais antigos de estudo da leishmaniose visceral. A infecção, em geral, leva à doença e morte do animal (Melby et al., 2001), sendo útil para a caracterização de moléculas e de mecanismos envolvidos na patogênese. Esses animais, quando infectados com L. donovani, apresentam patologia semelhante à observada em humanos, quase mimetizando o calazar (Duarte & Corbett, 1984; Sartori et al., 1992). Além disso, a infecção reproduz dois eventos da LVH: a supressão da resposta Th1 específica na fase ativa da infecção (Bunn-Moreno et al., 1985; Nickol & Bonventre, 1985a) e a ativação policlonal dos linfócitos B (Bunn-Moreno et al., 1985; Campos-Neto & Bunn-Moreno, 1982). No fígado dos hamsters há hiperplasia e parasitismo de células de Kupffer, assim como granulomas com macrófagos parasitados nos espaços portais (Duarte & Corbett, 1984). No entanto, poucas linhagens isogênicas de hamster podem ser obtidas comercialmente, limitando as manipulações experimentais. Outro fator limitante é a disponibilidade comercial reduzida de reagentes imunológicos, o que restringe os estudos dessa natureza.

Considerando a alta parasitemia apresentada por hamsters experimentalmente infectados, eles podem ser utilizados para o repasto sanguíneo de flebótomos em testes de eficiência vetorial (Montoya-Lerma et al., 2003). Usualmente, esse modelo é também utilizado para a manutenção de cepas de Leishmania spp. ou para passagens seriadas visando à manutenção da virulência dos parasitos (Shukina & Gorbunova, 1987).

Hamsters infectados com leishmânias viscerotrópicas desenvolvem uma doença progressiva, com hepatoesplenomegalia, hipoalbuminemia, hipergamaglobulinemia, pancitopenia (Goto & Lindoso, 2004), diminuição da proliferação linfocitária e glomerulonefrite, bem como alterações morfológicas nos hepatócitos (Vianna, Takiya & Brito-Gitirana, 2002), embora já tenha sido relatado pleomorfismo clínico (Requena et al., 2000).

Infecções experimentais em hamsters demonstram ausência de resposta linfoproliferativa diante da indução com antígenos de Leishmania (Rodrigues, Silva & Campos-Neto, 1992). De acordo com Goto e Lindoso (2004), o melhor modelo para estudar a supressão da células T aos antígenos de Leishmania é o hamster infectado com L. donovani ou L. chagasi que desenvolve a doença progressiva. O estudo dos mecanismos imunossupressores indica causas multifatoriais como, por exemplo, a apoptose seletiva de populações de linfócitos na fase inicial da infecção ou a produção de citocinas supressoras pelas células apresentadoras de antígeno (Goto, 2004).

Os estudos indicam que tanto formas promastigotas como amastigotas causam infecção progressiva, entretanto o desenvolvimento da sintomatologia clínica ocorre mais precocemente com o uso de formas amastigotas (Riça-Capela et al., 2003). As vias de inoculação mais comumente utilizadas são a intraperitoneal (IP) e a intracardíaca (IC), com a infecção ocorrendo mais rapidamente na segunda. Wyllie e Fairlamb (2006) realizaram estudo sobre o refinamento do uso desse modelo para a infecção experimental por L. donovani. Constataram, com isso, que a via IP é tão eficiente em promover a infecção quanto a IC, uma vez que a via IC requer habilidade do pesquisador e é extremamente perigosa para o animal, podendo causar parada cardíaca, tamponamento cardíaco e hemorragia.

A ascite é um achado comum em ambas as vias de inoculação (Riça-Capela et al., 2003; Wyllie & Fairlamb, 2006), podendo afetar 50% dos animais 24 semanas após a infecção. Interessantemente, fêmeas lactantes não devem ser utilizadas, pois embora haja soroconversão, são resistentes à infecção, não apresentando carga parasitária nem sintomatologia clínica (Gomez-Ochoa et al., 2003). Doses maiores ou iguais a 10 5 promastigotas/animal reduzem o tempo de aparecimento dos sintomas, quando comparadas às doses de 104 3 ou 10 promastigotas (Requena et al., 2000), indicando que a dose infectante influencia no período pré-patente.

Não há uma maneira clara para monitorar a progressão da LV em hamsters até fases avançadas da infecção, quando o sinal mais notável é a significativa perda de peso. Em geral é utilizada como ponto de corte a perda de peso corporal maior que 25% (Requena et al., 2000), e a maioria dos trabalhos considera apenas o tempo da infecção. Contudo, já se demonstrou que a carga parasitária tissular de animais com perda de 10% do peso inicial não difere daquela de animais com 25% de perda. Dessa forma, recomenda-se que a perda de 10% do peso inicial do animal seja considerada como ponto final do experimento, o que evita não apenas a morte do animal, permitindo seu uso para futuras pesquisas de desenvolvimento de drogas, como também seu sofrimento exacerbado (Wyllie & Fairlamb, 2006).

Os hamsters são comumente utilizados na fase primária do desenvolvimento de vacinas e no desenvolvimento de drogas (Garg & Dube, 2006). Como são altamente suscetíveis, nesse tipo de pesquisa altas doses de drogas podem ser requeridas. Uma vez que as características clínico-patológicas e os mecanismos imunopatológicos da LV no hamster são similares àqueles apresentados na doença humana, esses animais são um bom modelo para se estudar a forma progressiva da doença humana. No entanto, deve ser considerado que ainda não são um modelo ideal, pois muitos animais desenvolvem ascite, falha renal e síndrome nefrótica, o que é raramente observado nas doenças humana e canina (Wilson, Jeronimo & Pearson, 2005).

 

Camundongo

A evolução da infecção experimental com espécies viscetrópicas de Leishmania tem sido estudada em diferentes cepas de camundongos, estando grande parte dos conhecimentos relacionada aos estudos realizados com L. donovani. Diferentes cepas de animais, como camundongos isogênicos (geneticamente idênticos), animais com genes nocauteados ou transgênicos e o grande repertório de reagentes imunológicos permitiram um significativo salto no conhecimento da imunopatogênese da LV. Um dos aspectos mais marcantes da infecção experimental em modelos murinos é a distinta capacidade de crescimento do parasito em diferentes órgãos.

Nesses modelos geralmente é feito o uso de altas doses (107 ou mais) intravenosas (IV) ou intraperitoneais (IP) de amastigotas ou promastigotas (Leclercq et al., 1996; Rolão, Melo & Campino, 2004; Wilson & Weinstock, 1996). Um estudo sobre a influência da via de inoculação mostrou que tanto a via IV quanto a IP são capazes de produzir infecções progressivas em camundongos BALB/c infectados com L. infantum. Entretanto, apesar de ocorrer maior dispersão de parasitos nos tecidos pela via IV, a via IP resulta em maior homogeneidade da infecção (Rolão, Melo & Campino, 2004). Além disso, há dificuldade técnica de inoculação IV em animais de pequeno porte e, assim, parte dos parasitos pode ser perdida. O uso de doses de 107 promastigotas pela via intradérmica (ID), a que melhor mimetiza a infecção natural, parece promissor e a resposta observada assemelha-se àquela obtida com baixas doses (104) pela via intravenosa. A inoculação ID de promastigotas de L. infantum em camundongos BALB/c estabelece infecção crônica que se assemelha àquela observada nas infecções subclínicas da LV humana e canina. Contudo, utilizando a via ID, a doença e a resposta imune subsequentes aparecem mais tardiamente quando em comparação com a observada na IV com altas doses de parasitos (Ahmed et al., 2003). Fatores como a dose e a via do inóculo podem influenciar a progressão da doença, bem como a intensidade da resposta imunológica, devendo por isso serem levados em consideração no desenho experimental, principalmente em testes de vacinas.

Fatores genéticos influenciam a resistência ou a suscetibilidade à infecção de camundongos por espécies viscerotrópicas. Dessa forma, o sucesso da infecção experimental depende da linhagem do camundongo (Pereira & Alves, 2008). Estudos mostraram que algumas linhagens de camundongos são resistentes à infecção por L. donovani como o C3H e o C57BL/6, enquanto outras como B10.D2, C57BL/10 e BALB/c são suscetíveis (Wilson & Streit, 1996; Blackwell & Plant, 1986; Nickol & Bonventre, 1985b). Nos camundongos BALB/c, é interessante observar que inicialmente eles se mostram suscetíveis à infecção por L. donovani apresentando carga parasitária variável e geralmente elevada no fígado e baço (Wilson & Streit, 1996; Murray, 1982; Melby et al., 2001). Após algumas semanas, eles podem controlar a carga parasitária nesses órgãos mantendo uma infecção crônica (Blackwell et al., 1985; Murray, Masur & Keithly, 1982).

O crescimento do parasito no interior de macrófagos tissulares é determinado pela bomba próton-cátion fagolisosssomal codificada pelo gene SLc11a1 (anteriormente denominado Nramp ou Lsh/Bcg/Ity) (Leclercq et al., 1996; Blackwell et al., 2001). Cepas de camundongos resistentes, como CBA, possuem o gene SLc11a1 funcional e são capazes de controlar o crescimento parasitário independentemente de mecanismos imunológicos (Blackwell & Plant, 1986; Crocker, Blackwell & Bradley, 1984). Cepas geneticamente suscetíveis, C57BL/6 e BALB/c, contêm uma mutação nesse gene com uma glicina no lugar de uma asparagina na posição 169. Tal mutação resulta na perda da funcionalidade, o que permite o crescimento parasitário e, consequentemente, há um aumento de cinquenta a cem vezes na carga parasitária hepática (Vidal et al., 1995). Todavia, mesmo os camundongos mutantes são capazes de conter a infecção após algumas semanas. Esse mecanismo é mediado por haplótipos do complexo principal de histocompatibilidade (Leclercq et al., 1996; Blackwell, 1983), indicando o papel crucial da resposta imune adquirida na fase tardia da infecção (Lipoldova & Demant, 2006).

A despeito da espécie de Leishmania utilizada (L. donovani, L. infantum ou L. chagasi), ocorre no fígado uma infecção aguda e autorresolutiva, em que os parasitos se multiplicam rapidamente durante as primeiras quatro semanas e a infecção se resolve ao fim de oito semanas (Wilson & Weinstock, 1996; Wilson et al., 1996). Embora não ocorra a eliminação total dos parasitos do fígado dos camundongos, este órgão apresenta leve dano tecidual e os animais apresentam resistência a infecções subsequentes. Possivelmente, a persistência parasitária deve mediar a imunidade duradoura observada. A resolução da infecção é mais rápida nos modelos empregando-se amastigotas de L. donovani, mas o mesmo padrão de resposta tecido específica é observado nas infecções por L. infantum (Squires et al., 1989; Squires et al., 1990; Stanley & Engwerda, 2007). Tanto células CD4+ como CD8+ são ativadas após infecção, gerando uma resposta mista Th1/Th2 (Kaye, Curry & Blackwell, 1991; Miralles et al., 1994).

A resolução da infecção no fígado requer um controle fino envolvendo o desenvolvimento de um infiltrado de células inflamatórias ao redor de macrófagos infectados conhecidos como granulomas, que têm sido extensivamente estudados (Stanley & Engwerda, 2007; McElrath, Murray & Cohn, 1988; Murray, 2001). Após a infecção de camundongos suscetíveis, com amastigotas de L. donovani ou L. infantum, o destino dos parasitos no fígado é a fagocitose por células de Kupffer, onde se alojam no interior de vacúolos parasitóforos e se replicam. A infecção das células de Kupffer serve como um nicho de replicação parasitária e ponto inicial para a formação do granuloma, que aos poucos se torna envolto por células imigrantes. Frequentemente é observada a fusão das células de Kupffer infectadas, formando células multinucleadas (Murray, 2001).

Todo o processo de formação do granuloma requer a produção de quimiocinas (Cotterell, Engwerda & Kaye, 1999) para o recrutamento de monócitos, neutrófilos, linfócitos CD4+ e CD8+, bem como a produção de citocinas inflamatórias, necessárias para a ativação das células infectadas e consequente controle do crescimento parasitário (Cervia, Rosen & Murray, 1993; Smelt et al., 2000). Dessa forma, a redução da carga parasitária está diretamente associada à produção de citocinas pró-inflamatórias (Th1), dentre as quais destacam-se IL-2, IL-12, INFγ, TNF (Squires et al., 1989; Engwerda et al., 2004; Ghalib et al., 1995; Murray et al., 1993; Murray, 1997). Citocinas Th2 também são essenciais na resolução da infecção hepática, atuando na indução de células CD8+, importantes na memória imunológica e proteção duradoura (Stager et al., 2003).

Por sua vez, citocinas com papel regulador como TGFβ, IL-10 e IL-27 também são produzidas nos granulomas em formação e desempenham papel crítico para o balanço da imunidade protetora e para a prevenção da imunopatologia associada (Murphy et al., 2001; Wilson et al., 1998; Rosas et al., 2006). Células T matadoras naturais (NKT Cells – Natural Killer T cells), com um receptor de células T invariável e restrito por CD1d (iNKT), são um subgrupo de células T com grande potencial imunorregulador, que por meio da produção de citocinas do tipo Th1 ou Th2, influenciam tanto a resposta imune inata como a adquirida. O número e o tamanho dos granulomas aumentam rapidamente nas primeiras quatro semanas de infecção. Após esse período, o número de células infectadas diminui e apenas poucas células de Kupffer ou monócitos parasitados podem ser observados.

O baço é um local de persistência parasitária onde os parasitos crescem lentamente, gerando alterações importantes tanto na arquitetura quanto na função do órgão. Interessantemente, no baço tanto citocinas do perfil Th1 quanto Th2 são produzidas durante a infecção de camundongos BALB/c com L. donovani (Melby et al., 2001). Grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias, especialmente o INFγ, são produzidas. O INFγ ativa os macrófagos e estes produzem a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS), que catalisa a produção de óxido nítrico, um dos principais mecanismos microbicidas dos macrófagos. Entretanto, os parasitos ainda conseguem sobreviver nesse local (Mauel, Ransijn & Buchmuller-Rouiller, 1991). O baço é um importante órgão linfoide que consiste da polpa vermelha e da polpa branca, as quais se encontram separadas por uma zona marginal. Na polpa branca, folículos de células B e áreas de células T estão dispostos ao redor de uma arteríola central. Dessa forma, o tecido esplênico mantém um íntimo contato com a circulação sanguínea, o que é extremamente importante para indução da imunidade. Nos momentos iniciais após a infecção com L. donovani, os parasitos infectam os macrófagos da zona marginal, sendo encontrados após uma semana nos macrófagos da polpa vermelha. Mais tardiamente, durante a infecção, a morfologia do órgão é alterada com perda de macrófagos da zona marginal, progressiva destruição das células dendríticas e perda dos centros germinativos (Gorak, Engwerda & Kaye, 1998), o que pode estar diretamente associado à produção desregulada de anticorpos durante a leishmaniose visceral.

Embora a maioria dos eventos imunopatológicos observados durante a infecção com L. donovani seja similar àqueles observados na infecção com L. infantum, diferenças devem existir devido principalmente à expressão diferencial de moléculas relacionadas com a virulência dos parasitos. De fato, alguns autores têm relatado diferenças na suscetibilidade de isolados de L. infantum do mesmo zimodema (Baptista-Fernandes et al., 2007) ou mesmo em clones de um mesmo isolado (Garin et al., 2001).

 

Canino

O cão é um excelente modelo de estudo para o entendimento da LV, uma vez que reproduz vários aspectos da doença humana. O maior problema na utilização de cães como modelos experimentais é a falta de marcadores imunológicos e de reagentes específicos importantes para determinar a base da resposta imunológica protetora desses animais (Moreno & Alvar, 2002).

O interesse em estudar o modelo experimental canino também está relacionado ao papel que esses animais desempenham no ciclo zoonótico da LV. O melhor entendimento dos mecanismos imunopatológicos durante a leishmaniose visceral canina (LVC) pode direcionar o desenvolvimento de vacinas e de medidas de controle, com implicações econômicas no sistema de saúde e na indústria farmacêutica (Goto & Lindoso, 2004). Outro fator que reforça o valor dos estudos com cães como modelo experimental é a apresentação clínica da infecção. A infecção canina pode ser assintomática, na qual há evidências sorológicas, porém nenhuma manifestação clínica; pode evoluir para uma doença branda, forma oligossintomática; ou ainda, evoluir para uma doença grave, polissintomática, na qual é observada severidade nos sinais clínicos (Baneth & Jaffe, 1999).

Os sinais clínicos da LVC como hepatoesplenomegalia, pancitopenia, hipertermia e hipergamaglobulinemia são semelhantes àqueles observados na doença humana, embora na LVH não sejam observadas com frequência lesões de pele como dermatite e úlceras cutâneas. Predominantemente, os cães assintomáticos apresentam baixo parasitismo tissular, enquanto os sintomáticos, alto parasitismo (Alves et al., 2009; Boggiatto et al., 2010; Manna et al., 2009). Os cães infectados apresentam hipergamaglobulinemia moderada a alta que aumenta com a progressão da doença, sendo observados títulos baixos nas formas oligo e assintomática (Baneth & Jaffe, 1999), embora não seja possível relacionar os isotipos de IgG com o perfil clínico (Boggiatto et al., 2010). É também observada uma forte correlação entre o aparecimento da clínica e a perda da resposta proliferativa antígeno específica (Santos et al., 2008). A apresentação clínica da leishmaniose é consequência da interação entre o parasito e a resposta imunológica do hospedeiro (Chamizo, Moreno & Alvar, 2005), e o resultado da infecção depende principalmente da imunocompetência do animal que, em última análise, leva o macrófago a destruir o parasito (Chamizo, Moreno & Alvar, 2005; Ferrer, 1999; Santos-Gomes et al., 2003).

Dessa forma, a sobrevida do parasito e a evolução da infecção sofrem influência de fatores genéticos do hospedeiro. Diversos genes relacionados à suscetibilidade e resistência dos hospedeiros infectados por Leishmania já foram identificados em murinos, humanos e canídeos (Sakthianandeswaren, Foote & Handman, 2009). Polimorfismos em certas regiões do gene Slc11a1 estão associados ao aumento do risco para LVC (Sanchez-Robert et al., 2008). Cães da raça Ibizan Hound já foram identificados como resistentes à LVC em razão da forte resposta celular (Solano-Gallego et al., 2000). Além disso, no estudo de Sanchez-Robert e colaboradores (2008) foram determinados seis haplótipos do gene Slc11a1 específicos dessa raça.

Uma vez que os animais desenvolvem alterações clínicas, patológicas e imunológicas semelhantes, os cães com LVC podem ser um bom modelo para entender a patogênese da doença humana e canina (Alves et al., 2010), e ainda para estudos que visem ao desenvolvimento de vacinas para LVC.

Infecções experimentais em cães têm sido conduzidas desde o início do século XX, quando o papel dos cães como reservatório foi confirmado. Um dos principais problemas na infecção experimental canina é a natureza imprevisível da resposta, o que limita a obtenção de uma resposta homogênea e reprodutível, necessária para obtermos conclusões definitivas acerca da experimentação. Em vista disso, torna-se relevante estabelecer os parâmetros para induzir um estágio particular da resposta imune ou da doença. Desse modo, podemos obter um longo período pré-patente, uma resposta celular específica, uma resposta humoral exacerbada ou um rápido aparecimento dos sinais clínicos, adequando o modelo à proposta do estudo (Moreno & Alvar, 2002).

Existem diferentes metodologias para a infecção experimental em relação a vias de inoculação, forma e dose infectantes. Em termos práticos, embora a via IV seja mais artificial, em relação ao que ocorre naturalmente, parece ser a melhor rota para induzir a doença sintomática, pois permite a rápida dispersão sistêmica dos parasitos vivos (Martínez-Moreno et al., 1995; Poot et al., 2005; Rodriguez-Cortes et al., 2007a; Maia et al., 2010; ), sendo que cães infectados por essa via têm maior potencial de transmissão para flebótomos (Travi et al., 2009).

A infecção pela via ID tem evolução mais lenta e período pré-patente longo (Paranhos-Silva et al., 2003; Pinelli et al., 1994), sendo mais próxima da infecção natural. Além disso, é predominantemente assintomática, mesmo com a inoculação de altas doses de parasitos (Santos-Gomes, Campino & Abranches, 2000; Paranhos-Silva et al., 2003; Chamizo, Moreno & Alvar, 2005; Silvestre et al., 2008). É importante ressaltar que na inoculação por essa via não há a formação do leishmanioma e não são mais detectados parasitos no local 24 horas após a inoculação (Santos-Gomes, Campino & Abranches, 2000).

No que se refere à forma infectante, alguns autores (Campino et al., 2000; Santos-Gomes et al., 2003) consideram que cães experimentalmente infectados com amastigotas desenvolvem infecção sintomática, enquanto os infectados com promastigotas desenvolvem infecção assintomática, embora com alterações hematológicas e proteicas. Entretanto, diversos estudos (Pinelli et al., 1994; Martínez-Moreno et al., 1995; Carrera et al., 1996; Nieto et al., 1999; Rhalem et al., 1999; Leandro et al., 2001; Travi et al., 2009) não corroboram esta ideia. Assim, deve-se considerar que tanto amastigotas como promastigotas produzem resposta clínica pleomórfica.

Outro ponto que pode ser explorado no uso de cães como modelo experimental para LV é a avaliação da resposta funcional. As células T e as citocinas por elas produzidas exercem papel central na resposta imune contra patógenos intracelulares (Pinelli et al., 1999). Uma vez que Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios, a proteção é dependente da atividade das citocinas, que podem modular tanto a destruição dos parasitos dentro das células como a multiplicação destes. Em contrapartida, ocorre proliferação intensa de linfócitos B e também a produção de anticorpos, que é abundante, porém não protetora (Almeida et al., 2005). No cão, é observada correlação inversa entre a resposta imune mediada por células e a carga parasitária. São observados picos de parasitemia na ausência de resposta imune celular específica e vice-versa (Rodríguez-Cortés et al., 2007b). Dessa forma, assim como em humanos, cães assintomáticos podem ser capazes de produzir e manter resposta imune celular efetiva que inibe a replicação do parasito nos órgãos-alvo.

Atualmente não há dados conclusivos sobre os mecanismos imunológicos responsáveis pela resistência ou progressão da LVC. A resposta imune Th2, associada à progressão da doença representada pela baixa síntese de IFN-γ e aumento dos níveis de IL-10 (Sharma & Singh, 2009), tem sido apenas parcialmente demonstrada na LVC (Quinnell et al., 2001; Lage et al., 2007; Alves et al., 2009). Demonstrou-se a associação da carga parasitária com a evolução clínica da LVC e com a expressão de determinadas citocinas, como INF-γ, IL-2, IL-6, IL-10 e IL-12 (Santos-Gomes et al., 2002; Barbieri, 2006; Lage et al., 2007; Manna et al., 2008), o que ressalta o papel crucial dos linfócitos T e de citocinas na modulação da resposta imunológica protetora. Manna e colaboradores (2006; 2009) e Alves e colaboradores (2009) demonstraram a expressão de IFN-γ e TNF-α em cães assintomáticos e IL-10 e TGF-β em cães sintomáticos. Culturas de células mononucleares de sangue periférico de cães assintomáticos infectados experimentalmente com L. infantum apresentam resposta predominantemente Th1, mostrando IFN-γ e TNF-α como as principais citocinas envolvidas na ativação do mecanismo leishmanicida dos macrófagos (Pinelli et al., 1994; Santos-Gomes et al., 2002; Carrillo & Moreno, 2009), contudo, tal perfil não foi mostrado por outros autores (Poot et al., 2005). A variabilidade na resposta pode estar relacionada à metodologia utilizada nos diferentes estudos ou possivelmente à cepa do parasito envolvida.

Altos níveis de anticorpos específicos têm sido associados à disseminação do parasito para os diferentes tecidos (Martínez-Moreno et al., 1995; Solano-Gallego et al., 2001). Diversos estudos têm demonstrado resultados contraditórios (Pinelli et al., 1994; Nieto et al., 1999; Rhalem et al., 1999; Rodríguez-Cortés et al., 2007b; Boggiatto et al., 2010; Carson et al., 2010), na análise dos isotipos de IgG no soro de cães sintomáticos e assintomáticos, evidenciando a falta de especificidade dos reagentes comerciais em detectar essas subclasses (Day, 2007). Além disso, a resposta depende do tipo do antígeno utilizado no ensaio sorológico (Silvestre et al., 2008; Maia et al., 2010). No modelo canino a razão IgG2:IgG1 não é preditiva da evolução clínica ou parasitológica da infecção (Carson et al., 2010). Animais sintomáticos produzem IgM mais tardiamente do que a IgG, sugerindo que aquela imunoglobulina não pode ser considerada um marcador de fase aguda na LVC (Rodríguez-Cortés et al., 2007b).

O estudo da patogênese ou da resposta imune durante a infecção com leishmânias viscerotrópicas em cães experimentalmente infectados se mostra vantajosa em relação à avaliação em animais naturalmente infectados, pois permite o controle de todos os aspectos da infecção além do acompanhamento da evolução clínica. Entretanto, quando tal modelo for extrapolado para se obter informações sobre a doença humana, devem-se levar em consideração as diferenças metabólicas e fisiológicas entre essas espécies.

 

Primatas não humanos

Em geral, primatas não humanos são utilizados como o último modelo experimental para estudos de segurança e eficácia de vacinas e drogas, já avaliadas em outros modelos animais. A relação filogenética, a similaridade anatômica, fisiológica e da resposta imunológica com os seres humanos fazem desses animais excelentes modelos para a pesquisa biomédica (Kennedy et al., 1997). Em virtude disso, é esperado que eles mimetizem vários aspectos da interação de humanos com parasitos do complexo L. donovani. Uma grande variedade de macacos do Novo Mundo e do Velho Mundo é utilizada como modelo experimental para leishmânias viscerotrópicas, sendo especialmente útil no estudo da biologia, patogênese e da resposta imune contra esses parasitos. Primatas do Novo Mundo, como o macaco-coruja – Aotus trivirgatus (Chapman, Hanson & Hendricks, 1981; Broderson, Chapman & Hanson, 1986), o macaco-de-cheiro – Saimiri sciureus (Chapman, Júnior & Hanson, 1981; Dennis et al., 1985; Dennis et al., 1986) e o sagui – Callithrix jacchus (Marsden et al., 1981), parecem ter diferentes níveis de suscetibilidade. Os sintomas e sinais clínicos apresentados nesses modelos são análogos àqueles observados em pacientes com LV. Primatas do Velho Mundo, como macacos ‘sykes’ – Cercophitecus mitis – e babuínos – Papio cynocephalus – mostram suscetibilidade moderada a baixa a infecções induzidas por L. donovani, tendendo para cura espontânea (Githure et al., 1986). O langur indiano – Presbytis entellus (Dube et al., 1999; Misra, Dube & Naik, 2004), o macaco verde africano – Cercophitecus aethiops (Binhazim et al., 1993; Gicheru et al., 1995; Olobo, Gicheru & Anjili, 2001) e o macaco rhesus – Macaca mulatta (Porrozzi et al., 2006) – também são capazes de mimetizar a doença observada em humanos com uma grande variedade individual na intensidade dos sinais clínicos e na resposta imunológica.

Considerando o ponto de vista da imunologia, a possibilidade do uso de primatas não humanos como modelo experimental da leishmaniose visceral torna-se uma importante ferramenta para entender os mecanismos envolvidos na aquisição de imunidade. Neste sentido, é importante salientar que reagentes que detectam imunoglobulinas humanas, antígenos de superfície de linfócitos e citocinas fazem reação cruzada com aqueles de primatas não humanos (Porrozzi et al., 2006; Souza-Lemos et al., 2008; Campos et al., 2010). Níveis variáveis, porém significantes de IFNγ, foram observados em sobrenadantes de culturas de células mononucleares de sangue periférico de macacos rhesus infectados com L. infantum e estimulados com antígeno solúvel de Leishmania (Porrozzi et al., 2006). Nesse modelo, observou-se a formação de granulomas hepáticos, principalmente no período de até nove semanas pós-infecção que se encontram associados à eliminação dos parasitos e à resolução da infecção. Esse tipo de formação de granulomas imunes está intimamente relacionado com a produção de IFNγ.

Primatas não humanos para o uso como modelo experimental podem ser diretamente provenientes da natureza, uma vez que em certas regiões da África são considerados praga pela população local (Olobo, Gicheru & Anjili et al., 2001), ou de colônias de reprodução. No entanto, é importante destacar que esses animais podem albergar agentes infecciosos que representam risco para a saúde dos profissionais que os manipulam, tais como vírus do Herpes B (Herpesvirus simiae) e o vírus STLV-1, próprios de macacos. Além disso, os animais capturados na natureza podem estar infectados como uma série de patógenos humanos como Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum, vírus da Hepatite A, Bacillus anthracis (Antrax) e vírus Ebola, entre outros (Kennedy et al., 1997). Isso gera um custo extra para a viabilização dos experimentos, tendo em vista que procedimentos de biossegurança e quarentena devem ser implementados. A despeito dessas considerações, a demanda para o uso de primatas não humanos na pesquisa biomédica está aumentando. Estudos visando aos testes de novas vacinas e drogas para leishmaniose visceral necessitam de um modelo que seja não somente capaz de reproduzir os eventos básicos da imunopatogênese, mas também uma resposta fisiológica e imunológica que se assemelhem mais com a esperada em humanos do que as obtidas em modelos animais de pequeno porte.

Considerações finais

Como exposto, vários modelos animais para LV estão disponíveis e cada um é dotado de características específicas que devem ser consideradas, pois nenhum dos modelos reproduz fielmente a doença humana. Isto, logicamente, reflete as diferenças fisiológicas das espécies e as diferenças entre a infecção natural e a artificial. Na infecção natural os flebotomíneos inoculam algumas centenas de promastigotas metacíclicos, enquanto nas infecções experimentais utilizam-se doses muito altas de promastigotas de cultura ou mesmo de amastigotas. As vias de inoculação experimental também são diferentes da infecção natural, o que pode e deve induzir resposta imunológica e evolução clínica distintas. Em termos gerais, podemos considerar como modelo animal o conjunto de metodologias empregadas, incluindo a espécie animal, para que possamos induzir mecanismos patológicos similares àqueles da doença humana.

É importante ressaltar que a escolha do modelo também deve levar em consideração que este deve permitir a avaliação acurada dos fenômenos biológicos que se pretende abordar. Nesse sentido, a disponibilidade de reagentes imunológicos para abordar questões relacionadas com os mecanismos imunopatológicos associados à doença em questão é de fundamental importância. Outro fator relevante, porém pouco explorado, é a escolha do gênero dos animais utilizados na infecção por Leishmania spp. Tanto em camundongos quanto em hamsters, aparentemente machos são mais suscetíveis que fêmeas, provavelmente em virtude da influência hormonal sobre a síntese e a secreção de citocinas que interferem no curso da infecção (Travi et al., 2002). Em outros modelos animais, tal aspecto tem sido negligenciado e não há informação disponível. Animais de pequeno porte, principalmente os camundongos, são os mais utilizados na pesquisa biomédica, o mesmo se refletindo no caso da pesquisa em LV. Tais animais podem ser ‘convencionais’, cuja biota é indefinida, ou ‘gnotobióticos’, que podem ser com flora definida ou totalmente livres de vida associada. A condição sanitária é relevante quando se deseja isolar um fenômeno biológico e detalhálo, pois infecções associadas podem interferir nos resultados. É claro que essas condições podem ser conseguidas para outros modelos animais, entretanto é muito mais difícil e de custo mais alto. Outra ferramenta que contribui significativamente para o entendimento da patogênese da LV e de outras doenças é o uso de camundongos nocauteados para determinados genes (Murray & Nathan, 1999; Murray et al., 2000; Engwerda et al., 2004), o que permite estudar de forma pontual a participação das moléculas expressas durante a infecção por leishmânias viscerotrópicas. Juntamente com os hamsters, os camundongos são a primeira escolha para estudos de mecanismos básicos da imunopatogênese da LV, de desenvolvimento de vacinas e de novos fármacos. Todavia, importantes diferenças na fisiologia, metabolismo e resposta imune podem exigir o uso de outros modelos animais.

Os cães representam um excelente modelo para o estudo da LVH, pois, como já visto, apresentam vários aspectos similares àqueles observados em humanos. Além disso, como hospedeiros acidentais, adquirem a infecção, tornando possível a comparação entre as infecções natural e experimental. Embora avanços no conhecimento dessa enfermidade tenham sido alcançados nos últimos anos, os conhecimentos sobre os mecanismos imunológicos responsáveis pela proteção ou progressão da infecção ainda são fragmentados. Os cães são os modelos usados na segunda fase em testes de vacinas e drogas, mas em razão das diferenças no metabolismo de drogas e da escassez de dados acurados sobre a resposta imune, deve-se ter cuidado nas extrapolações para a doença humana.

A proximidade filogenética de uma determinada espécie não garante que seja o melhor modelo experimental. Primatas do Novo Mundo aparentam ser melhores modelos para a malária induzida por Plasmodium falciparum (Carvalho et al., 2005) do que os do Velho Mundo, que são resistentes a essa espécie de Plasmodium. Para estudos de LV, os macacos encontrados nas Américas, distantes cerca de 30 milhões de anos (MA) da espécie humana, são mais suscetíveis a infecção por leishmânias viscerotrópicas do que o macaco verde africano, distante cerca de 15-20 MA, e do que o macaco rhesus, distante cerca de 8-9 MA, por exemplo (Kennedy et al., 1997).

Embora menos suscetíveis, as espécies do Velho Mundo desenvolvem uma doença muito próxima à observada em humanos (Olobo, Gicheru & Anjili, 2001; Porrozzi et al., 2006), com sintomatologia transiente e eventual controle da infecção. De certa forma isso limita os testes de vacinas, pois a infecção subclínica nos grupos-controle dificulta a interpretação dos resultados, mascarando uma possível proteção da vacina. Os primatas não humanos são os animais de escolha para estudos de segurança, imunogenicidade e proteção no teste de vacinas e drogas candidatas para a LV (terceira fase da experimentação animal). Em contrapartida, são mais difíceis de ser utilizados, em razão do alto custo de manutenção e experimentação, do forte apelo ético e do fato de algumas espécies estarem em risco de extinção.

A escolha do melhor modelo de experimentação animal não obedece a regras claras, já que diversos fatores limitam a reprodução acurada da doença humana. O objetivo da pesquisa deve ser claro, devendo-se procurar o modelo que mais se aproxime da questão abordada. A padronização dos procedimentos é essencial e deve-se ter em mente que nenhum modelo traz garantia absoluta de reprodutibilidade do fenômeno estudado para a espécie humana.

 

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