17 – Técnicas Utilizadas no Estudo dos Moluscos do Gênero Biomphalaria e na Manutenção do Ciclo de Schistosoma mansoni Liana K. Jannotti-Passos, Roberta Lima Caldeira e Omar dos Santos Carvalho

17 - Técnicas Utilizadas no Estudo

dos Moluscos do Gênero

Biomphalaria e na Manutenção do

Ciclo de Schistosoma mansoni

 

Liana Konovaloff Jannotti-Passos; Roberta Lima Caldeira; Omar dos Santos Carvalho

 

Infecção de camundongo com cercárias de Schistosoma mansoni.

Neste capítulo serão apresentadas técnicas utilizadas na rotina

do Moluscário Lobato Paraense do Centro de Pesquisa René

Rachou/Fiocruz, localizado em Belo Horizonte, Minas Gerais.

Serão descritos os métodos de exame de moluscos para se

detectar a presença de cercárias, as cercárias mais comuns

encontradas em moluscos; o método de criação de moluscos

em grande escala, a infecção individual e em massa de

moluscos, técnica de perfusão e infecção de camundongos,

processo de captura, embalagem, fixação e dissecação de

moluscos. Estas técnicas auxiliarão pessoas interessadas em

estudar o molusco, o parasito e a relação parasito-hospedeiro.

 

Criação de moluscos

Os moluscos do gênero Biomphalaria podem ser criados em aquários com água corrente desclorada e aeração constante. No fundo dos aquários deve-se colocar terra esterilizada acrescida de 10% de carbonato de cálcio e pequena quantidade de areia. Como alimento pode se oferecer alface fresca lavada em água com 0,1% de ácido acético e ração de roedores peneirada, acrescida de 10% de carbonato de cálcio. A ração deve ser molhada para formar uma pasta, permitindo que a mesma concentre-se no fundo do aquário. A quantidade de alimento oferecida dependerá da quantidade de moluscos no aquário. O alimento deve ser oferecido pela manhã e, caso haja necessidade, também à tarde. Caso ocorra sobra de alimento no dia seguinte, o excesso deve ser retirado para evitar a formação de fungos. Os aquários devem ser providos de uma tampa para evitar que os moluscos fujam. A temperatura ideal da sala de

criação deve ser de 24±1°C (Figura 1).

Figura 1 – Criação de moluscos do gênero Biomphalaria

 

Obtenção de ovos Biomphalaria

As desovas podem ser obtidas introduzindo-se pequenos pedaços (6 x 6 cm) de plástico, lavados em água corrente, nos aquários onde

são mantidos moluscos adultos (Figura 2). Após a deposição da desova no plástico, este é removido com o auxílio de pinça e transferido para outros recipientes até o amadurecimento das desovas, o que, em uma temperatura de 24°C, ocorrerá entre quatro e cinco dias. Após este período os ovos são contados, as desovas lavadas em água corrente e transferidas para um aquário. A quantidade de ovos dependerá do tamanho do aquário. Deve-se levar em conta que cerca de 20% dos ovos morrem antes de alcançar a fase adulta. A alimentação (ver seção anterior – criação de Molusco) deverá ser fornecida logo após a eclosão dos moluscos, sempre em pequenas quantidades para se evitar a formação de fungos.

Figura 2 – Desova de moluscos do gênero Biomphalaria, em saco

plástico, após a deposição da desova no plástico

 

Infecção de moluscos em laboratório

Obtenção dos Ovos de S. mansoni

Os ovos de S. mansoni são obtidos a partir de camundongos (Mus musculus) ou hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados com cercárias de S. mansoni e posteriormente sacrificados. Os fígados desses animais são triturados em liquidificador junto com solução salina a 0,85% (Pellegrino & Katz, 1968). Esta solução é transferida para um cálice, mantido no escuro por trinta minutos, e em seguida lavada sucessivas vezes com água desclorada até a solução ficar limpa. Desprezase o sobrenadante e o sedimento contendo os ovos é transferido para placas de Petri, com água desclorada, ou para balão volumétrico escuro com a extremidade clara e mantido a 28°C, sob luz artificial, até a eclosão dos miracídios. Os miracídios nadam, concentrando-se na

extremidade clara do balão volumétrico (Chaia, 1956) (Figura 3).

Figura 3 – Procedimento para obtenção de miracídios

 

Infecção Individual de Moluscos

Para infecção individual de moluscos são utilizadas placas de plástico branco, transparente, com 24 divisões cilíndricas com capacidade de 2,5 ml com tampa (placa utilizada para cultura de células). Em cada divisão deve ser introduzido um molusco, com aproximadamente 8 mm de diâmetro e adicionado de 2,5 ml de água contendo miracídios. O número de miracídios poderá variar de acordo com o experimento e a espécie de molusco. No início da exposição o material é examinado ao microscópio estereoscópico, para confirmação da presença de miracídios. Os moluscos são mantidos em contato com os miracídios por quatro horas, sob luz

artificial (Figura 4), e posteriormente transferidos para aquários, com aeração constante e água corrente, desclorada e aquecida a 27±1°C. Decorridos trinta dias da infecção os moluscos são examinados para verificação da presença de cercárias.

Figura 4 – Infecção individual de moluscos

 

Infecção em Massa de Moluscos

Para a infecção de moluscos em massa utiliza-se um béquer, onde são colocados moluscos e uma suspensão contendo miracídios

(Figura 5). A quantidade de miracídios a ser utilizada dependerá do experimento e da espécie de molusco. Os moluscos deverão permanecer nesta suspensão durante quatro horas, sob luz artificial, e em seguida transferidos para aquário com sistema de água corrente, aeração constante e temperatura controlada de 27±1°C. Decorridos trinta dias da exposição dos moluscos, estes podem ser examinados em microscópio estereoscópico para verificação da presença de cercárias.

Figura 5 – Infecção de moluscos em massa

 

Exame de moluscos

Por Estímulo Luminoso

Os moluscos são lavados em água desclorada, introduzidos, individualmente, em recipientes contendo 3 ml de água desclorada. A quantidade de água dependerá do tamanho do molusco, sendo o ideal cobri-los totalmente. Os moluscos deverão ser expostos por trinta minutos à luz artificial. Após este período são examinados em microscópio estereoscópico, observando-se a presença de cercárias na água. Os frascos contendo moluscos com cercárias de S. mansoni são separados e, no final, calculado a taxa de infecção

(Figura 6).

Figura 6 – Exame de moluscos por estímulo luminoso

 

Por Esmagamento

Os moluscos são colocados entre duas placas de vidro e esmagados. O conjunto de placas é levado ao microscópio estereoscópico para pesquisa de cercárias e/ou esporocistos. Em

seguida faz-se o cálculo da taxa de infecção (Figura 7).

Cálculo da taxa de infecção:

Figura 7 – Exame de molusco por esmagamento

 

Manutenção dos moluscos positivos e

eliminação de cercárias

Os moluscos positivos são transferidos para recipientes de vidro ou plástico e mantidos no escuro, dentro de uma incubadora a

25±0,5°C (Figura 8). Após 24 horas os moluscos são transferidos para uma estufa, com temperatura de aproximadamente 28°C, sob luz artificial, para eliminação de cercárias que serão utilizadas para infectar camundongos.

Figura 8 – Incubadora com aquários contendo os moluscos

 

Infecção e perfusão de camundongos para

obtenção dos vermes

A infecção de camundongos é feita por injeção subcutânea pela

inoculação de cem cercárias de S. mansoni (Figura 9). Após cinqüenta dias de infecção, os camundongos são sacrificados e perfundidos. A perfusão dos camundongos é feita após incisão na região ventral. O intestino é amarrado na altura do reto e a veia porta é seccionada. Em seguida injeta-se solução salina com heparina na artéria aorta, para retirada dos vermes adultos do intestino. Também se pode injetar solução salina no ápice do fígado, para recuperar os vermes localizados neste órgão (Pellegrino &

Siqueira, 1956) (Figuras 10 e 11).

Figura 9 – Inoculação de cercárias em camundongo

Figura 10 – Aparelho utilizado para perfusão de camundongos

 

Figura 11 – Perfusão de camundongo

 

Morfologia das cercárias Os moluscos coletados no campo podem estar infectados com vários tipos de cercárias. As cercárias, com cauda bifurcada, comumente encontradas em moluscos são as de S. mansoni (Trematoda: Schistosomatidae), Cercaria caratinguensis (Trematoda: Strigeidae), Cercaria ocellifera (Trematoda: Clinostomatidae) e Cercaria amplicoecata (Souza & Lima, 1990).

As cercárias de S. mansoni possuem aproximadamente 0,51 mm,

com furca menor que o corpo (Figura 12 A), e movimentam-se

ativamente em forma do numeral oito (Figura 12 B). Quando paradas, contraem o corpo e a cauda, apresentando enrolamento

característico das furcas (Figura 12 C).

Figura 12 – Cercária de Schistosoma mansoni. (A) Cercária,

desenho em câmara clara; (B) Cercária em movimento em forma de

numeral oito; (C) Fotomicrografia da cercária de Schistosoma

mansoni mostrando o enrolamento das furcas

 

Fonte: (A); (B); (C) Souza & Lima (1990).

Cercaria ocellifera possui aproximadamente 0,75 mm de comprimento. Estas cercárias possuem um par de ocelos pigmentados. O corpo é estreito e curto em relação à cauda, que é longa (três a quatro vezes maior que o corpo), bifurcando-se na

extremidade posterior (Figura 13 A). Possui movimento semelhante às cercárias de S. mansoni; entretanto, quando em repouso o corpo fica inclinado ventralmente e a cauda fica reta, com as furcas

entreabertas (Figura 13 B).

Figura 13 – Cercaria ocellifera. (A) em repouso; (B) de perfil

 

Fonte: Souza & Lima (1990).

Cercaria caratinguensis possui aproximadamente 0,49 mm de comprimento, tem a furca longa, do mesmo tamanho ou maior que o

corpo (Figura 14). Esta cercária é muito ativa, apresentando movimentos ondulatórios, vez por outra formando um numeral oito; quando parada, a furca se abre em forma de letra T. Outra cercária bifurcada é a Cercaria amplicoecata, que possui aproximadamente 0,7 mm de comprimento, corpo alongado e estreito, cauda uniforme, com furca longa achatada lateralmente. O comprimento aproximado da furca é igual ao da cauda ou ligeiramente maior. Movimenta-se bruscamente, alternando movimentos em oito e paradas em forma

de letra T (Figura 15).

Figura 14 – Cercaria caratinguensis

 

Fonte: Souza & Lima (1990).

Figura 15 – Cercaria amplicoecata

 

Fonte: Souza & Lima (1990).

 

Procedimentos de captura, embalagem e fixação

de moluscos

Captura de Moluscos

A procura de moluscos deve ser feita observando-se as características de cada coleção d’água. Em criadouros como lagoas e açudes os moluscos podem ser encontrados aderidos a pedras, objetos flutuantes, junto às plantas aquáticas que lhes servem de alimento, ou no fundo dos criadouros. As plantas aquáticas comumente encontradas em criadouros são: Eichhornia crassipes (aguapé, baronesa); Salvinia natans (ou lentilha d’água); Heteranthera reniformis (heterantera), Vallisneria spiralis (valisneria); Myriophyllum spicatum (pinheirinho); Elodea densa (elodea); Ludwigia natans (ludvigia) etc.

Em valas de irrigação muito rasas, os moluscos costumam ficar parcialmente recobertos por fina camada de terra, em horários de sol mais quente. O número de moluscos em uma região pode variar conforme a época do ano, período de seca ou de chuvas e tipo de criadouro.

O material necessário para coleta constitui-se de: pinças longas; conchas de captura; sacos plásticos, para acondicionar moluscos; luvas; botas de borracha; fichas de coleta; canetas e etiquetas para identificação do material coletado.

Na coleta, deve-se raspar, com a concha (Figura 16), o fundo, as margens do criadouro e a vegetação, lavar o material com cuidado e observar se foi coletado algum molusco. Depois, devem ser retirados os exemplares da concha, com auxílio da pinça, transferindo-os para um saco plástico. Finalmente deve-se anotar a data da coleta, a localização, o tipo de criadouro e o nome do coletor, e se possível identificar o local mediante a utilização de GPS.

Figura 16 – Concha de metal perfurada, com cabo de madeira, para

coleta dos moluscos

Embalagem de Moluscos

Para a embalagem de moluscos vivos, deve-se proceder da seguinte maneira:

umedecer, em água comum, uma faixa de gaze de 30 a 50 cm de comprimento/20 cm de largura;

estender a gaze sobre uma superfície plana;

colocar uma fileira transversal de moluscos a aproximadamente 3 cm da extremidade da gaze, deixando espaço de 1 cm entre os moluscos pequenos e de 2 cm

entre os moluscos grandes (Figura 17 A);

dobrar a gaze sobre a fileira de moluscos, enrolando tipo um ‘rocambole’;

colocar outra fileira de moluscos e repetir este procedimento até chegar próximo ao final da gaze. Entre a última fileira de moluscos e a extremidade da gaze deve sobrar uma margem de tecido suficiente para dar pelo menos uma volta completa sobre o cilindro de gaze que se formou;

colocar a gaze com os moluscos em um saco plástico;

identificar os moluscos: localidade, tipo de criadouro (córrego, lagoa, brejo, vala de irrigação ou drenagem), nome do coletor, data da coleta e qualquer outra

informação considerada importante (Figura 17 B);

colocar o conjunto em recipiente resistente, tipo caixa de

madeira (Figura 17 C), manusear com cuidado para não esmagar os moluscos;

não submeter os moluscos à refrigeração ou às altas temperaturas.

Fixação de Moluscos

A técnica para separar a concha do corpo do molusco e fixação deste último é realizada de acordo com os protocolos estabelecidos por Paraense (1976), com pequenas adaptações. A fixação tem por objetivo preservar as estruturas e proporções dos órgãos utilizados

na identificação específica (Carvalho et al., 2005) (Figura 18). A primeira etapa deste procedimento inclui a imersão dos moluscos em solução anestésica (pentobarbital sódico na concentração de 0,4 mg/ml), por um período de oito horas, até que fiquem completamente relaxados e imóveis. Para retirar o corpo dos moluscos, imergi-los em água a 70°C, por um período de trinta a 45 segundos (proporcional ao tamanho do exemplar). A temperatura da água, bem como o tempo de imersão dos exemplares não devem ultrapassar os limites acima. Em seguida, introduzilos em água fria, segurando-os pela concha, e retirar o corpo com o auxílio de uma pinça. Após este processo, o corpo de cada exemplar deverá ser acondicionado em frascos contendo o fixador de Raillet-Henry (0,6% de cloreto de sódio, 5% de formol e 2% de ácido acético) por 24 horas, substituindo-o no final deste período por uma nova solução. A dissecção deverá ser iniciada após 48 horas. As conchas serão colocadas para secar e em seguida depositadas em frascos contendo algodão.

Para trabalhos de biologia molecular, antes de introduzir os moluscos na solução fixadora, corta-se um pequeno fragmento da região cefalopodal, que é estocada em tubos contendo etanol (álcool).

Figura 17 – Embalagem de moluscos. (A) Enrolamento da gaze; (B)

Embalagem antes de ser colocada na caixa de madeira; (C) caixa

de madeira

Figura 18 – Esquema da técnica de fixação dos moluscos

Processo de dissecção de moluscos

O material necessário consiste de: placa Petri, pinças de pontas finas e retas, pincel de cerdas finas e um microscópio estereoscópico. Os seguintes procedimentos devem ser adotados:

na placa de Petri, coloque um pouco de fixador. Coloque o molusco do lado esquerdo, de maneira que o observador veja as aberturas masculina e feminina;

com a pinça, vá despregando cuidadosamente o ‘fio columelar’ (junção entre o músculo columelar e o manto), primeiramente pelo lado esquerdo, até a altura da glândula digestiva;

vire o corpo do molusco e retire o fio columelar do lado direito. Segure firmemente a cabeça do molusco com uma pinça e com outra puxe o colar do manto em direção à glândula digestiva. O manto se desprenderá do resto do corpo;

observe a parte interna do manto. Nesta região existe o tubo renal no qual deverá ser observada a presença de pigmento ou se, do tubo, levanta-se uma crista pigmentada;

vire o corpo do molusco novamente para o lado esquerdo. Observe a abertura genital masculina, que se localiza abaixo do tentáculo. O prepúcio e parte do ducto deferente podem ser vistos, por transparência, próximos à abertura masculina. A dissecção do complexo peniano inicia-se nesta região, retirando-se pele e músculos cuidadosamente com a pinça, até que o prepúcio e o ducto deferente fiquem expostos;

puxe o prepúcio e o ducto deferente cuidadosamente até que fiquem liberados;

disseque com cuidado o sistema genital feminino, observe a abertura e continue retirando as camadas de tecido até exposição completa. Com auxílio da pinça retire o sistema genital feminino e parte do masculino;

despreze a região cefalopodal, o músculo columelar e o sistema digestivo;

limpe o aparelho reprodutor com o auxílio da pinça e do pincel.

 

Referências

CARVALHO, O. S. et al. Moluscos de Importância Médica no Brasil. Belo Horizonte: Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, 2005.

CHAIA, G. Technic for concentration of miracidia. Revista Brasileira de Malariologia e Doencas Tropicais, 8: 355-357, 1956.

PARAENSE, W. L. Lymnaea viatrix: a study of topotypic specimens (Mollusca, Lymnaeidae). Revista Brasileira de Biologia, 36: 419-428, 1976.

PELLEGRINO, J. & KATZ, N. Experimental chemotherapy of schistosomiasis mansoni. In: DAWES, B. (Ed.) Advances in Parasitology. London: Academic Press, 1968.

PELLEGRINO, J. & SIQUEIRA, A. F. A perfusion technic for recovery of Schistosoma mansoni from experimentally infected guinea pigs. Revista Brasileira de Malariologia e Doenças Tropicais, 8: 589-597, 1956.

SOUZA, C. P. & LIMA, L. C. Moluscos de Interesse Parasitológico do Brasil. Belo Horizonte: Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, 1990.