5 – Bioquímica de Schistosoma mansoni Franklin David Rumjanek, Iramaya Rodrigues Caldas e Giovanni Gazzinelli

5 - Bioquímica de Schistosoma

mansoni

 

Franklin David Rumjanek; Iramaya Rodrigues Caldas; Giovanni Gazzinelli

 

Região delgada da junção cauda-corpo da cercária do Schistosoma

mansoni contendo a vesícula excretora. A eliminação da cauda

desencadeia processos morfológicos e moleculares que levam à

transformação cercária-esquistossômulo. Fonte: Howells et al.

(1974).

Este capítulo, sobre aspectos da bioquímica de Schistosoma

mansoni, encontra-se dividido em três partes. A primeira refere-

se ao seu metabolismo geral, incluindo biomoléculas de S.

mansoni e metabolismo de glucídeos, lipídeos, proteínas e

glicoconjugados. A segunda refere-se à estrutura molecular da

espécie, especificidades e funções das proteases relevantes

para a sua manutenção, incluindo aspectos sobre a liberação

do miracídio do ovo, penetração da cercária no hospedeiro, sua

transformação em esquistossômulo e seu escape da ação

destrutiva do hospedeiro e, finalmente, informações sobre as

proteases envolvidas na digestão do verme adulto. A terceira

parte trata da bioquímica da reprodução do helminto:

fenômenos relacionados com o amadurecimento sexual,

mediadores químicos, receptores e vias de transdução de sinais

do parasito adulto. A parte referente à biologia molecular será

tratada no capítulo 7.

 

Metabolismo

Até recentemente, grande parte da informação relativa ao metabolismo de esquistossomos era obtida a partir de abordagens baseadas principalmente na bioquímica mais tradicional, isto é, aquela que envolvia experimentos funcionais. Esses experimentos visavam medir diretamente em homogeneizados, ou em frações obtidas por centrifugação diferencial, as atividades das enzimas que participam das várias vias e ciclos metabólicos, assim como a purificação de produtos relevantes. Embora tenha sido possível reconstruir parcialmente um perfil bioquímico dos esquistossomos, muitas questões fundamentais ainda permanecem sem respostas conclusivas. Por exemplo, o parasito é capaz de realizar metabolismo aeróbio em todos os seus estádios? Em que circunstâncias? Quais metabólitos são importantes na regulação das vias do próprio microrganismo? Por que S. mansoni não consegue realizar síntese ‘de novo’ de ácidos graxos e de esteróis? Quais produtos do hospedeiro são essenciais para os esquistossomos? Como é controlado bioquimicamente o desenvolvimento e o amadurecimento sexual dos parasitos? E assim por diante.

As principais dificuldades dos experimentos bioquímicos decorrem da complexidade do ciclo de vida do parasito e de sua manutenção no laboratório. Ademais, até hoje não foi possível estabelecer culturas de linhagens de células de S. mansoni. Tal situação necessariamente restringe uma pesquisa mais canônica, em virtude da escassez de material (massa de parasitos), o que por seu turno prejudica a caracterização fina de enzimas ou produtos de interesse. Em conseqüência, à diferença de nematóides de vida livre como C. elegans, tem-se ainda um quadro incompleto da bioquímica de S. mansoni.

No entanto, avanços técnicos na área de Biologia Molecular viabilizaram a análise sistemática do genoma do parasito. Resultados recentes, obtidos por vários consórcios de laboratórios realizando a seqüência do genoma de S. mansoni, produziram um banco de dados que atualmente cobre aproximadamente 92% do transcriptoma de S. mansoni (Verjovski-Almeida et al., 2003). Esse banco passou a constituir um importante acessório e permitiu a adoção de uma nova estratégia na qual o genoma fornece dados valiosos que complementam a pesquisa da bioquímica de S. mansoni. Além deste projeto, a Rede Genoma de Minas Gerais vem trabalhando na geração de aproximadamente 70 mil etiquetas de seqüências expressas (ESTs), que serão importantes na montagem do genoma do parasito e na elucidação dos genes existentes (Oliveira, Rodrigues & Romanha, 2004).

Esse capítulo já se beneficia dessa ferramenta e os dados apresentados adiante procurarão combinar evidências compiladas a partir dessas duas fontes de informação.

É preciso ressaltar também que algumas vias metabólicas em S. mansoni, como por exemplo, aquelas envolvendo os aminoácidos foram muito pouco investigadas nesse parasito e, portanto, juntamente com algumas outras vias minoritárias, serão brevemente mencionadas ao final do capítulo.

Os vermes adultos de S. mansoni vivem durante muitos anos nas veias do mesentério porta-hepático do hospedeiro definitivo. Este é o estádio mais longevo do parasito, o que do ponto de vista metabólico leva a ponderações sobre a obrigatoriedade de uma estreita relação parasito-hospedeiro. Em outras palavras, a viabilidade dos vermes adultos em seu hospedeiro estabelece uma grande dependência daqueles no que tange ao aporte de nutrientes e ao modo pelos quais estes são utilizados metabolicamente.

Entretanto, este não é o caso das formas de vida livre de S. mansoni, isto é, as cercárias e os miracídeos, que, vivendo mesmo que brevemente na água doce, necessariamente exibem auto-suficiência no contexto de obtenção de energia através das reações metabólicas. Como será visto, a diferença entre os hábitats nos estádios de S. mansoni pode ser um fator evolutivamente determinante no condicionamento metabólico dos organismos.

Considerando primeiramente o meio ambiente no qual vivem os vermes adultos, as seguintes observações são pertinentes. Por um lado, a veia porta drena o sangue a partir do estômago, baço, pâncreas e intestino, sendo, portanto, rica em nutrientes. No entanto, o sangue já se encontra parcialmente desoxigenado e somente contribui com cerca de 50% a 55% de oxigênio para o suprimento hepático. Assim, os parasitos encontram um ambiente nutritivo rico, porém relativamente pobre em oxigênio.

Durante a evolução, essa situação pode ter condicionado o metabolismo energético dos vermes adultos e determinado, por seleção natural, um catabolismo com características predominantemente anaeróbicas. De fato, esse estádio do parasito apresenta glicólise anaeróbica com excreção substancial de ácido lático diretamente na circulação sangüínea. Essa excreção é tão intensa que pode ser facilmente observada in vitro. Em poucos minutos, os vermes adultos incubados em meio contendo vermelho de fenol produzem a viragem do indicador na vizinhança imediata da membrana, revelando prontamente um halo amarelo ao redor dos organismos.

Em se tratando de parasitos com alta demanda energética, principalmente as fêmeas maduras, que produzem cerca de 300 ovos por dia, a glicólise anaeróbica exige um aporte de glicose compatível. Em outras palavras, nesse contexto é preciso considerar-se também o transporte de glicose através das membranas do tegumento dos vermes adultos.

Transporte de Glicose

De uma forma geral, nos vermes adultos, o transporte de moléculas pequenas como monossacarídeos e aminoácidos ocorre principalmente através das membranas do tegumento. A glicose e outros componentes do sangue podem desempenhar papéis acessórios no estímulo da formação da dupla camada lipídica da superfície do tegumento que imediatamente sucede à transformação das cercárias (Skelly & Shoemaker, 2000).

No caso da glicose, há um intenso transporte que pode atingir taxas equivalentes a 15% a 25% do peso seco dos vermes (Camacho & Agnew, 1995). Em valores absolutos, experimentos cuidadosos, utilizando vermes vivos, em sistema com fluxo constante de meio de cultura que se aproxima da situação real, revelaram um valor de taxa de incorporação de glicose por vermes adultos de 0,656 pmol/mg de proteína/min, com base num traçador radioativo consistindo de 3H-2-desoxiglicose.

Curiosamente, esse valor representa cerca da metade da incorporação de glicose daquela observada em S. haematobium e S. bovis (Camacho & Agnew, 1995). Para fins comparativos, um cálculo aproximado baseado no valor acima, levando-se em conta um volume de 0,0628 mm 3 de uma fêmea madura de S. mansoni e um volume globular médio de hemácias de 90 fL (femtolitros), revela que a incorporação de glicose por S. mansoni é cerca de duas mil vezes maior do que aquela das hemácias. Essa elevada taxa de incorporação de glicose equivale àquela de um tumor de crescimento rápido.

Apesar de os vermes adultos possuírem um tubo digestivo, a entrada de pequenas moléculas, como monossacarídeos e aminoácidos, se dá por via transtegumentar. Não há, entretanto, um transporte ativo de glicose pelos esquistossomos. O transporte da glicose através da dupla camada lipídica dos vermes adultos ocorre por difusão facilitada mediado por transportadores de glicose (Cornford et al., 1988). Os transportadores de glicose bem caracterizados, até o momento, em S. mansoni e S. japonicum, são o SGTP1 e SGTP4 (Schistosome glicose transporter 1 e 4) (Skelly & Shoemaker, 1996; Skelly et al., 1994; Jiang et al., 1996). SGTP1 localiza-se na membrana basal do tegumento e nas suas pregas, ao passo que SGTP4 foi encontrado exclusivamente na face externa do tegumento e nas vesículas membranosas no interior do citoplasma das células sinciciais do tegumento. Os transportadores de glicose exibem estereoespecificidade para D-glicose, possuem especificidade relativamente baixa para hexoses e independem de sódio (Skelly et al., 1994).

Resultados anteriores à caracterização molecular dos transportadores de glicose de S. mansoni mostraram que existem diferenças, entre vermes machos e fêmeas, nas taxas de transporte de glicose (Cornford et al., 1988). Experimentos in vitro mostraram que machos acasalados exibiram uma taxa de transporte significativamente mais baixa do que as fêmeas acasaladas. Isso pode estar relacionado à maior demanda energética das fêmeas adultas. No entanto, verificou-se que há diferenças também entre as constantes de afinidade dos transportadores, o que sugere a existência de distintos sistemas de transporte. É provável, entretanto, que as distintas taxas de transporte sejam conseqüências apenas do número e da distribuição das moléculas transportadoras.

Como o verme macho possui uma área superficial maior que a fêmea, além de encobri-la parcialmente no canal ginecóforo, já se sugeriu que a fêmea recebe a glicose e outras pequenas moléculas indiretamente, isto é, através do macho (Cornford et al., 1988). Essa sugestão partiu de experimentos nos quais os vermes carregados com glicose radioativa eram capazes de mediar o transporte vetorial no sentido macho → fêmea. Contudo, para comprovar esse modelo, há necessidade de mais evidências, uma vez que já foi demonstrado que as fêmeas isoladas são capazes de absorver glicose e aminoácidos eficientemente (para mais detalhes, ver a parte referente ao desenvolvimento sexual). Ademais, não há dados sobre possíveis diferenças estruturais entre transportadores de glicose de machos e fêmeas já caracterizados. Interessantemente, a glicose parece modular também a incorporação de outros nutrientes, tais como adenina, adenosina, arginina, colina histidina e lisina (Cornford & Fitzpatrick, 1992).

Curiosamente, o transporte de glicose em S. mansoni parece independer de insulina. Experimentos demonstraram que concentrações relativamente altas de insulina não afetaram a taxa de incorporação de 14C 2-desoxiglicose. O hormônio marcado com 125 I tampouco se ligou ao parasito de modo específico (Clemens & Basch, 1989). Assim, é possível que o transporte de glicose através do tegumento constitua um processo predominantemente limitado pela disponibilidade do soluto glicídico e pela saturação dos transportadores. Apesar de o transporte de glicose por S. mansoni independer de um hormônio classicamente associado à incorporação de glicose e de aminoácidos, é possível que outros mediadores tenham um papel fisiológico nesse processo. Por exemplo, experimentos mostraram que em S. haematobium e S. bovis a acetilcolina aumentou em cerca de 60% o transporte de glicose atuando em receptores presentes na superfície dos parasitos (Camacho & Agnew, 1995). Receptores nicotínicos para a acetilcolina foram recentemente caracterizados em S. haematobium (Bentley et al., 2004; Jones et al., 2002). No entanto, não se sabe se esse sistema colinérgico é fisiologicamente importante para S. mansoni, já que não houve incremento na taxa de transporte de glicose em resposta a acetilcolina.

Transporte e Metabolismo de Aminoácidos Aminoácidos são também transportados intensamente através das membranas tegumentares. O aminoácido tirosina, por exemplo, um dos principais constituintes das proteínas da casca do ovo, é intensamente transportado através do tegumento do verme macho. Mostrou-se que a taxa de transporte aumenta quando o verme macho se encontra acasalado, o que indica que existe um transporte de aminoácido do macho para a fêmea, como sugerido no caso da glicose (Haseeb, 1998).

Embora existam publicações sobre a incorporação de aminoácidos em S. mansoni (Cornford & Oldendorf, 1979), ainda não há maiores detalhes sobre a natureza dos transportadores, exceto a descrição do homólogo SPRM1, descrito por Mastroberardino et al. (1998) e por Pfeiffer et al. (1998).

Na literatura médica, não há descrições sobre o destino metabólico dos aminoácidos. Algumas reações de transaminação serão discutidas mais adiante, quando tratarmos do ciclo de Krebs. Na ausência de dados sobre as vias individuais de catabolismo dos aminoácidos, torna-se difícil avaliar, do ponto de vista de excreção do excesso de nitrogênio, se os esquistossomos são amonotélicos, ureotélicos ou uricotélicos. Admitindo-se que os processos de desaminação em S. mansoni gerem produtos excretados via ciclo da uréia, cabe a pergunta sobre a existência das enzimas envolvidas nesse processo. A primeira reação relevante do ciclo da uréia é aquela catalisada pela carbamoil fosfato sintetase, que, embora rigorosamente não faça parte do ciclo da uréia, é essencial

na condensação e ativação do NH -+ e HCO para formar carbamoil 4 3 fosfato, consistindo assim em reação comprometida do ciclo que ocorre nas mitocôndrias. A atividade de carbamoil fosfato sintetase já foi detectada em S. mansoni (Hill et al., 1981) e ESTs (expressed sequence tag = etiqueta de seqüência expressa) do gene dessa enzima estão amplamente representados no banco de dados do transcriptoma. Sobre as outras enzimas, ornitina-transcarbamilase, argininossuccinato-sintetase, argininossuccinase e arginase, não há dados funcionais na literatura. No banco de ESTs, a enzima arginosuccinase não está representada. Assim, não é possível concluir se o ciclo da uréia é operacional, em S. mansoni.

Glicólise

A via glicolítica consiste na degradação seqüencial da glicose, gerando como produto final o ácido lático. As reações dessa via são catalisadas pelas enzimas hexoquinase, fosfoglicose-isomerase, fosfofrutoquinase, aldolase triose-fosfato-isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, fosfogliceratoquinase, fosfoglicerato-mutase, enolase e piruvato-quinase.

Sendo S. mansoni um fermentador homolático, a última etapa dessa via consiste na conversão do piruvato em ácido lático pela lactato-desidrogenase. Nessa última reação, NAD + é regenerado, preservando dessa maneira o poder oxidativo da coenzima que é utilizada ao longo das reações da glicólise.

As enzimas estão representadas no banco de ESTs ou no transcriptoma de S. mansoni (Verjovski- Almeida, et al., 2003). Dentre essas enzimas, algumas foram purificadas ou clonadas e expressas e as suas estruturas, bem como as propriedades cinéticas, foram analisadas. Cumulativamente, esses resultados indicam que a glicólise nesse parasito ocorre de forma canônica.

Interessantemente, no transcriptoma de S. mansoni há também várias ESTs anotadas para a enzima álcool-desidrogenase. Esta enzima, juntamente com a coenzima NADH, reduz o acetaldeído, formando etanol de acordo com as seguintes reações: piruvato → acetaldeído → etanol. Por seu turno, o acetaldeído é formado pela descarboxilação do ácido pirúvico pela enzima piruvato-descarboxilase. ESTs homólogos a piruvato-descarboxilase também estão abundantemente presentes no transcriptoma de S. mansoni, de modo que, potencialmente, o parasito poderia também produzir NAD+ durante a glicólise, mediante redução a etanol. Nesse contexto, é plausível também a hipótese de que, no caso de ingestão de álcool pelos indivíduos infectados por S. mansoni, a enzima álcool-desidrogenase do parasito possa atuar convertendo o etanol a acetaldeído. Como a reação etanol ↔ acetaldeído é plenamente reversível, a formação de acetaldeído dependeria somente da constante de equilíbrio da reação resultante das massas dos reagentes. Entretanto, na literatura sobre S. mansoni não há dados funcionais e cinéticos dessa enzima.

Apesar de na glicólise haver relativamente pouca eficiência na produção de moléculas de ATP (2 ATPs são formados por mol de glicose, em comparação com o metabolismo aeróbico, pelo qual são produzidos 38 moléculas de ATP/mol de glicose), do ponto de vista de aporte energético os parasitos, com a sua demanda constante de ATP, principalmente para o processo de ovogênese, estão perfeitamente adaptados à anaerobiose. Isso ocorre porque na glicólise a produção de ATP é cerca de cem vezes mais rápida do que pela oxidação fosforilativa. Esta é uma situação homóloga àquela do músculo em exercício, cujo ATP é regenerado quase que inteiramente por meio de glicólise. Assim, desde que haja uma quantidade suficiente de glicose na circulação sangüínea, a glicólise de S. mansoni representa para os parasitos uma estratégia evolutiva muito bem-sucedida. É oportuno mencionar que, quando as cercárias transformam-se em esquistossômulos, ocorre uma transição rápida do metabolismo energético (ver transformação da cercária). Enquanto que as cercárias lançam mão de metabolismo aeróbico (que parece ser característico das formas de vida livre de S. mansoni), os esquistossômulos são predominantemente anaeróbicos. Essa transição parece ocorrer principalmente em função da incubação dos esquistossômulos na presença de glicose (Horemans, Tielens & Van Den Bergh, 1992). Ademais, as duas vias, aeróbica e anaeróbica, parecem estar segregadas anatomicamente nas cercárias. A via da glicólise parece estar restrita aos corpos das cercárias (que vão originar os esquistossômulos após a transformação), enquanto as enzimas do ciclo do ácido tricarboxílico se localizariam nas caudas. Desse modo, a ativação da glicólise, que depende da presença de glicose (Horemans, Tielens & Van Den Bergh, 1992), seria deflagrada somente por ocasião da penetração no hospedeiro (ver também transformação cercária-esquistossômulo). É possível então que, rigorosamente, não haja uma transição metabólica, mas simplesmente a ativação da glicólise nos esquistossômulos pela glicose do meio interno do hospedeiro. Nessa hipótese, a cercária poderia ser comparada a um foguete de dois estágios, no qual a cauda, com o seu metabolismo aeróbico, forneceria a energia para a natação na água doce e o corpo corresponderia a uma ogiva contendo as enzimas da via glicolítica. Esse modelo já havia sido proposto anteriormente (Rumjanek, 1987).

Com relação ao destino do lactato gerado pelos vermes adultos, sabe-se, conforme antes mencionado, que há uma intensa secreção do composto. Se de fato o lactato for o produto final da via anaeróbica, pode ser então considerado um produto de excreção (ver discussão mais adiante).

No hospedeiro, o lactato pode ser aerobicamente reconvertido na glicose, por intermédio do ciclo de Cori. Quando a gliconeogênese ocorre na mesma célula ou no mesmo órgão, pelo ciclo de Cori, passa a constituir um ciclo fútil, isto é, sem ganho ou perda líquida de energia. No hospedeiro, entretanto, o ciclo de Cori possui vantagens metabólicas, no sentido de que o lactato produzido no músculo é transportado para o fígado, onde então regenera o piruvato e eventualmente o glicogênio. No entanto, nos vermes adultos de S. mansoni, não há, a priori, vantagens evolutivas nesse ciclo. De fato, com base em experimentos que utilizaram substratos para várias enzimas da gliconeogênese marcadas radioativamente,

bem como bicarbonato de sódio (14C-NaHCO ), a gliconeogênese 3 não foi detectada nesse parasito (Tielens et al., 1991a, 1991b). Não obstante, as enzimas que participam da glicoeneogênese, isto é, glicose-6-fosfatase, frutose-1,6 bisfosfatase, fosfoenol piruvato-carboxiquinase e piruvato-carboxilase, estavam todas elas presentes nos extratos totais de vermes adultos de S. mansoni. Tais resultados chamam a atenção para o fato de que, ao se investigar o metabolismo de S. mansoni, não basta somente se detectar as atividades enzimáticas e daí postular a existência de ciclos e vias metabólicas. É importante estabelecer também se as reações envolvendo as várias enzimas e substratos estão interligados de maneira funcional, passíveis de regulação. Nesse contexto, experimentos de northern blot com mRNA extraído de vários estádios de S. mansoni revelaram em vermes adultos a presença de vários transcritos correspondendo a enzimas do ciclo do ácido tricarboxílico e da subunidade 1 da citocromo oxidase (Skelly et al., 1993). A conclusão dos autores foi que os níveis de expressão relativamente altos desses transcritos sugeriam que os vermes adultos retinham a capacidade de produzir energia através de metabolismo aeróbico. No entanto, como se viu no caso da gliconeogênese, a simples presença das enzimas não significa que, obrigatoriamente, elas façam parte de um ciclo coerente. Mais adiante esses pormenores serão discutidos em maior detalhe, ao abordarmos o metabolismo aeróbico de S. mansoni.

As enzimas da glicólise de S. mansoni melhor caracterizadas permitem algumas comparações relevantes. Dentre as enzimas da via glicolítica de S. mansoni, somente há dados estruturais e/ou cinéticos para a hexoquinase, fosfoglicose-isomerase, fosfofrutoquinase, fosfoglicerato-quinase, triose-fosfato-isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e frutose-1,6-bisfosfato aldolase.

A hexoquinase é a primeira reação da via glicolítica e representa aquela na qual ocorre o consumo da primeira molécula de ATP, que atua como o substrato na fosforilação da glicose na posição 6. Em geral a hexoquinase é inibida por seu próprio produto, a glicose-6-fosfato.

As propriedades cinéticas da hexoquinase de S. mansoni já foram estudadas tanto na enzima parcialmente purificada a partir de homogenatos totais de vermes adultos (Tielens et al., 1994), como na proteína recombinante expressa em E. coli (Armstrong, Wilson & Shoemaker, 1996). A enzima apresenta uma massa molecular de 52 kDa, semelhante, portanto, à maioria das hexoquinases de mamíferos. Observou-se que o K calculado para ATP e para m glicose foi diferente quando as duas preparações da enzima foram comparadas. Por exemplo, o K para ATP foi mais baixo na enzima m recombinante do que na enzima parcialmente purificada, ao passo que o K para glicose foi mais alto na recombinante. Essas m

diferenças provavelmente refletem modificações pós-traducionais, tais como as glicosilações, que ocorrem nas proteínas nativas e não nas recombinantes. Com base nos dados cinéticos pode-se concluir que a hexoquinase de S. mansoni é semelhante à enzima de mamíferos do tipo I. A comparação das propriedades da hexoquinase de vermes adultos com a hexoquinase de cercárias revelou-as idênticas, sugerindo que em S. mansoni existe somente uma forma da enzima.

Da mesma forma como para a hexoquinase de mamíferos, a enzima de S. mansoni sofre inibição pelo produto, isto é, pela glicose-6-fosfato (G-6-P). Entretanto, o K da G-6-P para a hexoquinase de S. i: mansoni é mais alto do que para a hexoquinase de mamíferos. Este resultado sugere uma adaptação evolutiva com respeito à enzima do parasito, no sentido de garantir um alto fluxo ao longo da via glicolítica. É interessante, no entanto, que a sensibilidade reduzida para G-6-P da hexoquinase de S. mansoni seja semelhante àquela de hexoquinases de células que estão realizando glicólise aeróbica intensamente.

Os resultados obtidos com a enzima nativa indicam que existe uma alta afinidade para a glicose, um resultado que é compatível com a atuação dessa enzima como ‘sensor’ de toda a via glicolítica, uma vez que, para que haja formação de lactato, basta que exista glicose no meio externo. No caso de S. mansoni, a presença de glicose no sangue do hospedeiro definitivo provavelmente constitui um importante sinal, que regula a transição ou ativação do metabolismo aeróbico das cercárias para a glicólise dos esquistossômulos (Horemans, Tielens & Van Den Bergh, 1992).

A reação catalisada pela enzima fosfoglicose-isomerase compreende a conversão da glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato e é também caracterizada por uma estereoespecificidade absoluta. Infelizmente não há dados recentes sobre essa enzima em S. mansoni. O trabalho original com a fosfoglicose-isomerase (Bueding & MacKinnon, 1955). revela apenas que esta possui um K m semelhante àquela de músculo de coelho e que, em experimentos com anticorpos policlonais, as estruturas da enzima do parasito e do músculo de coelho parecem ser homólogas.

A etapa da glicólise envolvendo a enzima fosfofrutoquinase (PFK) corresponde ao consumo da segunda molécula de ATP e tem interesse intrínseco para a via, uma vez que se trata da enzima marca-passo da glicólise, passível de regulação. Ademais, no caso dos esquistossomos, a PFK é o alvo da ação de alguns fármacos baseados no antimônio e usados inicialmente na quimioterapia da esquistossomose. Dados estruturais (Ding, Su & Mansour, 1994), mostram que a PFK de S. mansoni possui massa molecular de 86 kDa, semelhante àquela de outros organismos, e exibe uma homologia maior com a PFK humana do que com a PFK de H. contortus. Para estudos cinéticos, a PFK de S. mansoni foi clonada e expressa (Su et al., 1996). Os resultados mostraram que a PFK recombinante do parasito é relativamente insensível às mudanças de pH na faixa entre 7,5 e 9,0, além de manter a maior parte de sua atividade mesmo em pH ligeiramente ácido. Isso sugere que, diferentemente da PFK de mamíferos, a enzima de S. mansoni talvez não tenha um papel regulador tão destacado. Classicamente, as enzimas de mamíferos sofrem inibição por ATP e ativação por AMP em pH neutro ou ligeiramente ácido. A PFK de S. mansoni é inibida por ATP em pH 6,9 e pH 8,0, porém somente em concentrações de ATP relativamente altas, variando de 0,8 mM a 2 mM. Esse resultado contrasta com a PFK de carneiro, que é completamente inibida por ATP em concentração de 0,25 mM em pH 6,9. Uma outra diferença marcante entre a PFK de mamíferos e de S. mansoni foi encontrada associada com o efeito do citrato. Nos mamíferos o citrato potencia a inibição do ATP. Em S. mansoni, entretanto, não houve potenciação da inibição do ATP pelo citrato, mesmo em altas concentrações.

Na célula, a regulação exercida pelo citrato constitui um importante fator regulador da glicólise. Em mamíferos, por exemplo, quando o nível de citrato produzido na mitocôndria pelas reações do ciclo de Krebs aumenta, aquele pode ser transportado para fora da organela através de transportadores específicos e inibir a PFK no citoplasma. Em S. mansoni, essa inibição da PFK pelo citrato não parece ocorrer. Esse resultado é importante no sentido de ressaltar a natureza predominantemente anaeróbica do metabolismo dos vermes adultos de S. mansoni. Nesse contexto, a atividade PFK de S. mansoni mostrou-se sensível ao pH; em pH 6,9, a atividade enzimática sofreu um decréscimo de 30% (Su et al., 1996). Embora os autores não considerem essa diminuição significativa, ela é importante em organismos que lançam mão da glicólise, mesmo que de forma temporária. Por exemplo, a PFK de animais é sensível ao pH e assim, quando a via glicolítica está ativa, a produção de lactato é suficiente para baixar o pH do microambiente, afetando desse modo a atividade da PFK. Como em S. mansoni o lactato é secretado na circulação sangüínea do hospedeiro, a glicólise não sofre inibição via inibição da PFK. Esses resultados reforçam a idéia de que os vermes adultos de S. mansoni são fermentadores homoláticos.

Com relação ao papel regulador do AMP, demonstrou-se que a PFK de S. mansoni foi ativada igualmente por AMP e AMP cíclico. A relativa insensibilidade à regulação demonstrada pela PFK dos parasitos reforça a idéia de que a via da glicólise é de fato a principal fonte de energia de S. mansoni.

A enzima frutose-1,6-bisfosfato aldolase de S. mansoni já foi clonada e expressa (El-Dabaa et al., 1998). Em função dos dados de homologia concluiu-se que a aldolase de S. mansoni parece pertencer à classe I, ou seja, é mais semelhante à enzima de vertebrados. Essa interpretação foi reforçada pela presença de um sítio de base de Schiff na sua estrutura primária. As aldolases da classe II de fungos e algas e de algumas bactérias não formam a base de Schiff com o substrato.

A existência de duas classes de aldolase na natureza é curiosa, uma vez que a glicólise anaeróbica certamente precedeu as vias aeróbicas, e por isso esperava-se a ocorrência de somente uma espécie da enzima. No entanto, como alguns organismos expressam as duas classes da aldolase, é possível que ambas sejam igualmente antigas.

Após a formação dos isômeros aldose e cetose, gliceraldeído fosfato e diidroxiacetona fosfato pela aldolase, a interconversão entre as duas trioses ocorre via reação catalisada pela enzima triose-fosfato-isomerase (TPI). A TPI de S. mansoni já foi clonada, seqüenciada e expressa, revelando uma massa molecular de 28 kDa e uma homologia relativamente alta com TPI de eucariotos. Vários trabalhos foram realizados avaliando as propriedades imunogênicas da TPI de S. mansoni em animais experimentais (Yang et al., 2000; Ham et al., 2000) e em humanos (Ribeiro et al., 2000).

A etapa da via da glicólise na qual ocorre a formação do primeiro composto intermediário rico em energia (que precede a formação de ATP) é a reação catalisada pela enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH). Pelo fato de essa enzima constituir um importante alvo para estratégias de interferência, tanto com vacinas ou com quimioterápicos, há um grande interesse em investigar suas características estruturais e cinéticas. A GAPDH de S. mansoni já foi clonada, seqüenciada e expressa em diversos vetores (Argiro et al., 2000). Nessa molécula foram identificados alguns epitopos reconhecidos por linfócitos B e T. Determinou-se também que soros de indivíduos que vivem nas áreas endêmicas reconheceram a molécula da GAPDH recombinante de S. mansoni além de também inibir a sua atividade. Não há dados, no entanto, sobre as propriedades cinéticas da molécula e tampouco sobre o mecanismo da reação. Estudos semelhantes foram realizados em S.japonicum (Waine et al., 1993). Entretanto, com base na imunorreatividade de anticorpos monoespecíficos, as enzimas de S. mansoni e S.japonicum parecem ser diferentes.

A reação catalisada pela fosfoglicerato-quinase é aquela que gera também a primeira molécula de ATP da via glicolítica. Em S. mansoni, a enzima fosfoglicerato-quinase foi clonada e o produto desse gene foi caracterizado (Lee et al., 1995). Foi possível estabelecer homologia entre a enzima de S. mansoni e as de várias outras espécies de eucariotos. Sobre as enzimas enolase e piruvato-quinase de S. mansoni, não há dados recentes sobre cinética e mecanismo de ação.

Metabolismo do Glicogênio

A alta dependência metabólica de helmintos no catabolismo de carboidratos imediatamente suscita a pergunta sobre a reserva destas moléculas nos parasitos. O glicogênio já foi identificado em todos os estádios e espécies de esquistossomos (Rumjanek, 1987). Estudos preliminares mostraram que a quantidade do polissacarídeo varia de acordo com a situação metabólica do parasito. No entanto, o estado nutricional do hospedeiro não parece influenciar na concentração de glicogênio em S. mansoni. De fato, admitindo- se que a via da glicólise depende diretamente da disponibilidade de glicose sangüínea, a menos que o hospedeiro apresente uma glicemia excessivamente baixa, é possível supor que mesmo valores baixos de glicose no sangue sejam ainda assim superiores ao K da hexoquinase de S. mansoni, garantindo desse modo um m

fluxo normal da via glicolítica do parasito.

Esta hipótese foi confirmada em estudos nos quais camundongos infectados com S. mansoni foram sujeitos à privação de alimentos. Os vermes perfundidos de animais em jejum e animais-controle apresentaram ambos os valores aproximados de glicogênio (Cornford, Diep & Rowley, 1983). Nestes experimentos, verificou-se também que a taxa de incorporação de glicose dos vermes obtidos de animais em jejum aumentou, mostrando haver algum mecanismo regulador controlando essa compensação.

Do ponto de vista de efetores da regulação da glicogenólise ou da glicogênese, já se demonstrou que a serotonina, que afeta a atividade muscular, pode modificar a quantidade de glicogênio. Não se sabe, entretanto, se flutuações dos níveis de serotonina no sangue do hospedeiro possuem um papel fisiológico na manutenção dos níveis de glicogênio parasitário. Nesse contexto, demonstrou-se que, em S. haematobium e S. bovis, o neurotransmissor acetilcolina foi capaz de afetar a incorporação de glicose através de receptores localizados no tegumento (Camacho & Agnew, 1995), fazendo com que indiretamente a acetilcolina também possa afetar a concentração de glicogênio nessas espécies. Interessantemente, não foi possível detectar a mesma resposta em S. mansoni, embora genes ortólogos codificando os receptores nicotínicos tenham sido caracterizados nessa espécie (Bentley et al., 2004).

Independentemente da possível participação de substâncias reguladoras, dados obtidos em experimentos com hamsters infectados e permanentemente canulados (para receber pulsos de glicose radioativa na circulação sangüínea) mostraram que a síntese de glicogênio em S. mansoni é constante e a concentração final de glicogênio nos vermes só parece depender do tamanho destes (Tielens, Van Den Heuvel & Van Den Bergh, 1990a).

Sabe-se também que vermes machos adultos que não estão acasalados exibem maiores quantidades de glicogênio do que os vermes acasalados. Essa diferença pode ser explicada tanto pela demanda energética, maior no caso do acasalamento, como também pela transferência de glicose, aparentemente vetorial, que ocorre do verme macho para a fêmea.

Entre as espécies de esquistossomos também existem variações intrínsecas na quantidade ‘basal’ de glicogênio. Dentre as espécies de interesse médico, S. mansoni apresenta a menor quantidade de glicogênio, em torno de 12 μg por verme adulto.

De que modo a glicose é incorporada ao glicogênio em S. mansoni? Nos mamíferos, a síntese de glicogênio segue vias diferentes, dependendo do tecido que está sendo analisado. No fígado, por exemplo, a maior parte do glicogênio é formada a partir de precursores de três átomos de carbono, como o lactato. Alternativamente, no músculo o glicogênio é formado diretamente a partir da glicose. Para se determinar a via de biossíntese de glicogênio em S. mansoni, realizaram-se experimentos utilizando glicose marcada com 14C no carbono 6 e no carbono 1. Após incubação dos parasitos in vitro, verificou-se a posição do carbono radioativo nas moléculas de glicose do glicogênio sintetizado ‘de novo’. Os resultados mostraram que mais de 99% das moléculas de glicose exibiam o 14C na posição 6 da glicose, sugerindo que a síntese de glicogênio em S. mansoni ocorre diretamente a partir de glicose (Tielens, Van Den Heuvel & Van Den Bergh, 1990a). Esses experimentos mostraram também a ocorrência da síntese de glicogênio mesmo durante períodos de glicogenólise e vice-versa, isto é: a degradação do glicogênio poderia ocorrer também durante o processo de biossíntese. Ou seja, as vias de síntese e degradação de glicogênio são independentes entre si. No entanto, alguns experimentos realizados com miracídeos mostraram que, mesmo quando incubados na presença de glicose, os organismos degradavam antes as reservas endógenas de glicogênio (Tielens et al., 1991).

A glicose-1-fosfato é produzida na degradação do glicogênio pela fosforilase. A enzima fosfoglicomutase então catalisa a reação na qual a glicose-1-P converte-se em glicose-6-fosfato, e daí entra na via da glicólise. Em S. mansoni tal enzima já foi descrita, apresentando inclusive isoformas diferentes nos dois isolados (Sene et al., 1997).

Ambas as enzimas, a UDP-glicose pirofosforilase, que catalisa a formação de UDP-glicose, e a enzima glicogênio sintetase, que transfere a unidade glicosil da UDP-glicose para os grupamentos C4-OH de uma das extremidades não-redutoras do glicogênio, estão representadas no transcriptoma de S. mansoni (Verjovski-Almeida, 2003). Não se sabe, entretanto, se essas enzimas sofrem regulação alostérica.

Metabolismo Oxidativo: o ciclo do ácido cítrico

Nos eucariotos, as enzimas que atuam no ciclo do ácido cítrico e na oxidação dos ácidos graxos, além das enzimas e proteínas ‘redox’ (em oxidorredução) envolvidas no transporte de elétrons, localizamse nas mitocôndrias. A presença de mitocôndrias nos vários estádios de S. mansoni está bem documentada, desde os trabalhos originais de Smithers et al. (Smithers, Roodwin & Wilson, 1965) até relatos mais recentes (Bieberich & Minchella, 2002). No tegumento dos vermes adultos, as mitocôndrias estão bem evidenciadas nos citons (células subtegumentares que formam sincícios agregando inúmeras organelas subcelulares) (Erasmus, 1987), bem como na maioria das células estudadas em nível de microscopia eletrônica. As mitocôndrias de S. mansoni podem ser purificadas mediante centrifugação diferencial usando um protocolo semelhante àquele utilizado para a purificação de mitocôndrias de outras células eucariotas (Cunha, De Souza & Noel, 1988), sugerindo que as organelas do parasito apresentam características morfológicas não muito distintas das demais. Estudos funcionais com enzimas tipicamente encontradas nas mitocôndrias reforçam a hipótese de que os componentes das mitocôndrias de S. mansoni são semelhantes em todos os aspectos àquelas de outras espécies (Fantappié et al., 1999).

O DNA mitocondrial (mt) de S. mansoni já foi inteiramente seqüenciado, revelando um tamanho de 14,4 Kb, sendo, portanto, um pouco menor que outros mtDNAs de metazoários (Le, Blair & McManus, 2002). A organização da região codificante é típica daquelas encontradas em outras taxas, exibindo genes adjacentes ou separada por seqüências intergênicas curtas. Existem 36 genes, sendo que, destes, 12 codificam proteínas, dois codificam RNA ribossomal e 22 codificam tRNA (Le et al., 2001). O gene do complexo da ATPase, atp8, está ausente.

O código genético do DNA mitocondrial de S. mansoni também difere do código universal, apresentando os códons AAA, AGA e AGG, e TGA especificando Asn, Ser e Trp, respectivamente. Foi observada uma diferença substancial entre as seqüências de DNA mitocondrial de S. mansoni e S. japonicum (Le et al., 2001). A transferência de material genético entre o núcleo e a mitocôndria também já foi relatada em S. mansoni. Entretanto, com respeito à herança materna do DNA mitocondrial, ainda existem algumas dúvidas (Bieberich & Minchella, 2001; Jannotti-Passos et al., 2001).

Em resumo, não há indícios de que as mitocôndrias de vermes adultos de S. mansoni sejam diferentes daquelas de outros organismos que realizam metabolismo aeróbico, ou metabolismo anaeróbico facultativo, a menos que, neste genoma mitocondrial, existam mutações pontuais que provoquem a terminação prematura da tradução de algumas proteínas essenciais para a integração das reações do metabolismo oxidativo. Essa interpretação não explica, entretanto, o fato de que as formas de vida livre de S. mansoni realizem o metabolismo aeróbico sem maiores impedimentos.

Com relação ao metabolismo oxidativo de células que exibem metabolismo anaeróbico facultativo, como por exemplo as leveduras, um teste que usualmente se aplica para verificar a interligação entre as vias anaeróbica e aeróbica é o do ‘efeito Pasteur’. Esse efeito implica na diminuição do consumo de glicose pela glicólise quando o organismo é exposto ao oxigênio ou, inversamente, o aumento da glicólise ao se retirar o oxigênio.

Nenhum efeito Pasteur foi detectado em experimentos in vitro, nos quais vermes adultos de S. mansoni foram incubados por 12 dias em meio de cultura (Schiller et al., 1975). Em experimentos subseqüentes (Bueding & Fisher, 1982), foi medida a utilização de carboidrato, a formação de ácido lático e níveis de ATP em condições aeróbicas e anaeróbicas, novamente não se constatando o efeito Pasteur. Com a finalidade de confirmar esses resultados utilizando-se outras abordagens, e incluindo nos experimentos esquistossômulos, Thompson et al. (1984) investigaram o efeito de cianeto na produção de CO pelos organismos. Somente os 2

organismos recém-transformados eram sensíveis ao cianeto, porém após 24 horas a produção de CO diminuiu em cerca de 77%, ao 2 mesmo tempo em que a produção de lactato aumentou em cerca de 84%. Nesse trabalho, os parasitos adultos exibiram uma baixa produção de CO , reduzida na presença de cianeto. Os autores 2

concluíram, pois, que não havia um efeito Pasteur significativo nos vermes adultos. No entanto, experimentos cuidadosos realizados com um meio de cultura mais rico mostraram que o efeito Pasteur poderia estar presente em vermes adultos, porém não seria tão facilmente detectável. Tal conclusão baseou-se na produção de CO 2 pelos parasitos, que em condições aeróbicas geraria pelo menos um terço da energia metabólica por intermédio do metabolismo oxidativo (Van Hellemond, Van Remoortere & Tielens, 1985). Essa pequena fração do metabolismo energético dependente do metabolismo aeróbico seria suficiente para, juntamente com a glicólise, contribuir com uma produção substancial de ATP, dada a maior eficiência da fosforilação oxidativa. Um outro ponto importante ressaltado nesse trabalho foi o de que, nos trabalhos anteriores, o efeito Pasteur poderia ter sido mascarado pela ocorrência simultânea de glicogenólise.

Cumulativamente, os trabalhos originais sobre o metabolismo oxidativo em vermes adultos de S. mansoni indicam que, em condições aeróbicas, o ciclo de Krebs poderia estar operando, porém não de forma plena. É relevante mencionar que, em S. mansoni, parece haver não uma alternância propriamente dita entre os tipos de metabolismo encontrados, mas sim uma predominância de um sobre o outro. Um exemplo em pauta são os esporocistos, que correspondem ao estágio subseqüente aos miracídeos (que exibem metabolismo oxidativo) e que parecem ser anaeróbios facultativos (Tielens et al., 1992), respondendo às condições de incubação por meio de uma mudança gradual para a via de glicólise anaeróbica. Essa flexibilidade é importante, uma vez que se sabe que, no caramujo B. glabrata, condições anaeróbicas podem, ocasionalmente, prevalecer.

Os experimentos realizados com esporocistos também mostraram que, em anaerobiose, ocorre a formação de succinato, pela reação catalisada pela enzima fosfoenol piruvato-carboxiquinase. Nesse ciclo de reações, fosfoenolpiruvato é carboxilado, formando oxaloacetato. O oxaloacetato é então reduzido a malato, que por seu turno é transportado para dentro das mitocôndrias e reduzido a succinato, via fumarato. Essas reações exemplificam bem a coexistência de reações da via anaeróbica com aquelas da via do ácido cítrico. A propósito da produção de succinato pela redução de fumarato, mostrou-se que esporocistos contêm quantidades substanciais de rodoquinona. Essa quinona modificada, essencial para a redução do fumarato, é sintetizada ‘de novo’ pelos parasitos Van Hellemond, Van Remoortere & Tielens, 1997).

Para entrar no ciclo do ácido cítrico, o ácido pirúvico formado na via da glicólise anaeróbica reage com a coenzima A e NADH formando acetil CoA, uma reação catalisada pela piruvato-desidrogenase. Na verdade, a enzima piruvato-desidrogenase representa um complexo multienzimático contendo as enzimas diidrolipoil transacetilase e diidrolipoil-desidrogenase, que nos eucariotos realizam as cinco reações envolvidas na formação de acetil CoA. Acetil CoA é o substrato inicial das reações do ciclo de Krebs. Rigorosamente, a reação que forma esse composto, embora ocorra nas mitocôndrias, é considerada parte da via glicolítica. Apesar de não haver dados recentes sobre a atividade enzimática da piruvato-desidrogenase de S. mansoni, existem vários ESTs representados no banco de dados do transcriptoma (Verjovski-Almeida et al., 2003), o que faz supor que esta enzima esteja ativa nos vermes adultos. Não obstante, a descarboxilação do piruvato pelo complexo da piruvato-desidrogenase consiste numa reação irreversível e, desse modo, pressupõe que existam mecanismos finos de regulação, uma vez que essa etapa faz com que o piruvato, sob a forma de acetil CoA, entre no ciclo de Krebs e não esteja disponível para a formação de lactato. Tal regulação fica implícita também porque não existem outras vias de formação de acetil CoA nas células eucariotas. Canonicamente, o controle da piruvato-desidrogenase se dá ou por inibição pelo produto (acúmulo de NADH e acetil-CoA) ou por modificação covalente mediada por fosforilação/desfosforilação catalisada por quinases e fosfatases, respectivamente, que atuam sobre a enzima diidrolipoil transacetilase. Não se sabe, entretanto, se em S. mansoni este complexo atua sobre a piruvato-desidrogenase.

De forma geral, o ciclo do ácido cítrico é regulado pela disponibilidade de substratos, com inibição por produtos e outros intermediários de vias metabólicas que compartilham substratos. Nesse contexto, além de acetil CoA, já mencionado anteriormente, o oxaloacetato, juntamente com NADH, exercem classicamente importante papel na regulação do ciclo. Desse modo, seria necessário estabelecer se, em S. mansoni, vias alternativas de síntese de oxaloacetato, como por exemplo reações de transaminação, estariam ativas. Experimentos in vitro mostraram que, quando vermes adultos foram incubados em meio salino contendo glicose 6-14C, bicarbonato e glutamato, há uma redução dramática na produção de CO , concomitante com um aumento na 2 produção de alanina radioativa (Van Oordt et al., 1985). Tais resultados implicam presença de atividade de glutamato transaminase. No entanto, em S. mansoni existem poucos dados sobre a formação de oxaloacetato por meio de transaminação (Goldberg, Flescher & Lengy, 1979).

Sabe-se que as enzimas do ciclo de Krebs também sofrem regulação alostérica por ADP, ATP e Ca 2+, mas tais estudos ainda não foram realizados em S. mansoni.

Dentre as enzimas que constituem o ciclo de Krebs, somente a aconitase, que catalisa a formação de isocitrato, e a fumarase, que catalisa a formação de L-malato, não possuem dados funcionais na literatura e tampouco têm representatividade (hits) no banco de dados do transcriptoma de S. mansoni. A atividade da enzima succinato-desidrogenase já foi medida em S. mansoni e S. japonicum, sendo que em ambas as espécies a atividade foi baixa (Smith & Brown, 1977). Igualmente, a atividade da malato-desidrogenase já foi medida em extratos de S. mansoni, sendo que, com exceção de uma publicação (Rotmans, 1978), os demais resultados sobre essa enzima concentraram-se na pesquisa de suas isoformas (Sene et al., 1997; Navarro, Cesari & Incani, 1992). Padrões de isoenzimas também foram relatados para a isocitrato-desidrogenase de S. mansoni (Conde Del Pino et al., 1968). Como o ciclo do ácido cítrico é essencialmente anfibólico, isto é, realiza simultaneamente catabolismo e anabolismo, seria necessário obter informações sobre as vias metabólicas de S. mansoni que compartilham substratos, tais como a via da gliconeogênese (que utiliza oxaloacetato), síntese de lipídeos e de colesterol (que requer acetil CoA), síntese de aminoácidos (que utiliza o alfacetoglutarato para sintetizar glutamato, bem como oxaloacetato e alanina numa reação de transaminação para produzir aspartato e piruvato) e a via de síntese de porfirinas, que utiliza o succinil CoA como precursor. Contudo, essas informações não estão disponíveis na literatura médica, o que torna essencialmente especulativo o conhecimento atual sobre a integração do metabolismo oxidativo de S. mansoni.

Outras reações anapleróticas, ou seja, que suprem intermediários para o ciclo do ácido cítrico, também podem afetar o fluxo desta via metabólica. Por exemplo, a síntese de oxaloacetato a partir da carboxilação do piruvato poderia constituir potencialmente uma importante etapa reguladora do ciclo, fornecendo um dos substratos para a formação de citrato. De fato, sabe-se que a enzima piruvato-carboxilase exibe uma atividade substancial em vermes adultos de S. mansoni (menor que a atividade em fígado de rato e maior que no músculo esquelético de rato) (Tielens et al., 1991). A piruvato-carboxilase também está representada no banco de dados do transcriptoma de S. mansoni, mas, no entanto, não há informações sobre a integração dessa enzima no ciclo de Krebs mediante um possível efeito na biossíntese de oxaloacetato e, em conseqüência, se o nível de síntese de oxaloacetato seria suficiente para afetar o ciclo de Krebs.