7 – Genômica e Biologia Molecular de Schistosoma mansoni Guilherme Correa de Oliveira Frederico G. C. Abath e Gloria Regina Franco

7 - Genômica e Biologia Molecular de

Schistosoma mansoni

 

Guilherme Correa de Oliveira; Frederico G. C. Abath; Gloria Regina Franco

 

O estudo estrutural do genoma do Schistosoma mansoni possibilitou

o seqüenciamento parcial do genoma nuclear desta espécie. A

disponibilidade da seqüência genômica permitiu a realização de

novas abordagens, para o estudo funcional do organismo. Dentre as

novas possibilidades estão o transcriptoma e o proteoma. Agora, uma nova fronteira é aberta, o entendimento da fisiologia do parasito

do ponto de vista sistêmico. Para este fim, análises computacionais

e experimentais, a partir da integração da informação estrutural e

funcional, possibilitarão o estudo global da biologia do sistema.

Desde meados da década de 1980 o estudo da biologia

molecular do Schistosoma mansoni possibilitou a

caracterização de um grande número de funções biológicas e

moléculas do organismo. Publicaram-se, até hoje, mais de

1.100 trabalhos sobre o assunto. Recentemente, com a era

genômica e o seqüenciamento do genoma do parasito, assim

como grandes volumes de cDNAs, as abordagens para o

estudo molecular terão principalmente uma visão global dos

problemas com o uso de metodologias como o estudo do

transcriptoma e do proteoma. Espera-se como resultado destes

trabalhos que sejam identificados novos alvos para o

desenvolvimento de vacinas e drogas para combater a

esquistossomose, além de um profundo entendimento de

fenômenos biológicos do S. mansoni.

Este capítulo relata os principais avanços no estudo molecular

do parasito. Inicialmente, com o trabalho tendo por foco as

moléculas individuais e mais recentemente, em larga escala. O

desenvolvimento científico e tecnológico nesta área é muito

rápido, mas pretende-se demonstrar abordagens que serão

ainda utilizadas por vários anos.

 

O genoma de Schistosoma mansoni

O tamanho do genoma de S. mansoni é de aproximadamente 2, 7 x 10 8 pares de base (pb), sendo o conteúdo de guaninas e citosinas (G e C) de aproximadamente 29, 4% (Simpson, Sher & McCutchan, 1982; Marx et al., 2000). Este tamanho é de aproximadamente três vezes o de Caenorhabditis elegans, duas vezes o de Drosophila melanogaster e um décimo do humano. O DNA do parasito não é metilado (Fantappie et al., 2001b). Entre 4% e 8% é composto de DNA altamente repetitivo e 40% de DNA moderadamente repetitivo (Simpson, Sher & McCutchan, 1982). O cariótipo de S. mansoni é composto de oito pares de cromossomos (Short & Menzel, 1979), sendo a fêmea heterogamética, com um par sexual heterólogo W. e Z (Grossman et al., 1980). O final dos cromossomos contém os telômeros que são repetições da seqüência TTAGGG em humanos e vertebrados (Moyzis et al., 1988; Meyne et al., 1989). Os telômeros foram identificados por técnicas de hibridação em relação a todos os cromossômicos metafásicos do parasito e provavelmente possuem a mesma seqüência que os telômeros humanos (Hirai & LoVerde, 1996).

O cariótipo da espécie é organizado por ordem de tamanho dos cromossomos. Os cromossomos 1, 2, 3, 4 e 5 têm centrômeros subterminais e os cromossomos 6 e 7 apresentam centrômeros submetacêntricos. O cromossomo 8 é metacêntrico. O cromossomo

4 tem um satélite no braço curto (Short & Menzel, 1979). Na Figura

1 verifica-se uma representação dos cromossomos de S. mansoni.

Figura 1 – Cariótipo de Schistosoma mansoni. Mapa físico de clones

de YAC e BACs. As barras em vermelho indicam os clones YAC mapeados. As indicações em azul são: (A), DNA ribosomal (van

Keulen et al., 1985); (B), gene p48 (Chen et al., 1992); (C), gene p14

(Hirai et al., 1993); (D), clone de BAC (Jeremias et al., não

publicado); e (E), elemento pW1 (Hirai et al., 1993). Em linhas

verdes estão mostradas as posições aproximadas de clones de BAC

localizados por Les Paslier et al. (2000)

 

Fonte: adaptada de Tanaka et al. (1995) e Les Paslier et al. (2000).

Um aspecto importante do entendimento da expressão dos genes presentes no genoma do parasito está relacionado à estrutura física dos cromossomos (Davie & Spencer, 1999). Alguns trabalhos já identificaram proteínas que participam deste processo, como as proteínas high mobility group, ou HMG, envolvidas no estabelecimento da arquitetura dos cromossomos (Rabelo et al., 1992; Fantappie & Rumjanek, 1994; Grasser, 2003). Uma outra proteína descrita que acetila histonas influencia na regulação da estrutura da cromatina (Roth, Denu & Allis, 2001). Uma acetiltransferase funcional de S. mansoni denominada GCN5 foi clonada, abrindo uma importante e ainda pouco explorada área de pesquisa sobre esta espécie (De Moraes et al., 2004).

Como mencionado anteriormente, o genoma de S. mansoni é rico em elementos repetitivos. Muitos destes elementos são também móveis, isto é, podem se deslocar no genoma. Dentre os elementos repetitivos, um dos mais conhecidos é o complexo de genes codificantes para o RNA ribosomal, repetido aproximadamente cem vezes por genoma haplóide (Simpson et al., 1984a). Cada unidade tem aproximadamente 10.000 pb que codificam para três subunidades altamente conservadas, separadas por segmentos não transcritos denominados espaçadores (van Keulen et al., 1985; Walker et al., 1989; van Keulen et al., 1991). Variações nesta unidade repetitiva têm sido utilizadas para estudos de filogenia entre as diferentes espécies de Schistosoma (Lockyer et al., 2003). Um outro elemento contendo uma repetição de 62 pb foi observado em vários transcritos do parasito e, quando utilizado como sonda, foi capaz de se hibridar com vários fragmentos do genoma, mostrando sua ampla distribuição (Spotila, Rekosh & LoVerde, 1991). Este elemento repetitivo também está presente no genoma mitocondrial, possível resultado de uma transferência do núcleo (Pena et al., 1995). Vários outros elementos repetitivos já foram identificados. Entre estes elementos, um é aparentemente traduzido em proteínas que demonstram reatividade imunológica cruzada (Smith, Huggins & Havercroft, 1992) e outro, de 121 pb, o que representa aproximadamente 12% do genoma, já foi utilizado para a detecção de infecção em moluscos e amostras humanas por métodos de hibridação (Hamburger et al., 1991, 1992; Pontes, Dias-Neto & Rabello, 2002).

Elementos móveis são outros tipos de segmentos altamente repetitivos de DNA. Existem duas categorias principais de elementos móveis: classe I, que se transporta por um intermediário de RNA; e classe II, que se transporta diretamente, sem intermediários (Brindley et al., 2003). Os elementos classe I incluem retrotransposons com longas repetições terminais (LTR) e retrovírus e retrotransposons sem LTR (non- LTR) e pequenos elementos nucleares genômicos (Sine). Os retrotransposons com LTR codificam para os genes gag cujo produto se liga a DNA, transcriptase reversa, RNase H e integrase. Os retrotransposons non-LTR, dos quais fazem parte os Line (elementos longos), são de uma linhagem extremamente antiga. Os elementos non-LTR codificam para uma proteína gag-like e uma transcriptase reversa com atividade de nuclease. Os elementos Sine são pequenos e não autônomos, necessitando de proteínas como a transcriptase reversa codificada por outra fonte. Os elementos classe II são chamados de transposons. Os transposons se movem por processos autônomos mediados pela enzima transposase. Podem também se mover horizontalmente entre espécies.

Em S. mansoni já foram identificados um elemento tipo Sine (Sma) (Spotila et al., 1989), o SR1 do tipo non-LTR ainda não totalmente caracterizado (Drew & Brindley, 1997) e SR2, um tipo RTE-1-like non- LTR (Malik & Eickbush, 1998; Drew et al., 1999). Gulliver, um retrotransposon LTR originalmente identificado em S. japonicum, está provavelmente presente no genoma de S. mansoni (Laha et al., 2001). Boudicca, um retrotransposon LTR da família gypsy/Ty3, foi o primeiro do tipo a ser identificado em S mansoni e está presente em um grande número de cópias no genoma (Copeland et al., 2003). Recentemente, três outros retrotransposons LTRs foram descritos e denominados Saci-1 (membro da família BEL), Saci-2 e Saci-3 (ambos da família Gypsy/Ty3, sendo Saci-3 similar a Boudicca de S. japonicum) (Copeland et al., 2003). Além desses, Perere, um non-LTR retrotransposon membro da família CR1, foi identificado a partir do estudo do transcriptoma de S. mansoni e corresponde a uma grande porcentagem do total de mRNAs de vários estágios (DeMarco et al., 2004). É também interessante notar que o elemento Sma contém em sua estrutura um domínio catalítico de RNA funcional conhecido como hammerhead (Ferbeyre, Smith &

Cedergren, 1998; Vazquez-Tello et al., 2002). Na Figura 2 é demonstrada uma representação da organização dos elementos genéticos móveis já descritos para S. mansoni.

Figura 2 – Representação gráfica dos elementos genéticos móveis

encontrados em S. mansoni. A – Sma: A/B em verde indica o

promotor da RNA-polimerase III, HH indica o domínio similar ao da

ribozima Hammerhead e, ao final, 3’ indica a cauda rica em A. B –

SR1: em branco estão representadas as regiões ainda não

caracterizadas, em verde está representado o gene pol, em azul e

vermelho estão representadas as seqüências terminais e em

amarelo a região com os domínios conservados da transcriptase reversa. SR2: em vermelho está a região 3’ não traduzida, em roxo

uma pequena região traduzida (ORF 1), seguida da ORF do gene

pol, em verde os genes da endonuclease (ENDO) e da transcriptase

reversa (RT) e em marrom a região repetitiva final. Saci-1 e Saci-2

têm o gene gag codificado na mesma ORF que pol e Saci-3 tem uma terceira ORF indicada em verde, cujo produto é desconhecido.

C – Gulliver: em amarelo são mostrados os terminais LTR, em azul

o gene gag e em vermelho a poliproteína e os domínios protease

(PR), transcriptase reversa (RT), RNase H (RH) e integrase (IN).

Boudicca tem a composição de genes similar a Gulliver, com a

exceção de uma possível proteína do envelope (env), em verde. Perere possui duas regiões não traduzidas, a 5’ e 3’ em amarelo, e

uma ORF que codifica para uma endonuclease (ENDO) e uma

transcriptase reversa (RT)

Fonte: construída com base em Spotila et al. (1989), Laha et al.

(2001), Brindley et al. (2003), Copeland et al. (2003) e DeMarco et

al. (2004).

Um importante aspecto do estudo genômico de S. mansoni é o mapeamento físico de grandes fragmentos clonados. Um mapa físico é importante para a localização de genes de interesse e também como ferramenta auxiliar na montagem da seqüência genômica. Para este fim é necessário que se utilizem clones em bibliotecas de grandes insertos. Uma das bibliotecas foi construída em cromossomos artificiais de levedura (YACs) (Tanaka et al., 1995) e duas outras em cromossomos artificiais de bactérias (Le Paslier et al., 2000; El Sayed et al., 2004). Na biblioteca em YACs e em uma das bibliotecas de BACs foram já utilizadas o mapeamento físico de clones (Tanaka et al., 1995; Le Paslier et al., 2000). O mapeamento físico é realizado com a hibridação de fragmentos marcados diretamente ou indiretamente com um fluorocromo como a fluoresceína, uma técnica conhecida como fluorescent in situ hybridization ou Fish (Hirai & LoVerde, 1995). Além do mapeamento de clones, a metodologia de Fish foi utilizada para a localização dos telômeros nos cromossomos de S. mansoni, que se apresentaram na forma típica nos finais dos oito cromossomos (Hirai & LoVerde, 1996). Um resumo do mapeamento realizado até o momento com a

biblioteca da YAC e BAC é demonstrado anteriormente na Figura 1. Uma técnica de mapeamento físico alternativa é o primed in situ labelling ou Prins (Hirai, 2001).

O seqüenciamento e a montagem das seqüências genômicas de S. mansoni está acontecendo atualmente (Oliveira et al., 2004b). Para a obtenção do genoma completo desta espécie foi feito o uso de duas bibliotecas de grandes insertos em um vetor BAC (Le Paslier et al., 2000; El-Sayed et al., 2004). A primeira etapa consistiu na geração de um grande número de seqüências dos finais dos clones dos BACs. No total foram geradas 32 mil seqüências pelo Tigr

(www.tigr.org/tdb/e2k1/sma1/endseq_status.shtml) e 14.500 pelo Genoscope (Oliveira et al., 2004a). Estas seqüências auxiliam na descoberta de novos genes (veja Transcriptoma, adiante) e também possibilitam a construção de um mapa de alta resolução em uma estratégia em que o mapa é feito em paralelo ao seqüenciamento genômico. As seqüências podem ser encontradas na divisão dbGSS

do GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/dbGSS/index.html). Em seguida foi iniciado o trabalho de seqüenciamento de BACs se utilizando uma estratégia denominada whole genome shotgun (Venter et al., 1996). Duas instituições foram envolvidas neste processo, o Tigr

(www.tigr.org/tdb/e2k1/sma1/) e o Sanger Centre

(www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/). A estratégia está descrita

na Figura 3. Com as duas estratégias foi gerada uma cobertura de 7, 5 vezes o genoma do parasito. Após a montagem das seqüências, espera-se que sejam obtidas seqüências de consenso de grande extensão, mas que ainda existam furos ou gaps no genoma de S. mansoni.

O genoma mitocondrial de S. mansoni também já foi seqüenciado (Le, Blair & McManus, 2000, 2002). A estrutura do genoma e a

ordem dos genes são demonstradas na Figura 4. O genoma mitocondrial contém uma região não codificante de tamanho variável bastante útil em estudos filogenéticos (Despres, Imbert-Establet, 1993; Lockyer et al., 2003) e também já foi utilizada com alvo para a detecção de infecção por PCR em caramujos (Jannotti-Passos et al., 1997). Todos os genes do genoma mitocondrial são transcritos de uma mesma fita. Apesar de a composição de genes ser a usual, a sua seqüência mostra diferenças consideráveis em comparação a outras espécies. Uma única exceção é que o gene atp8 não foi encontrado em nenhuma das espécies de Schistosoma.

Figura 3 – Estratégia utilizada para o seqüenciamento do genoma

de S. mansoni. A – inicialmente o DNA do parasito é extraído e

selecionado por tamanho. B – em seguida o DNA purificado é

clonado em vetores do tipo BAC. C – Os clones são seqüenciados

individualmente; centenas de milhares de reações de

seqüenciamento são necessárias. D – As seqüências são avaliadas

para definir: qualidade, presença do vetor de clonagem e

contaminantes. Em seguida, as seqüências individuais são

montadas e uma seqüência de consenso é obtida

 

Fonte: foto cedida por Wander Jeremias.

Figura 4 – Estrutura do genoma mitocondrial de Schistosoma

mansoni. O tamanho total do genoma mitocondrial é de

aproximadamente 14 mil pb. Os genes indicados por caixas azuis

são: cox1, 2 e 3, subunidades da citocromo C oxidase; cob,

citocromo b; nad 1, 2, 3, 4, 4L e 5, subunidades da NADH

desidrogenase; rrn L e S, subunidades do RNA ribosomal grande e

pequena. A caixa amarela com a seta indica os genes codificantes

para os RNAs transportadores e as letras indicam os aminoácidos

transportados: E, ácido glutâmico; H, histidina; Q, glutamina; K,

lisina; D, ácido aspártico; P, prolina; V, valina; M, metionina; W,

triptofano; S1, serina (AGN); T, treonina; C, cisteína; Y, tirosina; L , 1

leucina (CUN); S , serina (UCN); N, asparagina; I, isoleucina; F, 2

fenilalanina; A, alanina; L , leucina (UUN); R, arginina; G, glicina. A 2

caixa vermelha com a seta indica a região não codificante, de

tamanho variável

 

Fonte: adaptada de Le et al. (2000).

 

Transcriptoma

Atualmente existem mais de oito mil UniGenes de S. mansoni cujas seqüências parciais ou totais estão depositadas em bancos de

dados de domínio público (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/). Entretanto, o número de proteínas hoje depositadas é de somente 1.243. Estas desempenham diversas funções, sendo elas proteínas estruturais, enzimas, proteínas de transporte, canais, receptores, proteínas armazenadoras, proteínas constituintes de vias sinalizadoras, proteínas regulatórias citoplasmáticas ou nucleares, proteínas envolvidas nos processos de tradução, antígenos e outras de função diversa. A evolução do conhecimento acerca do genoma expresso de S. mansoni foi, sem dúvida, bastante rápida nos últimos vinte anos, impulsionada decerto pela necessidade de descoberta de novos alvos para a produção de drogas anti-esquistossomóticas, ou mesmo para a produção de uma vacina eficaz. Informações valiosas e definitivas já foram geradas desde que os primeiros genes foram clonados. No entanto, para um organismo para o qual se estima a existência de cerca de 15 mil genes expressos (Verjovski-Almeida et al., 2003), o número atual de proteínas com seqüência depositada em bancos de dados ainda é muito modesto. É certo que muito ainda permanece por ser entendido, principalmente no que diz respeito a processos regulatórios que levam à ativação ou repressão de genes durante as fases do ciclo de vida e da organização geral ou específica de certas partes do genoma. Torna-se assim óbvio que o desenvolvimento de um projeto de seqüenciamento de transcritos em larga escala para a identificação de novos genes, assim como para o estudo da organização destes genes e sua localização em cromossomos, levaria a um avanço rápido do conhecimento da biologia do parasito e forneceria novos subsídios para o desenvolvimento de vacinas ou drogas que agiriam em sítios vitais para a sobrevivência do verme dentro do hospedeiro.

Com essa idéia em mente foi criado, em 1992, um programa de descoberta gênica em S. mansoni, baseado na produção de seqüências parciais de transcritos. Esta se constituiu em uma iniciativa conjunta de três laboratórios: dois do Brasil (UFMG e Centro de Pesquisa René Rachou/Fiocruz, ambos em Belo Horizonte) e um dos Estados Unidos (The Institute for Genomic Research – Tigr, Rockville, MD). Para o seqüenciamento de toda a porção expressa do genoma de S. mansoni seria necessário adotar uma técnica que fosse ao mesmo tempo eficiente e rápida. A estratégia básica utilizada envolveu o seqüenciamento, em um único passo, de clones de cDNA selecionados aleatoriamente de

bibliotecas (Figura 5). O seqüenciamento do cDNA pode ser total (full-length) e realizado em vários passos ou em único passo, que resulta em seqüências parciais, mas com tamanho suficiente para conter a informação necessária à identificação do gene por intermédio de pesquisa de homologia com seqüências depositadas em bancos de dados. Para tanto, utilizam-se programas do pacote de softwares Blast (Altschul et al., 1997). É comum, atualmente, para a comunidade científica, verificar alinhamentos comparativos entre a seqüência- pergunta e as seqüências depositadas em bancos de dados de nucleotídeos ou proteínas. O processo em único passo tem sido largamente utilizado por diferentes grupos de pesquisa e consiste em corrida eletroforética única dos produtos de seqüenciamento, que fornece uma leitura em torno de 500 nt ou mais de DNA. Esta seqüência foi denominada etiqueta de seqüência expressa (EST), pelo grupo pioneiro do Dr. J. Craig Venter (Adams et al., 1991). As ESTs são geradas a partir da extremidade inicial ou final do cDNA, pois para a obtenção da seqüência são utilizados iniciadores que se anelam no vetor. Assim, as ESTs são produzidas por meio de uma metodologia extremamente simples, de custo moderado, sendo portanto acessível a pequenos laboratórios. As etiquetas podem servir também na construção de mapas físicos, na caracterização de grandes seqüências genômicas, na identificação de genes em genomas e em tecnologias aplicadas à indústria farmacêutica (Zweiger & Scott, 1997). Quando o projeto transcriptoma de S. mansoni teve início, menos de cem genes do parasito haviam sido completamente ou parcialmente seqüenciados e depositados em bancos de dados (Franco, 2000; Franco et al., 2004).

Figura 5 – Geração de ESTs, etiquetas de seqüências expressas.

Para a produção de ESTs, o RNA mensageiro (mRNA) é extraído do

material de interesse e a retrotranscrição é realizada, geralmente a

partir de um iniciador oligo-d(T) que se liga à cauda poli-A da

molécula. Após a síntese da segunda fita e clonagem em

plasmídeo, clones individuais são selecionados. As regiões

extremas, 5’ e 3’ do DNA clonado são seqüenciadas gerando

etiquetas do transcrito (ESTs)

 

Para o projeto de descoberta gênica em S. mansoni foi construída, inicialmente, uma biblioteca de cDNA de verme adulto para a obtenção de ESTs. Após seqüenciamento intensivo e análise por pesquisas de homologia, as primeiras 607 ESTs foram produzidas. Estas ESTs corresponderam a 169 genes distintos do parasito, 154 dos quais nunca antes haviam sido seqüenciados em S. mansoni (Franco et al., 1995). No entanto, os primeiros dados de seqüências geradas no programa foram provenientes de apenas uma biblioteca de cDNA de vermes adultos. Porém, com o seqüenciamento de clones de cDNA de apenas uma fonte, se torna quase impossível se cobrir a totalidade de genes expressos em um organismo, dado que os tipos de transcritos variam de acordo com o tecido, fase do desenvolvimento e diferentes estados metabólicos (Bishop, 1974). Transcritos de genes housekeeping, ou aqueles que codificam para proteínas com funções básicas em células especializadas, por exemplo, são expressos em maiores quantidades e são mais estáveis do que transcritos que codificam para proteínas regulatórias. Tornou-se assim necessário, para o sucesso na identificação da totalidade dos genes expressos, a construção de bibliotecas de cDNA provenientes de diferentes fases do desenvolvimento de S. mansoni. Desde 1993, por determinação da Organização Mundial da Saúde (OMS), o estudo da genômica do parasito tornou-se a única forma de se obter informação que pudesse ser revertida em novas ferramentas de controle da doença (El Sayed et al., 2004; Oliveira et al., 2004a). Assim, o programa de descoberta gênica em S. mansoni foi parcialmente financiado pela WHO/TDR no período de 1994 a 2000 e os laboratórios participantes da Schistosoma Genome Network, juntamente com outros grupos, geraram cerca de 16.815 ESTs (dbEST 22 de agosto de 2003). Estas seqüências foram obtidas de bibliotecas constituídas de transcritos expressos nas várias fases do ciclo de vida do parasito.

Como o processo de produção das ESTs trata-se de um seqüenciamento em único passo, é comum observar um grande número de erros de seqüenciamento, além do tamanho pequeno das seqüências e ainda alta redundância nos dados, visto que os clones de cDNA são aleatoriamente escolhidos de uma biblioteca (Miller et al., 1999; Liang et al., 2000). Na tentativa de superar estes problemas e ainda de fornecer uma visão mais detalhada dos números e tipos de genes selecionados, é comum a utilização de

procedimentos de agrupamentos de seqüências (Figura 6) (Oliveira & Johnston, 2001). O agrupamento das quase 17 mil seqüências, utilizando o programa Cap3, revelou que as ESTs obtidas correspondiam a 6.328 seqüências transcritas diferentes de S. mansoni, das quais cerca de 70% não puderam ser identificadas com pesquisa de homologias em bancos de dados de DNA, proteínas ou domínios protéicos (Franco, 2004).

Além da produção das ESTs a partir de bibliotecas de cDNA, foi iniciada também a análise do padrão de expressão gênica diferencial, por Differential Display (Liang & Pardee, 1992). Com esta técnica, fragmentos de DNA obtidos da amplificação com iniciadores aleatórios de cDNAs dos vários estágios do ciclo de vida do S. mansoni são submetidos à separação eletroforética. Os perfis de amplificação são comparados nas várias situações e os fragmentos de DNA considerados estágio ou sexo- específicos são clonados em plasmídeos e utilizados na geração de ESTs. Esta nova técnica de análise da expressão gênica está sendo utilizada em laboratórios no Brasil, onde já se identificaram genes candidatos diferencialmente expressos em ovos, miracídios, esquistossômulos e machos e fêmeas adultos (Franco et al., 2000).

Figura 6 – Agrupamento de transcritos. Seqüências individuais de

um projeto com redundância, como a produção em larga escala de

ESTs, são agrupadas para formarem contigs que devem

representar, cada um, um transcrito individual. Os contigs

representam, portanto, um conjunto de ESTs. ESTs que não se agrupam são denominadas singlets. Cada contig e singlet deve

representar um único transcrito, ou partes não sobrepostas de um

mesmo transcrito

 

Em 2001 foram iniciados no Brasil dois programas de seqüenciamento, em larga escala, do transcriptoma de S. mansoni:

projeto financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), visando gerar 120 mil Orestes e ESTs clássicas de várias fases do ciclo de vida do parasito;

projeto financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), visando gerar cem mil ESTs e seqüências de quinhentos cDNAs completos.

Pelo programa Fapesp foram obtidas 179.092 Orestes e ESTs dos estágios de esquistossômulos, esporocistos, cercárias, adultos, ovos e miracídios. Um total de 124.640 Orestes foram agrupadas em aproximadamente 31 mil seqüências únicas (SmAEs), sendo que, em média, 55% das SmAEs não puderam ser identificadas por homologia com seqüências de bancos de dados. Os pesquisadores de São Paulo estimam que tenham sido descobertos em torno de 14 mil genes do parasito, o que corresponderia a 92% do seu genoma expresso (Verjovski-Almeida et al., 2003, 2004). Com relação à Rede Genoma de Minas Gerais de seqüenciamento, foram geradas 58.205 ESTs a partir de bibliotecas de vermes adultos, ovos e cercárias. Das 58.205 ESTs geradas, 18.379 puderam ser identificadas com base em homologia com proteínas depositadas na base de dados secundária de proteínas eucariotas (KOGs). O restante das seqüências corresponderam a genes homólogos aos de S. mansoni, a outras espécies de Schistosoma ou a outros trematódeos ou ainda não apresentaram qualquer homologia com seqüências conhecidas e depositadas em bancos de dados públicos. As cerca de 18 mil ESTs identificadas corresponderam a genes com as mais diversas funções no organismo, sendo a maioria deles (genes representados por mais de 2.500 ESTs) pertencentes às categorias de tradução, estrutura e biogênese de ribossomos; citoesqueleto; modificações pós-traducionais, turn-over de proteínas, chaperones e transporte e metabolismo de carboidratos. Alguns clones de cDNA, contendo a região codificadora completa, foram escolhidos para seqüenciamento direcionado. A estratégia aplicada permitiu selecionar 3.782 clones, os quais representam 487 proteínas completas diferentes (Franco et al., 2004). Torna-se, assim, de grande interesse para a comunidade científica que pesquisa a esquistossomose conhecer mais profundamente a função de cada um daqueles genes e, em especial, os sem similaridade com quaisquer seqüências conhecidas em outros organismos.

A liberação da seqüência genômica será de grande utilidade, pois permitirá checar a acurácia dos dados de descoberta gênica produzidos em projetos de transcriptoma. Por outro lado, os genes transcritos já descobertos podem auxiliar em uma anotação mais precisa do genoma, pois podem ser prontamente localizados na seqüência genômica em se utilizando ferramentas de bioinformática (Franco, 2004).

 

Ferramentas moleculares para o estudo da

função de genes de Schistosoma

Com o avanço no seqüenciamento de genes de diferentes organismos, tornam-se necessários estudos funcionais que possibilitem a descoberta do papel biológico das proteínas codificadas por estes genes. Os dados de seqüências de DNA, embora forneçam a informação necessária para o conhecimento dos genes, são, na maioria dos casos, insuficientes para o entendimento da função biológica das proteínas codificadas por estes genes ou para o entendimento da relação dessas proteínas com outras moléculas na célula (Reeves, 2002). Um completo entendimento do funcionamento de uma proteína requer informações em vários níveis: sua estrutura, modificações pós-traducionais, atividade bioquímica, interações com outras proteínas e seu papel celular.

A determinação da função gênica é um dos maiores interesses dos grupos envolvidos em pesquisa genômica. A existência de uma janela aberta de leitura (ORF) nos dados genômicos não implica, necessariamente, a existência de um gene funcional (Pandey & Mann, 2000). Estudos de função gênica abrangem basicamente dois aspectos: função molecular e função biológica. Informações sobre a função molecular podem ser obtidas usando-se vários métodos, tais como: investigação da presença de domínios estruturais/funcionais conservados nas proteínas codificadas pelos genes, com recursos de poderosas ferramentas de bioinformática; modelagem molecular de proteínas por homologia com outras proteínas cujas estruturas já sejam conhecidas; e, finalmente, a caracterização da atividade bioquímica da proteína. Evidências sobre a função gênica na biologia do organismo podem ser obtidas mediante análises da expressão tecido, sexo-específica ou expressão temporal; e ainda pela destruição do gene e obtenção de linhagens knockout ou pela produção de transgênicos que superexpressem o gene, sendo então o fenótipo do mutante analisado para se verificar os prejuízos ao organismo.

Uma questão-chave sobre uma proteína, além de quando e onde ela é expressa, é com quais outras proteínas ela interage (Pandey & Mann, 2000). Como os processos biológicos são realizados com interações proteína-proteína, uma possível abordagem para se descobrir a função de um produto gênico desconhecido é identificar seu parceiro (Aronheim & Karin, 2000). Se a função de uma proteína é conhecida, então pode ser inferido que uma outra proteína que se ligue a ela tenha ação na mesma via ou participe do mesmo complexo que a primeira proteína (Eisenberg et al., 2000). Novas tecnologias foram desenvolvidas para tal fim, como o sistema do duplo híbrido em leveduras (Fields & Song, 1989), em células de mamíferos (Fearon et al., 1992) ou em bactérias (Joung, Ramm &

Pabo, 2000) e o ensaio de phage-display (Wolfe et al., 1999) (Figura

7). Interações feitas pela proteína, ou por um domínio da proteína, são uma parte essencial da sua função (Teichmann et al., 2001). Embora a identificação de apenas uma ou duas interações para uma proteína não caracterizada possa ser insuficiente para predizer sua função real, ela sugere uma atividade que pode ser testada experimentalmente (Tucker et al., 2001).

Figura 7 – Sistema de duplo-híbrido em levedura. Este sistema foi

desenvolvido para se detectar interações entre proteínas. A proteína

de interesse (isca) é expressa em fusão com o domínio da proteína

Gal4, que se liga à região promotora (GAL UAS) do gene repórter

LacZ da levedura. E a proteína presa (que possivelmente interage

com a isca) é expressa em fusão com o domínio de ativação da transcrição da proteína Gal4. Se ocorre a interação entre isca e

presa, ocorre a união dos domínios de ligação ao DNA e de ativação

transcricional da proteína Gal4, fazendo com que o gene repórter,

LacZ, seja expresso

 

Marcadores Polimórficos

Dois dos principais tipos de marcadores genéticos polimórficos são

microssatélites e polimorfismos de base única (SNPs, Figura 8). Os avanços na identificação e uso destes marcadores em S. mansoni serão abordados nesta seção. Microssatélites são curtas seqüências de DNA contendo de uma a seis bases, repetidas em tandem. Estes marcadores são diplóides, herdados de modo mendeliano, expressos de modo co-dominante e seletivamente neutros (Tautz & Renz, 1984; Weber & May, 1989; Ashley & Dow, 1994). Os microssatélites mostram um alto grau de polimorfismo gerado pela variação no número de repetições entre indivíduos (Schlotterer, 2000). Os polimorfismos têm uma distribuição por todo o genoma. Todas estas características fazem dos microssatélites excelentes marcadores para a tipagem de indivíduos, para estudos de populações e construção de mapas genéticos (Barker, 2002; Meloni, Biguet & Mallet, 2002; Gologan et al., 2005). A tipagem de microssatélites pode ser realizada facilmente em alelos bem definidos, com o uso da técnica de PCR (Ashley & Dow, 1994). A utilidade destes marcadores para o estudo de populações de S. mansoni já foi descrita e vários marcadores, desenvolvidos (Curtis & Minchella, 2000; Rodrigues et al., 2002a). A existência de projetos de seqüenciamento em larga escala do genoma e do transcriptoma desta espécie, além do uso de bibliotecas enriquecidas para microssatélites, foi essencial para o desenvolvimento de marcadores polimórficos (Rodrigues et al., 2002b; Oliveira et al., 2004b). Vários marcadores já foram desenvolvidos e utilizados no estudo de populações de parasitos em áreas endêmicas. Durant et al. (2000) observaram uma extensa variação dos parasitos em ratos infectados na ilha de Guadalupe. Esta população mostrou-se também estruturada de uma maneira sexo-específica. Como esperado, Blair, Davis & Wu (2001) mostraram uma maior diversidade desta espécie na África, em comparação com a América do Sul. No Brasil foi observada uma maior diversidade em isolados do campo, quando comparados com populações de laboratório (Rodrigues et al., 2002a).

Polimorfismos de base única ou SNPs representam uma fonte abundante de variação genética. SNPs são gerados pela substituição de uma única base nucleotídica ou pequenos eventos de inserção ou deleção (Indels), ocorrendo com uma taxa de mutação muito baixa, de aproximadamente 1x10-9 -9 a 5x10 eventos por nucleotídeo/ano, a maioria em posições neutras do genoma

humano (Martinez-Arias et al., 2001) (Figura 8). Em comparação a outros marcadores, a grande vantagem dos SNPs reside na abundância de polimorfismos entre alelos de um determinado gene e ampla distribuição, podendo estar presentes em, praticamente, todos os loci gênicos. No genoma humano, por exemplo, estima-se que existam aproximadamente dez milhões de SNPs (Lai, 2001), ocorrendo numa freqüência de 1 SNP a cada 500-1.000 pb (Sachidanandam et al., 2001). Já se sabe que os SNPs são marcadores dialélicos altamente estáveis, já que a probabilidade de alteração de duas bases independentes, presentes numa mesma posição, é pequena. SNPs são capazes de gerar haplótipos com descendência idêntica, o que permite a comparação estatística de haplótipos entre grupos de estudo e controles. Além disso, sua identificação é passível de automação em alta capacidade (Heaton et al., 2001).

Figura 8 – Microssatélites e polimorfismos de base única (SNPs). A

– Representação de três alelos de microssatélites contendo a

repetição cat 13, 18 ou nove vezes. B – Representação de SNPs

contendo dois alelos, G e C

 

A

Alelo cat(13)

catcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcat

Alelo cat(18)

catcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcat

Alelo cat(9)

catcatcatcatcatcatcatcatcat

B

 

SNP Alelo A

atcgatcagctagctaGctacgatcagctagctagc

SNP Alelo B

atcgatcagctagctaCctacgatcagctagctagc

 

SNPs podem ser encontrados tanto em regiões codificadoras como em regiões não codificadoras do genoma, como íntrons e regiões intergênicas (Wong et al., 2003). A presença de SNPs no genoma pode ter conseqüência para o modo como o genoma é expresso, podendo causar edição alternativa do mRNA, alterações no padrão de expressão de genes, geração ou supressão de códons de terminação ou poliadenilação na molécula de RNA mensageiro e alteração nos códons de iniciação de tradução (Wang et al., 2005). Mutações presentes em regiões codificadoras são classificadas em sinônimas ou não sinônimas. Mutações não sinônimas resultam em uma substituição de aminoácido codificado na seqüência protéica, podendo ser conservativas ou não conservativas em função das características dos aminoácidos envolvidos na troca. Nesses casos, a presença do polimorfismo pode levar a uma mudança estrutural da proteína codificada e, conseqüentemente, a uma possível alteração da sua função (Stitziel et al., 2004). Por outro lado, mutações do tipo sinônimas são aquelas as quais a presença do polimorfismo não causa alteração do aminoácido codificado.

Após estudos confirmatórios, SNPs podem ser usados para identificar genes associados a severidade de doenças e resistência a drogas, fenótipos de interesse e por análises de ligação (Sachidanandam et al., 2001). Além disso, SNPs também são úteis na construção de mapas genéticos de alta resolução, diagnóstico genético, análises filogenéticas (Rafalski, 2002) ou em estudos de história e genética de populações (Weiss, 1998; Judson & Stephens, 2001).

Apesar de SNPs já terem sido detectados em alguns genes de S. mansoni, uma verificação global deste tipo de polimorfismo ainda não havia sido realizada. É interessante ressaltar que alguns dos genes mais polimórficos observados possuem caráter antigênico, como: aldolase (Harrop, Coulson & Wilson, 1999), GAPDH (Argiro et al., 2000), proteína 14-3-3 (Schechtman et al., 2001), superóxido dismutase (Cook et al., 2004) e uma proteína do tegumento (Hoffmann & Strand, 1996). Recentemente, porém, uma predição de polimorfismos de alta qualidade foi realizada utilizando-se um conjunto de seqüências do transcriptoma do parasito (Simões et al., no prelo). Foi utilizado um algoritmo de predição de SNPs em regiões de seqüências de alta qualidade. A partir de um conjunto de 60.002 seqüências agrupadas (3.702.915 de bases) em 5.082 contigs foram observados 2.303 possíveis SNPs. Dentre os vários genes que apresentaram polimorfismos estão conhecidos antígenos como glutationa-S-transferase (GST), triose- fosfato-isomerase (TPI), o antígeno de membrana 23 kDa (Sm23/MAP3), o antígeno de membrana 14 kDa (Sm14) e catepsina B. Os polimorfismos no gene da catepsina B foram verificados por resseqüenciamento em amostras de parasitos obtidos de áreas endêmicas.

Transgênese

Com os enormes avanços tecnológicos em genômica, na última década do século XX, os métodos de descoberta gênica e sua caracterização funcional se desenvolveram significativamente, sendo já aplicados a uma gama de diferentes organismos, especialmente parasitos de interesse médico. Este progresso foi devido principalmente ao estabelecimento de culturas in vitro para facilitar a experimentação manual, a criação de bancos de dados de seqüências genômicas e de ESTs e a habilidade de se manipular genes específicos e se medir sua expressão em organismos intactos usando poderosas ferramentas de transgênese e interferência por RNA (RNAi) (Boyle & Yoshino, 2003). No entanto, para se trabalhar com helmintos existem barreiras ainda a serem ultrapassadas, como a falta de um sistema de cultivo independente de passagem pelo hospedeiro, ou a necessidade de produção de culturas celulares bem estabelecidas e a inexistência de métodos para a manipulação estável e eficiente de genes dentro dos organismos vivos (Boyle & Yoshino, 2003).

O estudo funcional dos genes novos selecionados dentro dos projetos de descoberta gênica em Schistosoma encontra uma barreira na impossibilidade da utilização de técnicas de deleção gênica diretamente nesse parasito. Primeiramente eles são metazoários que passam por enormes transformações morfológicas durante os vários estágios do seu ciclo de vida e, segundo, eles são organismos grandes, cobertos por uma camada resistente de tegumento, que teria de ser interrompida sem causar lesões ao parasito, para a introdução de ácidos nucléicos. Uma alternativa para contornar essas dificuldades técnicas é a utilização de mutantes de organismos de fácil manipulação e de genética já bem estabelecida, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, para o estudo da função dos genes de Schistosoma por complementação funcional heteróloga. No entanto, uma grande parte dos genes expressos pelo verme não está presente no genoma da levedura, ou até mesmo a similaridade entre os genes ortólogos é considerada baixa para permitir a complementação parcial ou total da função perdida na levedura. Desse modo, somente com o desenvolvimento de ferramentas para a transgênese transiente ou estável em Schistosoma será possível a descoberta da função de genes em larga escala. Para que isto se torne realidade, é necessário otimizar os métodos de introdução de DNA ou RNA no parasito para assegurar que o ácido nucléico seja efetivamente entregue no tecido-alvo. Para se gerar os transformantes, é preciso a combinação de vetores com promotores apropriados, em geral promotores fortes de genes do próprio organismo, para a expressão máxima do gene. A escolha do vetor a ser utilizado não é menos importante, principalmente quando se almeja criar transformantes estáveis, pois é necessário, neste caso, adicionar seqüências genômicas de inserção e marcadores de seleção no vetor (Boyle & Yoshino, 2003). Os métodos mais comuns existentes atualmente para introdução de construções de DNA ou plasmídeos em metazoários são a biobalística (bombardeamento de partículas, geralmente de ouro) e a microinjeção. Também existem técnicas que utilizam a eletroporação ou a transfecção por agentes lipofílicos, como a lipofectina.

Para S. mansoni já foram reportadas transfecções transientes de genes repórteres, com relativo sucesso. A primeira descrição do uso de biobalística para introduzir DNA plasmidiano codificador de luciferase em vermes adultos foi feita por Davis et al. (1999). Esta consistia da utilização do promotor do gene de Splice Leader (SL) de S. mansoni fundido à porção 5’ da região codificadora da luciferase, seguido pelo sinal de poliadenilação do gene da enolase. Com esta construção os autores reportaram que, 11 horas após a transfecção, os níveis de atividade da luciferase estavam vinte vezes acima dos níveis basais. Um estudo mais extenso foi feito por Wippersteg et al. (2002b), no qual o gene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) foi fundido ao promotor e ao terminador do gene de choque térmico hsp70 de S. mansoni. A construção foi usada para revestir partículas de ouro que foram bombardeadas em vermes adultos machos e esporocistos. A transcrição de GFP foi induzida em ambos os estágios por choque térmico a 42 oC. A expressão de GFP foi analisada por microscopia, RT-PCR e Western-blot. A expressão de GFP nos dois estágios foi ligeiramente diferente, sendo que no verme adulto ela foi dependente do choque térmico. O mesmo grupo de pesquisadores demonstrou, em esporocistos, com outra construção que utilizava o promotor e o terminador do gene da cisteína protease ER60 de S. mansoni fundido a GFP que é possível caracterizar a expressão tecido-específica de um gene (Wippersteg et al., 2002a). Posteriormente, foi relatado o bombardeamento de miracídios com partículas de ouro contendo uma construção de GFP potencializada (EGFP) sobre o controle dos promotores e terminadores do gene hsp70 de S. mansoni. Os miracídios bombardeados foram capazes de penetrar e se multiplicar em Biomphalaria glabrata, o caramujo hospedeiro intermediário de S. mansoni. A atividade do gene repórter foi detectada até dez dias após a infecção do hospedeiro por RT-PCR dos tecidos do caramujo, mas não por microscopia ou Western-blot, refletindo os níveis baixos de expressão da construção (Heyers et al., 2003).

Até bem pouco tempo, nenhuma transfecção estável havia sido obtida para Schistosoma. Se por um lado as transfecções transientes oferecem um método útil para estudar os efeitos da superexpressão de genes de interesse ou de seus sítios de expressão (tecidos ou fases do desenvolvimento), por outro lado torna-se necessário o desenvolvimento de métodos de transfecção estável no parasito. Um desses pode ser pela utilização de retrovírus. Nesse sentido, recentemente foi publicado um trabalho de transdução de várias fases do ciclo de vida de S. mansoni com um retrovírus modificado da família dos retrovírus da leucemia murina de Moloney (MMLV) (Kines et al., 2006). Neste trabalho, o MMLV foi modificado para incorporar os genes repórteres EGFP e luciferase sobre o controle dos promotores dos genes SL e hsp70 de S. mansoni. Partículas de retrovírus incompetentes para a replicação foram geradas contendo a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV) no seu envelope. Os vírus foram expostos aos vários estágios do desenvolvimento do parasito, permitindo a infecção dos vermes. Análise por Southern-blot demonstrou a integração das construções ao genoma do parasito e a análise dos RNA isolados demonstrou a presença dos transcritos dos genes repórteres (Kines et al., 2006). Esta é a primeira vez que se reporta a transdução de retrovírus em S. mansoni, sugerindo uma forma de se gerar transgênicos estáveis e que possam passar para as outras gerações. Todos estes resultados são muito encorajadores e permitirão o progresso da transgênese no parasito. No entanto, mesmo se obtendo uma integração estável, um certo número de obstáculos ainda deverão ser vencidos. Estes incluem o desenvolvimento de estratégias de seleção dos transformantes por drogas e o desenvolvimento de técnicas confiáveis de cultivo do parasito in vitro (Boyle & Yoshino, 2003).

 

RNAi – RNA de Interferência

No início da década de 90 do século XX foi descrito um fenômeno de supressão de expressão gênica em plantas (Napoli et al., 1990; Dehio & Schell, 1994), que mais tarde foi identificado e teve seu mecanismo desvendado no nematódio de vida livre Caenorhabditis elegans (Fire, 1999), sendo denominado interferência por RNA (RNAi). Este fenômeno foi posteriormente observado também em insetos, peixes, anfíbios e mamíferos (revisão em Dorsett & Tuschl, 2004). A técnica de silenciamento gênico pelo RNAi foi desenvolvida por Fire et al. (1998) e Fire (1999) e utiliza como base um mecanismo de defesa da célula hospedeira contra vírus cujo genoma consiste de RNA dupla fita (dsRNA). Sabe-se ainda que a interferência por RNA é utilizada naturalmente por células de diversos organismos como um mecanismo de controle da expressão de seus próprios genes. Esta técnica leva à supressão da expressão gênica por diminuição dos níveis do transcrito do gene de interesse, sendo este um evento de regulação póstranscricional, em oposição à deleção gênica que se obtém por recombinação de DNA, processo que leva à geração de animais geneticamente deficientes, os animais knock out. Recentemente foi inclusive demonstrado que, em alguns organismos, a interferência por RNA pode também passar para células da linhagem germinativa e ser transferida aos descendentes (Carmell et al., 2003; Kim et al., 2005). O RNAi se desenvolveu como uma poderosa ferramenta de teste de função gênica. A função do gene seria inferida pela falta da proteína, ou redução dos seus níveis no organismo. Além de ser uma técnica com custo relativamente baixo e de fácil execução, o RNAi ainda possui outras vantagens quando comparado com outras técnicas que visam estudar a função biológica. Dentre elas, podemos destacar a expressão de proteínas recombinantes em sistemas heterólogos, que pode apresentar uma série de problemas, principalmente relacionados à produção de proteínas na sua forma solúvel, corretamente processadas e enoveladas e biologicamente ativas. A tecnologia do RNAi promete revolucionar a biologia experimental em organismos, principalmente naqueles onde ainda não é possível a obtenção de transgênicos, sendo esta aplicada até mesmo em escala genômica em C. elegans. Pelo fato de ser simples, a técnica de RNAi pode também ser aplicada na solução de problemas em agricultura, além de representar uma importante ferramenta para a futura implantação de terapia gênica em humanos.

A interferência por RNA se dá pela ação de uma série de enzimas da célula, ocorrendo em diversas etapas. Um complexo protéico, denominado Dicer, com ação de ribonuclease, cliva os dsRNAs que entram nas células, ou que são produzidos pela própria célula, em pequenos fragmentos de 21 a 26 pb conhecidos como os RNAs interferentes pequenos (siRNAs). Estes siRNAs são separados em fita única após se ligarem a outro complexo, chamado complexo de silenciamento induzido por RNA (Risc). Caso a fita de RNA que permanece ligada ao complexo Risc seja complementar a um mRNA intrínseco da célula, ocorrerá uma ligação do complexo Risc com o mRNA, culminando na sua clivagem por uma ribonuclease denominada Slicer. Esta clivagem leva à degradação específica do mRNA, suprimindo a sua tradução (Hamilton & Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Dorsett & Tuschl, 2004).

Atualmente, alguns grupos de pesquisa têm almejado aplicar as técnicas de DNA recombinante na tentativa de desenvolver vermes do gênero Schistosoma com deleções para genes de interesse, o que permitiria estudar a função de diversas proteínas do organismo do verme. Entretanto, esses estudos encontram uma barreira na impossibilidade, até o momento, da utilização de técnicas de deleção gênica ou mutagênese sítio-dirigida diretamente no genoma desse parasito, o que dificulta a obtenção de mutantes. Como abordagem alternativa, a técnica do RNAi tem sido aplicada com bons resultados, em Schistosoma, nos estudos com a protease digestiva catepsina B, que participa da digestão de moléculas de hemoglobina (Skelly, Da’Dara & Harn, 2003; Correnti et al., 2005), como também para o transportador de glicose (SGTP1) e a enzima glicolítica gliceraldeído 3-fosfato desidrogenese (GAPDH) (Boyle et al., 2003).

O silenciamento gênico por RNAi em Schistosoma pode ser obtido de diferentes formas, simplesmente injetando o dsRNA específico dentro do organismo por eletroporação, incubando o verme em uma solução contendo o dsRNA ou mesmo alimentando o parasito com esta molécula. O fenômeno de interferência não requer grandes quantidades de dsRNA e tem longa duração. Em um estudo feito por Correnti et al. (2005), a importância da catepsina B para o crescimento do parasito foi demonstrada por diminuição da expressão desse gene, utilizando a técnica de RNAi. Os autores verificaram que a síntese de catepsina pode ser mantida a níveis extremamente baixos por mais de vinte dias, com uma única transfecção de dsRNA realizada por eletroporação ainda na fase larval, ou seja, em esquistossômulos. Os parasitos tratados com o dsRNA mantiveram-se viáveis e aparentemente continuaram a digerir a hemoglobina, mas mostraram um significante retardo no crescimento quando comparados aos parasitos não tratados. Em um outro trabalho e usando esporocistos, estágio que se desenvolve no interior dos caramujos, Boyle et al. (2003) conseguiram, simplesmente, por incubação dos vermes em uma solução contendo o dsRNA, diminuir os níveis de expressão de SGTP1 e GAPDH por, pelo menos, 21 dias. Com os resultados obtidos, os autores se mostraram otimistas em utilizar a tecnologia do RNAi para desvendar o papel de genes individuais envolvidos nos processos fisiológicos dos estágios larvais do parasito e identificar novos alvos para intervenção contra esse patógeno.

Os resultados de silenciamento gênico até então obtidos com tecnologia do RNAi em S. mansoni têm sido encorajadores e, certamente, facilitarão em um futuro próximo a caracterização da função de uma série de genes descobertos nos projetos genoma e transcriptoma desse organismo.

Proteoma A informação gerada pelo seqüenciamento do genoma e do transcriptoma e o perfil de expressão do genoma analisado por experimentos com microarranjos e Sage não revelam dados sobre abundância, estrutura final ou estado de atividade do produto dos genes, proteínas. A proteômica emergiu para contribuir com dados que tornarão mais completa uma representação da expressão do genoma, em combinação com dados de seqüência e perfil de expressão de RNA. Os métodos utilizados são variados, mas a maioria dos sistemas separa proteínas obtidas por diversos métodos por eletroforese bidimensional ou por cromatografia uni ou multidimensional e identifica as proteínas separadas ou spots por espectrometria de massa (Christendat et al., 2000). O uso desta abordagem apenas se iniciou em S. mansoni. Ashton, Curwen & Wilson (2001) reviram os procedimentos, e resultados iniciais com esse parasito foram gerados. Uma das possibilidades abertas pelo estudo do genoma é a de se identificar os alvos da resposta imunológica para o desenvolvimento de novas vacinas, especialmente proteínas de membrana e secretadas (Wilson et al., 2004). Neste sentido, foi utilizada uma abordagem que combina eletroforese com cromatografia seguida de análise por espectrometria de massa, identificando-se assim um grande número de proteínas consistentemente isoladas do tegumento (van Balkom et al., 2005). Outros autores identificaram, com uma abordagem semelhante, uma série de proteínas de superfície como tetraspaninas, anexinas, fosfatase alcalina e transportadoras de sódio e potássio, entre outras (Braschi et al., 2006). É esperado que a abordagem proteômica vá contribuir enormemente para um maior conhecimento da biologia do parasito e também para a identificação de novos alvos para drogas e vacinas.

 

A transdução de sinais e a regulação gênica

A identificação e caracterização de genes expressos por S. mansoni teve início na década de 80 do século passado, quando o interesse pelo parasito tinha como principal foco a descoberta de antígenosalvos para a produção de uma vacina contra a esquistossomose ou mesmo o entendimento do processo de desenvolvimento, maturação sexual e produção de ovos pelas fêmeas do parasito. Técnicas de biologia molecular como clonagem, construção e triagem de bibliotecas e seqüenciamento gênico foram naquela época adaptadas à rotina de pesquisa com S. mansoni. Assim, os primeiros genes caracterizados em S. mansoni codificavam proteínas constituintes da casca de ovo, sendo expressos seletivamente em células vitelinas de fêmeas maduras e produtoras de ovos, pois estas possuem expressão elevada no organismo adulto (Franco & Simpson, 2001).

Princípios Gerais da Regulação Gênica

Todas as células reconhecem e respondem de maneira apropriada a moléculas presentes no ambiente extracelular. O controle da expressão gênica é complexo, podendo ser exercido em vários níveis. Apesar de os circuitos mais abundantemente descritos para a regulação da síntese protéica estarem relacionados ao processo de transcrição, a regulação também pode ser exercida na tradução do RNA mensageiro (mRNA) e no processamento pós-traducional.

Um grande número de proteínas é fundamental para o início da transcrição, atuando através de interações com a RNA-polimerase. As principais moléculas participantes são os fatores gerais de transcrição (muitos destes constitutivamente ativos no núcleo), co-ativadores, corepressores, remodeladores de cromatina, acetilases de histona, quinases e metilases (Brivanlou & Darnell Jr., 2002). Estas proteínas essenciais estão presentes em todas as células eucarióticas, contribuindo para a iniciação da transcrição primária, mediada pela RNA-polimerase II, que produzirá o mRNA. Apesar dos co-ativadores e a maquinaria transcricional serem importantes para a sobrevivência de células e organismos, a escolha dos sítios específicos para a iniciação da transcrição não é indicada por estas proteínas, mas por fatores de transcrição reguladores de genes específicos, com dois domínios principais:

• domínio ligante de DNA, que se associa a sítios

regulatórios gene-específicos;

• um segundo domínio, capaz de ativar a transcrição. São

estes fatores de transcrição sítioespecíficos que recrutam co-ativadores e a maquinaria de transcrição, permitindo o início de transcrição gene-específica.

Desta forma, durante o desenvolvimento e a especialização celular, a regulação fina e específica da expressão gênica envolve uma cascata de controle transcricional de genes codificantes de fatores de transcrição e sinais do exterior da célula que ativam de forma pós-transcricional fatores de transcrição já existentes. Portanto, o conjunto de componentes reguladores para cada gene é único, assegurando que a expressão protéica seja apropriada na quantidade, tempo e espaço (Brivanlou & Darnell Jr., 2002).