10 – Estudo do Desenvolvimento Embrionário de Biomphalaria glabrata (Mollusca, Planorbidae) e suas Aplicações Toshie Kawano, Eliana Nakano, e Liz Cristina Watanabe

10 - Estudo do Desenvolvimento

Embrionário de Biomphalaria glabrata

(Mollusca, Planorbidae) e suas

Aplicações

 

Toshie Kawano; Eliana Nakano; Liz Cristina Watanabe

 

Ovo indiviso de Biomphalaria glabrata.

A fase inicial da ontogênese de um organismo sexuado consiste

na formação de células germinativas, a gametogênese. Nessa

fase, as ovogônias (2n) e espermatogônias (2n) se multiplicam

por mitose e, posteriormente, com o aumento do volume celular,

se preparam para a meiose e formação de espermatócitos I

(2n) e ovócitos I (2n), seguido de espermatócitos II (n) e

ovócitos II (n), que se transformam em espermátides (n) e

ovótides (n) e, finalmente, em espermatozóides (n) e óvulos (n)

maduros. Da fertilização do óvulo pelo espermatozóide se

forma o ovo (2n).

Um organismo multicelular passa por uma transformação lenta

e progressiva a partir de uma única célula, o ovo fertilizado ou

zigoto. O ovo se divide mitoticamente para produzir todas as

células componentes do corpo. Em geral, o estudo desse

desenvolvimento é denominado embriologia, e abrange o

intervalo entre a fertilização e o nascimento do organismo

conhecido como embrião. Porém, sabe-se que o

desenvolvimento de organismos multicelulares (multicelulares:

em contraposição a unicelulares) não se estabiliza com o

nascimento, ou mesmo na fase adulta como, por exemplo, no

caso da formação de milhões de novos eritrócitos em cada

minuto de nossas vidas. Mais recentemente, outros processos

foram incluídos no estudo do desenvolvimento embrionário, que

passou, então, a ser denominado biologia do desenvolvimento

(Gilbert, 1994).

 

Etapas da Biologia do desenvolvimento

O estudo da biologia do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão de outras áreas integradas da biologia como: biologia molecular, fisiologia, biologia celular, anatomia, pesquisas em câncer, imunologia, estudos evolucionários e ecológicos.

As principais etapas do desenvolvimento incluem diferentes transformações como:

diferenciação, que é a produção e organização de diversos tipos de células originadas de uma simples célula, o ovo;

morfogênese, que é o processo de organização de diferentes células em tecidos e órgãos;

crescimento, que é o aumento do tamanho e do número celular;

reprodução, que é responsável pela perpetuação da espécie.

As diferentes etapas após a fertilização do ovo são:

clivagem, que consiste na divisão mitótica do ovo sem aumento do citoplasma, fase esta que compreende os estádios de mórula e blástula;

segue-se o estádio de gastrulação, que se caracteriza pela movimentação, diferenciação e pelo aumento celular. Nessa fase, o embrião inicia a formação da cavidade anterior, o blastósporo, que formará a futura boca; na região oposta há a formação da glândula da concha. O embrião modifica sua forma em razão das movimentações celulares;

na organogênese os embriões já apresentam a formação de órgãos;

no próximo passo do desenvolvimento, as células germinativas são destinadas para a função específica da reprodução e o resto das células formadas no corpo são as somáticas. Com os organismos fisicamente maduros e aptos à reprodução, os gametas se fundem; esta fusão é a fertilização, iniciando-se um novo ser, que vai passar pela senescência e morte.

O estudo da embriologia normal de caramujos do gênero Biomphalaria sp (Mollusca, Gastropoda, Planorbidae) é de suma importância para a análise dos efeitos de agentes químicos e físicos na morfogênese. Muitos compostos são usados como moluscicidas aplicados na natureza para o controle da esquistossomose.

Maturação e Fertilização Nos moluscos, em geral, a maturação do ovo acontece independentemente da fertilização, continuando até a metáfase da primeira divisão meiótica de maturação, permanecendo nesse estádio até a penetração do espermatozóide; os ovos não fertilizados ficam bloqueados nesse estádio. A fertilização ocorre normalmente entre o início da maturação e a metáfase da primeira divisão de maturação; isso é observado em moluscos dos seguintes gêneros (Raven, 1958): Cumingia, Mytilus, Ostrea commercialis, Dentalium, Bulla, Crepidula, Physa, Limnaea, Limax, Helix e Eulota.

De acordo com Longo (1976), a fertilização ocorre nos ovos de clivagem espiral em três etapas:

incorporação do espermatozóide com desenvolvimento do pronúcleo masculino e bloqueio da poliespermia (entrada de vários espermatozóides no óvulo);

reinicio da meiose no ovócito: ocorre a quebra da vesícula germinal, formação do primeiro e segundo corpúsculos polares e desenvolvimento do pronúcleo feminino;

fusão dos dois pronúcleos, o feminino com o masculino, formando o genoma embriônico, e início da mitose.

Quando o caramujo coloca a desova no exterior, o ovócito I está na fase de metáfase da primeira meiose para se transformar em ovócito II (formação do primeiro corpúsculo polar). Nesse estádio, a desova do gênero Biomphalaria sp se apresenta com a cápsula externa maleável e a substância albuminosa opaca. A emissão do primeiro corpúsculo polar ocorre entre 15 e trinta minutos após a oviposição. Em seguida, ocorre a segunda divisão meiótica, formando a ovótide – formação do segundo corpúsculo polar, após

cerca de cinqüenta a oitenta minutos (Figura 1: um ovo de Biomphalaria glabrata com dois corpúsculos polares). Na região onde se encontram os corpúsculos polares, está localizado o pólo animal do ovo; a região oposta é a vegetativa. Em seguida à emissão dos corpúsculos polares, observam-se movimentos amebóides no ovo: como em Lymnaea stagnalis (Raven, 1945) e em Biomphalaria sp, o contorno do ovo é irregular, com movimentos amebóides. Em seguida, os pronúcleos feminino e masculino se unem formando o genoma do embrião, que iniciará a mitose em torno de sessenta minutos após a emissão do segundo corpúsculo polar.

Figura 1 A – Ovo antes da primeira clivagem

Figuras 1B a 20 – As quatro primeiras clivagens do ovo de B.

glabrata

 

Clivagem em Espiral

A clivagem em espiral é característica dos moluscos em geral, exceto dos cefalópodos, e também dos anelídeos, turbelários e nemertinos. Esse tipo de clivagem se difere da radial:

por causa do ângulo oblíquo que se forma no eixo animal-vegetativo do embrião;

o arranjo termodinâmico maximiza o contato entre os blastômeros e é o que distingue os embriões de clivagem em espiral;

os embriões de clivagem em espiral se dividem com menor velocidade, permitindo, assim, que o estudioso possa

seguir o destino de cada blastômero (Gilbert, 1994).

O padrão espiral é facilmente observado na terceira clivagem do ovo, no qual o primeiro quarteto de micrômeros é formado. Do pólo animal, o fuso é visto no sentido horário e o molusco é destro; quando acontece o oposto, é sinistro. Foi Crampton (1894), estudando a linhagem celular de Physa, que notou que havia correlação entre a abertura da concha e a direção de clivagem do molusco; portanto, quando a direção é destra, a abertura da concha é destra; assim, os de clivagem reversa ou sinistra têm a abertura sinistra.

Nos moluscos de clivagem em espiral, há determinantes morfogenéticos que estão situados no pólo vegetativo do ovo e desempenham um papel importante, estabelecendo a organização primordial do futuro embrião. Tais determinantes (Verdonk & Cather, 1983) podem estar localizados em estruturas citoplasmáticas ou podem estar ligadas ao córtex da região vegetativa do ovo e serem distribuídos para certos blastômeros, determinando o destino dos mesmos. Os determinantes, provavelmente, são sintetizados durante a ovogênese; sua natureza ainda é discutível (Boon-Niermeijer, 1987).

Em algumas espécies de moluscos, embriões contendo o lóbulo polar que é uma estrutura citoplasmática sem núcleo, evidenciado nas primeiras clivagens em razão do tamanho diferente nos dois primeiros blastômeros. O lóbulo polar é muito importante para o estudo da embriologia experimental, pois contém os determinantes morfogenéticos que comandam o ritmo e a orientação do blastômero D, parte dorsal do embrião. Os determinantes irão mais tarde para o 4d, responsável pela diferenciação da mesoderme e do intestino, determinando a bilateralidade do embrião. Na embriologia experimental, embriões com lóbulo polar são mais conspícuos, pois se sabe com antecedência qual blastômero está sendo manipulado.

No desenvolvimento embrionário que origina quatro blastômeros de tamanhos iguais, o quadrante D também será a parte dorsal do embrião. Na clivagem em que o embrião atinge 24 blastômeros, entretanto, o quadrante D já age como determinante, entre os micrômeros e um macrômero do pólo vegetativo. Em todos os moluscos, o quadrante D age como organizador que, por intermédio de interações celulares, controla o desenvolvimento de outros quadrantes (Verdonk & Cather, 1983).

A linhagem celular foi estudada por vários pesquisadores desde o final do século XIX (Raven, 1958) e, posteriormente, foram realizados trabalhos com Lymnaea stagnalis (Verdonk, 1965), B. glabrata (Camey & Verdonk, 1970), Biomphalaria tenagophila (Watanabe, 1997) e Biomphalaria straminea (Oliveira, 2001). O estudo da embriologia neste capítulo se baseará na espécie B. glabrata, e serão discutidas as características que as outras duas espécies apresentarem.

Nomenclatura e Notação

Para o estudo da linhagem celular, houve a necessidade de se padronizar a nomenclatura e notação para que as espécies pudessem ser acompanhadas nas suas diversas etapas do desenvolvimento e também para possibilitar o estudo comparativo entre diferentes moluscos.

A nomenclatura utilizada foi a mesma de Conklin (1897), que estudou a linhagem celular em Crepidula.

As características de uma clivagem em espiral são:

o fuso na divisão é oblíquo em relação ao eixo animal vegetativo do ovo (Wilson, 1892);

a clivagem se alterna de acordo com a mudança na direção do fuso, a cada divisão sucessiva dos blastômeros, do sentido horário para o anti-horário.

A notação para se designar as gerações sucessivas de micrômeros consiste de uma letra, um coeficiente e um expoente. A letra representa a origem do micrômero, o coeficiente indica o número da camada do micrômero e o expoente representa o número de gerações. O termo quarteto foi adotado por Conklin (1897) e é fundamental para o entendimento da linhagem celular. O quarteto se origina na segunda clivagem do ovo, A, B, C e D, e é pela clivagem sucessiva deste quarteto que se processa todo o desenvolvimento embrionário do molusco. Nas espécies de Biomphalaria (Camey, 1968), há a divisão de uma quinta camada de micrômeros, mas somente três se dividem: 5A, 5B e 5C; o 4D permanece sem se dividir, até onde foi observado (Camey & Verdonk, 1970).

Para os macrômeros, foi adotada a nomenclatura utilizada por Wierzejski (1905), que estudou Physa fontinalis; e consiste em alterar a numeração do macrômero de acordo com a separação do quarteto de micrômeros.

Há muitas divergências quanto à utilização do termo embrião ou do termo larva em moluscos com desenvolvimento dentro da cápsula do ovo até a eclosão. Para facilitar a leitura, neste capítulo será denominado de embrião o estádio de primeiras clivagens do ovo, até a gástrula. Do estádio de trocófora jovem até véliger a denominação será larva, mesmo que o caramujo esteja dentro da cápsula do ovo.

Técnica para evidenciar o limite celular dos embriões

Foi utilizada a técnica de Holmes (1900), que estudou embriologia em Planorbis trivolvis. Essa técnica consiste em remover a cápsula do ovo e a albumina dos embriões por meio de uma lavagem em água filtrada, dentro de uma saleirinha (salt dish). Em seguida os embriões devem ser colocados numa solução de 0, 75%_AgNO e, 3 logo depois, expostos ao sol ou à lâmpada de UV por dois a cinco segundos, de acordo com o estádio embrionário: os embriões mais jovens (primeiras clivagens, blástula, gástrula e trocófora jovem), de três a cinco segundos; os mais desenvolvidos (como trocófora, véliger jovem e véliger), de dois a três segundos. Durante a exposição, deve-se manter a saleirinha em movimento circular, para que o embrião fique exposto por todos os lados, ressaltando assim o limite celular dos blastômeros. Os embriões são lavados em seguida e transferidos em série de álcoois: 50%, 70%, 80%, 96% (aproximadamente dez horas cada), 100% (3x três minutos) e xilol (3x 20minutos). Os embriões são montados em lâmina e lamínula, com um pedaço de cartolina colada na lamínula e uma abertura redonda, a fim de que os embriões inteiros possam ser manipulados sem dano. Após a montagem, os embriões podem ser movimentados para todos os lados, quando o bálsamo endurecer; uma gota de xilol é suficiente para que a lamínula possa ser deslocada.

 

Desenvolvimento embrionário

Ovo indiviso

Um ovo maduro (logo após a oviposição da desova) de B. glabrata (Camey & Verdonk, 1970), B. tenagophila (Watanabe, 1997) e B. straminea (Oliveira, 2001) tem 100 µm de diâmetro. Para a análise dos embriões entre os estágios de ovo maduro até a quarta clivagem do ovo, utilizou-se o fotomicroscópio Zeiss nas preparações in vivo realizadas, em intervalos que variaram de dois a cinco minutos; esses estádios são semelhantes aos obtidos por

Raven (1946) em Lymnaea stagnalis. Na Figura 1-1A observa- se um ovo com dois corpúsculos polares.

Primeira Clivagem

AB e CD = dois blastômeros.

Em B. glabrata, a primeira clivagem é meridional e forma dois blastômeros iguais AB e CD. A idade dos embriões de uma mesma desova é calculada da seguinte forma: quando 50% dos ovos atingem o estádio de 1-1B, determina-se o ponto zero para o início da contagem em horas, isso em razão de os ovos não serem sincrônicos, numa mesma desova. O estádio 1B é equivalente ao 1 de Raven (1946), pelas mesmas razões anteriormente descritas.

Ovo indiviso (Figura 1-1A): ovo antes do inicio da divisão, com

dois corpúsculos polares.

Início primeira clivagem Figura 1-1B: nota-se o início do sulco

de clivagem no pólo animal (hora zero).

Estádio 2 (Figura 1-2): três minutos após o estádio 1B.

Estádio 3 (Figura 1-3): quatro minutos após o estádio 1B.

Estádio 4 (Figura 1-4 e Figura 2-1): com blastômeros ligados

por uma pequena superfície citoplasmática, dez minutos após o

estádio 1B.

Estádio 5 (Figura 1-5): com blastômeros com maior superfície

de contato em aumento gradual até o estádio 1-7, 21 minutos

após o estádio 1B.

Estádio 6 (Figura 1-6): 26 minutos após o estádio 1B.

Estádio 7 (Figura 1-7): com blastômeros com maior superfície

de contato, em forma oval, 38 minutos após o estádio 1B.

Estádio 8 (Figura 1-8): início do aparecimento da cavidade de

clivagem, 45 minutos após o estádio 1B.

Estádio 9 (Figura 1-9): com cavidade de clivagem mais nítida,

75 minutos após o estádio 1B.

Durante a clivagem do ovo, nota-se que os blastômeros passam por uma mudança de formas; inicialmente, se separam um do outro

(Figuras 1-3, 1-4, 1-5, 1-11, 1-12, 1-13 e 1-17) e, em seguida, se unem formando uma superfície quase arredondada, como se nota

nas Figuras 1-9, 1-14 e 1-19, respectivamente antes da segunda, terceira e quarta clivagens. Logo antes desses estádios, observa-se que entre os blastômeros forma-se uma cavidade denominada

cavidade de clivagem (Figuras 1-8, 1-9, 1-14, 1-18 e 1-19), que desaparece logo após cada clivagem. Segundo Raven (1958), essa cavidade regula a pressão osmótica do embrião.

Segunda Clivagem

A, B, C e D = quatro blastômeros.

O estádio 10 (Figura 1-10, Figura 2-2) ocorre oitenta minutos após a primeira clivagem do ovo e nota-se que os dois blastômeros não se clivam ao mesmo tempo: um deles forma o sulco de clivagem antes

do outro estádio 10 (Figura 1-10).

Estádio 11 (Figura 1-11): quatro blastômeros bem nítidos, 91

minutos após o estádio 1B.

Estádio 12 (Figura 1-12): início da cavidade de clivagem entre

os dois blastômeros, 98 minutos após o estádio 1B.

Estádio 13 (Figura 1-13): com a cavidade de clivagem entre os

dois blastômeros, 103 minutos após o estádio 1B.

Estádio 14 (Figura 1-14): com a superfície quase arredondada

dos blastômeros, 123 minutos após o estádio 1B.

Estádio 15 (Figura 1-15): superfície com ligeira forma dos

blastômeros, 134 minutos após o estádio 1B.

Terceira Clivagem

Com a formação de 4 micrômeros e 4 macrômeros: 1a-1d, 1A-1D = 8 blastômeros.

O estádio 16 (Figura 1-16 e Figura 2-3) é o embrião de 160 minutos após a primeira clivagem; nesse estádio, há a primeira clivagem do quarteto de micrômeros, 1a-1d, que não jazem sobre os macrômeros, mas sobre os sulcos formados. Biomphalaria glabrata, assim como as outras espécies estudadas, possuem a clivagem anti-horária.

Em B. tenagophila, com a técnica de microscopia eletrônica de varredura Watanabe (1997), observou-se que o primeiro micrômero a se dividir foi o 1d, seguido de 1a, 1b e 1c; essa observação foi a

primeira a ser detectada nesse estádio (Figuras 3-1A, 3-1B, 3-1C e

3-1D). No sulco do pólo animal, os micrômeros 1a e 1c estão unidos, enquanto no vegetativo 1B se une com 1D.

Quando o micrômero atinge o estádio 17 (Figura 1-17), 165 minutos após a primeira clivagem do ovo (estádio 1B), observa-se o arredondamento dos blastômeros e em seguida os estádios 18 (173 minutos após o estádio 1B) e 19 (181 minutos após o estádio 1B).

Nesses estádios (Figuras 1-18 e 1-19), ocorre o aumento da cavidade de clivagem entre os blastômeros.

Quarta Clivagem

Com a clivagem de 1A-1D, para 2a-2d, 2A-2D e mais os micrômeros 1a-1d, o embrião ficou com 12 blastômeros: 8 micrômeros e 4 macrômeros.

Nas Figuras 1-20 e 2-4, observa-se o embrião de três horas e cinqüenta minutos após a primeira clivagem do ovo. O segundo quarteto de micrômeros 2a-2d se separa dos macrômeros no

sentido sinistro (Figura 2-4), o embrião atingindo 12 blastômeros.

Quinta Clivagem

Neste estádio há o total de 16 blastômeros: 12 micrômeros e 4 macrômeros =1a 1 1 2 2-1d , 1a-1d, 2a-2d, 2A-2D.

A quinta clivagem ocorre cinco horas após o estádio 1B; o primeiro quarteto de micrômeros, que é denominado ectômeros, (são blastômeros que dão origem ao ectoderma) é o quadrante que se

divide no sentido dextrorso, originando 16 blastômeros (Figura 2-5).

Sexta Clivagem

Os seguintes blastômeros formam este estádio:

1a1 1 2 2-1d , 1a-1d,

2a1 1 2 2-2d 2a-2d,

3a-3d, 3A-3D= 24 blast.; 20 micrômeros e 4 macrômeros.

A sexta clivagem ocorre seis horas após o estádio 1B, os quartetos 2a-2d e 2A-2D se clivam ambos no sentido sinistrorso, completando 24 blastômeros. Nesse estádio, o embrião entra em ‘repouso’, como em outras espécies estudadas, por exemplo: Planorbis trivolvis, Physa fontinalis e Lymnaea stagnalis, permanecendo nesse estádio

por cerca de três horas (Figura 2-6).

Na Figura 2-7 estádio de 24 blastômeros, quando se visualiza do pólo vegetativo, cerca de sete horas após o estádio 1B.

Estádio de 25 blastômeros:

1a1 1 2 2-1d , 1a-1d,

2a1 1 2 2-2d , 2a-2d,

3a-3d, 3A-3C, 4D e 4d = 25 blast.; 21 micrômeros e 4

macrômeros.

Esse estádio se caracteriza pela divisão do 3D em 4d ou M e 4D,

nove horas após o estádio 1B, atingindo 25 blastômeros (Figura 2-

8).

Nesse estádio, a posição do 4d (M) e o eixo animal-vegetativo indicam o plano mediano de simetria do futuro embrião; o 4d indica a posição dorsal.

Estádio de 33 blastômeros:

1a1 1 2 2-1d , 1a-1d,

2a11 11 12 12 21 21 22 22-2d , 2a-2d , 2a-2d , 2a-2d

3a-3d, 3A-3C, 4D e 4d = 33 blast.; 29 micrômeros e 4

macrômeros.

Na Figura 2-9, um embrião de dez horas após o estádio 1B é mostrado, as duas camadas do segundo quarteto de micrômeros se dividem em 2a 1 1 2 2-2d e 2a-2d, no sentido dextrorso, dando origem ao estádio de 33 blastômeros.

Estádio de quarenta balstômeros:

1a1 1 2 2-1d , 1a-1d,

2a11 11 12 12 21 21 22 22-2d , 2a-2d , 2a-2d , 2a-2d,

3a1 1 2 2-3d , 3a-3d

4a-4d, 4A-4D = 40 blast.; 36 micrômeros e 4 macrômeros.

O estádio de quarenta blastômeros é um embrião um pouco antes de 11 horas após o estádio 1B; os micrômeros 3a-3d e os macrômeros 3A, 3B e 3C se clivam no sentido dextrorso.

Estádio de 45 blastômeros:

Primeiro quarteto

1a11 11-1d (células do centro da cruz),

1a12 12-1d (base dos braços da cruz),

1a2 2-1d-

Segundo quarteto

2a11 11-2d (células terminais dos braços da cruz),

2a12 12-2d

2a21 21-2d,

2a22 22-2d

Terceiro quarteto

3a1 1-3d,

3a2 2-3d

Quarto quarteto

4a-4b, 4c(3 endômeros) 4d (M1 2 +M, 2 mesômeros),

4A-4D = 41 micrômeros e 4 macrômeros.

Na Figura 2-10, observa-se um embrião com 45 blastômeros, visto

do pólo vegetativo, idade de 12 horas após o estádio 1B. A Figura 2-

11 mostra o mesmo embrião da figura anterior, visto pelo pólo animal. O embrião apresenta no pólo animal uma forma de cruz que é característica em anelídeos e moluscos (exceto os cefalópodos). A cruz se compõe de um conjunto de blastômeros do primeiro quarteto de micrômeros e somente a base da cruz é formada pelo segundo quarteto de micrômeros, 2a 11 11-2d. Nos moluscos, em geral, a cruz vai formar toda a parte cefálica do embrião.

A formação do quarto quarteto de micrômeros e a cruz encerram o período das primeiras clivagens em B. glabrata.

Serão descritas as clivagens dos blastômeros em detalhes de mais dois estádios:

Estádio de 64 blastômeros:

1a11 11 12 12 21 21 22 22-1d , 1a-1d , 1a-1d , 1a-1d,

2a11 11 121 121 122 122 211 211 212 212-2d , 2a-2d , 2a-2d , 2a-2d , 2a-2d,

2a22 22-2d,

3a11 11 12 12 2 2-3d , 3a-3d , 3a-3d,

4a1 1 1 1+ 2 2 2 2-4b , 4c , 4d (M M ), 4a-4b , 4c,

4A-4D = 64 blast.; 60 micrômeros e 4 macrômeros.

Na Figura 2-12, observa-se um embrião no estádio em cruz, visto do

pólo animal, e na Figura 2-13 o mesmo é visto do pólo vegetativo, com a idade de 15 horas após o estádio 1B.

Estádio de 83 blastômeros:

1a11 11 121 121 122 122 21 21 22 22-1d , 1a-1d , 1a-1d , 1a-1d , 1a-1d [Figura

2-20],

2a11 11 121 121 122 122 1221 1222 122-2d , 2a-2d , 2a , 2b , 2c , 2c , 2d,

2a211 211 212 212 212 2121 2122 22 22-2d , 2a , 2b , 2c , 2d , 2d , 2a -2d, (25)

3a11 11 111 111 112 112 12 12 121 122 , 3b , 3c , 3d , 3c , 3d , 3a , 3b , 3c , 3c,

3d12,

3a211 211 212 212 22 22-3d , 3a-3d , 3a-3d [Figura 2-24]

4a1 1 11 12 + 2 21 22 2-4b , 4c , 4c , 4d (M M ), 4a-4b , 4b , 4c [Figura 2-1 2

17],

4A-4D = 83 blast.; 79 micrômeros e 4 macrômeros.

O embrião da Figura 2-14 apresenta cerca de 83 blastômeros com 17 horas de idade, ainda com a forma em cruz, que se apresenta

bem visível. Na Figura 2-15, o mesmo embrião se apresenta com a parte ventral, em que se nota os micrômeros do segundo quarteto entre os do terceiro, geração de 2b entre 3a e 3b.

O Primeiro Quarteto de Micrômeros

Na Figura 4, a genealogia do primeiro quarteto de micrômeros é apresentada, desde a primeira clivagem do ovo, correlacionando a idade do embrião com o número de blastômeros.

Estádio de cruz

A cruz em B. glabrata se torna evidente, como já descrito anteriormente, quando o embrião atinge o estádio de 45

blastômeros, 12 micrômeros fazem parte da cruz (Figura 2-11) e a idade de é de 12 horas. Em B. glabrata, no braço direito se encontram descendentes de ‘a’, braço esquerdo os originados de ‘c’, dorsal os de ‘d’ e ventral os de ‘b’.

O centro da cruz é formado pelas células 1a 11 11-1d (células do centro da cruz) e 1a 12 12 11 11-1d (base dos braços da cruz) e 2a-2d (células terminais dos braços da cruz).

Em seguida, o quarteto 1a2 2-1d, o trocoblasto primário se divide cerca de 13 horas após o 1B. Os oito blastômeros descendentes, que são os trocoblastos secundários ou definitivos, nunca se dividirão, localizando-se nos ângulos entre os braços da cruz.

A cruz permanece sem alterar durante três horas, porém há a modificação do aspecto em razão de as células 1a 11 11-1d

penetrarem no embrião (Figura 2-12). O próximo quarteto a se clivar é 1a12 12-1d, embrião contendo 76 blastômeros com 16 horas de idade.

Na Figura 2-14, um embrião com 83 blastômeros é observado, com a clivagem de todas as células basais completas.

As células medianas externas 1a 122 122-1d se localizam entre as células terminais 2a11 11 121 121-2d e as basais 1a-1d. Exceto a célula mediana do braço ventral 1b 122 deste quarteto, o único a se dividir durante a fase larval, os outros permanecem sem se dividir em todo

o estádio larvário (Figuras 2-25 e 2-26).

As células do centro da cruz 1a11 11-1d são as que se dividem em

seguida, no sentido dextrorso. Na Figura 2-16, nota-se um embrião com 97 blastômeros, com a roseta apical 1a 111 111-1d e a roseta periférica 1a112 112-1d, totalizando vinte micrômeros os que fazem parte da cruz, idade de 18 horas. Durante duas horas a cruz permanece com a mesma configuração.

Quando o embrião atinge cerca de 130 blastômeros, a cruz ainda é visível e é formada por 24 blastômeros, idade de 21 horas e trinta minutos. Nota-se que, após um período de nove horas e trinta minutos, o número de blastômeros aumenta para 36. A cruz nesse estádio é constituída pelo centro, braço dorsal e ventral, lateral

direito e esquerdo do embrião (Figura 2-19).

Centro da cruz:

1a111 111-1d (células da roseta apical),

1a112 112-1d (células da roseta periférica).

Braço dorsal:

1d1211 (célula basal),

1d1212 (célula mediana interna),

1d122 (célula mediana externa),

2d11 (célula terminal).

Braço ventral:

1b1211 (célula basal)

1b1212 (célula mediana interna),

1b122 (célula mediana externa),

2b11 (célula terminal).

Braço lateral direito:

1a1211 (célula basal)

1a1212 (célula mediana interna),

1a122 (célula mediana externa),

2a11 (célula terminal).

Braço lateral esquerdo:

1c1211 (célula basal),

1c1212 (célula mediana interna),

1c122 (célula mediana externa),

2c11 (célula terminal).

As etapas do desenvolvimento dos braços serão realizadas separadamente, por apresentarem diferenças.

Centro da cruz

O centro da cruz permanece sem se dividir durante dez horas, quando o quarteto 1a112 112-1d (células da roseta periférica) se

divide, com a idade de 24 horas (Figura 2-21). Nos estádios que se seguem, há alteração na forma dos componentes das células do centro da cruz, culminando com o aumento dos seis blastômeros

1a 111 111 1121 1121-1d , 1a e 1b (Figuras 2-23 e 2-24).

Braço dorsal da cruz No embrião com a idade de 21 horas e trinta minutos, o blastômero

1d 121 se divide em ângulo reto em relação ao braço dorsal (Figura

2-19 1211 1212 ); os descendentes 1d e 1d ficarão um sobre a outro.

Em L. stagnalis, entretanto, Verdonk (1965) verificou que a clivagem ocorreu paralelamente à direção do braço dorsal e as células 1d1211 e 1d1212 122 permaneceram uma ao lado da outra. As células 1d (célula mediana externa) e 2d11 (célula terminal) permanecem sem se dividir. Em 122 Physa (Wierzejski, 1905), o blastômero 1d se divide mais uma vez.

Braços laterais da cruz

No embrião com 21 horas de idade, as células 1a 121 (célula basal direita) 1c121 (célula basal esquerda) se dividem em ângulo reto aos

seus braços (Figura 2-19).

As células basais 1a 1211 1211 e 1c estão em contato com as células da roseta apical, enquanto as células medianas internas 1a1212 e 1c1212 estão situadas entre as células basais e as células medianas

externas 1a122 122 e 1c (Figura 2-19).

As células basais 1a 1211 1211 e 1c são as próximas a se dividirem, com 24 horas de idade, num plano paralelo ao eixo longitudinal dos braços. Do mesmo modo que as descritas anteriormente, as células medianas internas 1a 1212 1212 e 1c se dividem às 26 horas de idade

(Figura 2-22).

As células medianas internas 1a12122 12121 e 1c se dividem com trinta horas de idade. Entretanto, as células descendentes 1a 12121 e

1c12122 permanecem sem se dividir até as 36 horas de idade (Figura

2-25). Cada braço possui sete células por cerca de seis horas, as células medianas externas 1a122 122 11 11 e 1c e as terminais 2a e 2c não se dividem mais.

Braço ventral da cruz A célula basal 1b 121 se divide uma hora antes das suas correspondentes dos braços dorsal e laterais. As células 1b 1211 e 1b 1212 irão se situar uma sobre a outra na direção longitudinal do

braço ventral (Figura 2-19).

A célula terminal 2b11 se divide no sentido meridional quando o embrião se encontra com 21 horas e trinta minutos de idade. Nessa fase o embrião se apresenta pela primeira vez com a simetria bilateral no seu pólo animal; as células correspondentes nos outros braços não se dividem. A próxima a se dividir é a célula 1b1212 em

1b 12121 12122 e 1b (Figura 2-20).

As células 1b12121 12122 e 1b se dividem quando o embrião se encontra com trinta horas de idade. Antes dessa clivagem, essas células apresentam uma pequena superfície de contato e, após a

divisão, ficam completamente separadas (Figura 2-23). A célula 1b 122 é a próxima no plano meridional a se dividir e é a única célula mediana externa da cruz que continua a se segmentar

posteriormente ( 1221 1222 Figura 2-24 ). As células 1b e 1b, que estão unidas após a divisão, passarão a se afastar uma da outra,

permanecendo ligadas por uma pequena superfície (Figura 2-25). As células terminais 2b 111 112 e 2b se alojarão logo acima do blastósporo, futura região da boca. As células 1b1221 1222 e 1b nunca se dividirão em L. stagnalis, enquanto emB. glabrata continua a divisão às 43 horas de idade. Essas células podem ser distinguíveis das outras que a limitam por se apresentarem ladeando 1b 1211 e por

serem maiores que as descendentes de 1b1212 (Figura 2-26).

O Segundo Quarteto de Micrômeros

Na Figura 5, a genealogia do segundo quarteto de micrômeros é apresentada desde a primeira clivagem do ovo.

No estádio de quarta clivagem, o embrião com 12 blastômeros se encontra presente pela primeira vez com o segundo quarteto de micrômeros 2a-2d; este se cliva no estádio de 24 células (2a 1 1 -2d e 2a 2 2 -2d ). Em seguida, as células terminais da cruz se originam (2a11 11 12 12 21 21 -2d ), seguidas de outras medianas (2a -2d e 2a -2d) situadas lado a lado. A camada mais inferior é formada por 2a 22-2d 22, que se encontra em contato com os endômeros, estádio de 33

blastômeros (Figura 2-9). As clivagens que se seguem ocorrem nos blastômeros: 2d 21 211 212 12 12 (2d e 2d ) inicialmente, seguido de 2a -2d (2a121 121 122 122 21 21 21 211 211 212-2d e 2a-2d ) e 2a , 2b e 2c (2a-2c e 2a -2c212 11 11 ). O quarteto de células terminais dos braços da cruz 2a-2d, as células 2a 11 11 11 , 2c , 2d não se dividirão e farão parte da vesícula cerebral e a 2b 11 se dividirá mais uma vez e fará parte do prototroco. Ao final das clivagens descritas, o embrião terá o total de 64 blastômeros, sendo 24 células pertencentes ao segundo quarteto de micrômeros.

Em seqüência, os seguintes quadrantes irão se clivar, embora não

sincronicamente, como se observa na 212 212 122 Figura 5 : 2a -2d , 2a-

2c122 211 211 121 121 22 22 22 , 2a-2d , 2a-2d e 2a-2d . Os blastômeros 2a-2d 22 22 o 2b se dividem antes dos outros três blastômeros. Nesse quadrante, foram observadas as clivagens até 24 horas de idade e com embrião de 124 blastômeros.

Foi interessante notar que as células M1 e M2 (mesoblasto primário) estiveram visíveis na superfície do embrião no pólo vegetativo, enquanto o blastômero 2d 22 permaneceu sem se clivar e só se dividiu quando o mesoblasto primário já estava dentro do embrião. As três células restantes do mesmo quadrante 2a 22 22-2c são os

estomoblastos (Figura 2-17) (que fazem parte da região periférica do blastósporo e que mais tarde vão formar o estomodeu).

O Terceiro Quarteto de Micrômeros

Na Figura 6, a genealogia do terceiro e quarto quarteto de micrômeros é apresentada desde a primeira clivagem do ovo.

A primeira clivagem no terceiro quarteto de micrômeros acontece quando o embrião atinge 24 blastômeros. Em seguida, 3a-3d se divide originando 3a 1 1 2 2-3d e 3a-3d, no estádio de quarenta células. Aqui observa-se que os quartetos não se dividirão sincronicamente. Na região ventral, as células 3a 1 1 e 3b se dividem mais lentamente que 3a2 2 1 e 3b . Entretanto, na parte dorsal acontece o reverso: 3ce 3d 1 2 2 se dividem antes que 3c e 3d, os quais permanecem sem se dividir por um longo período e, após completarem 18 horas de idade, formam: 3c 21 22 21 22 , 3c , 3d e 3d.

O quarteto 3a1 1 11 11 12 12-3d se divide dando origem a 3a-3d e 3a-3d (divisão assincrônica); estes irão formar 3c111 111 112 112 , 3d e 3c , 3d inicialmente, e, mais tarde, 3c121 121 122 122-3d e 3c , 3d (estádio de 76 células), os outros dois 3a 111 111 112 112 121 121 , 3b e 3a , 3b e 3a , 3be 3a 122 122 , 3b (estádio de 124 células).

Um embrião com um total de 130 blastômeros possui 36 células pertencentes ao terceiro quarteto de micrômeros.

Endômeros

Formado do quarto quarteto de micrômeros e três micrômeros do quinto quarteto

Na Figura 6, a genealogia do quarto e três do quinto quarteto de micrômeros é apresentada.

Quando o embrião atinge 25 blastômeros, o 3D se cliva em 4D e 4d (M); os outros três (3A-3C) irão se clivar somente no estádio de quarenta blastômeros, em 4a, 4b e 4c (endômeros), separando-se

dos macrômeros 4A, 4B e 4C (Figura 2-10). Os endômeros se clivam no sentido bilateral quando o embrião atinge 64 blastômeros. Nesta fase, as células 4a 1 2 1 2 1 2 , 4a , 4b , 4b 4c e 4c margeiam os macrômeros tomando forma de ferradura. O primeiro endômero a se dividir é 4a1, com 16 horas de idade, no sentido sinistrorso, e o embrião possui 76 células. Em seguida, 4c2 se divide às 17 horas de idade, no sentido dextrorso; neste estádio, o embrião atinge oitenta células. Após este estádio, o 4b1 se cliva no sentido sinistrorso, o embrião alcançando 83 blastômeros. A seguir, ocorre a clivagem nas células 4a2 2 e 4b, no sentido sinistrorso, enquanto o 4c1 o faz no sentido dextrorso, e o embrião atinge, agora, 92 blastômeros. Os endômeros 4a11 21 22 , 4b , 4b se clivam bilateralmente.

Em B. glabrata os macrômeros permanecem sem se dividir até o embrião atingir 92 células. A partir deste estádio surge um quinto micrômero, o 4A, que se divide com cerca de 18 horas de idade, seguido por 4B; o 4C se divide com vinte horas de idade, quando o embrião atinge 111 blastômeros. Até o embrião atingir 130 células

foi observada a presença de 5a, 5b e 5c (Figura 2-18).

Mesoblasto Primário

O período de repouso é uma característica dos moluscos em geral quando o embrião atinge o estádio de 24 blastômeros. Este repouso pode se prolongar por três horas, quando então o molusco retoma a sua atividade de clivagem com o macrômero 3D, dando origem ao

mesoblasto primário M (4d) (Figura 2-8). A próxima clivagem nesse blastômero ocorre quando o embrião atinge 45 células. Inicialmente

os mesoblastos M1 e M2 são evidentes na sua superfície (Figura 2-

10), aos poucos os dois blastômeros vão penetrando no embrião até alcançarem uma forma triangular bem reduzida na superfície,

ficando visíveis até o estádio de 107 células (Figura 2-17).

A linhagem celular no pólo vegetativo em B. glabrata foi estudada somente até o estádio de 130 células, quando as células M1 e M2 desapareceram da superfície. O pólo animal, onde fica a região cefálica, entretanto, foi estudado até o estádio de véliger.

Gastrulação

Cerca de 24 horas após a primeira clivagem do ovo (Figura 2-21), há o início da gastrulação, que se caracteriza pelo final da clivagem e início do crescimento, diferenciação e movimentação celular. O tipo de gastrulação nesse caramujo ocorre por invaginação ou endobolia. Os pólos animal e vegetativo começam a se transformar e o embrião modifica sua forma de arredondada para achatada,

quando observado em perfil (Figuras 2-22, 2-23, 2-24 e 2-25, visualizada do pólo animal). A ordem de penetração dos blastômeros seria:

5A-5C, 4D = macrômeros

5a-5c

4a-4d e seus descendentes.

À medida que os blastômeros vão penetrando no interior, há formação de uma fenda que inicialmente está situada na região oposta ao centro da cruz. Entretanto, com o desenvolvimento embrionário, há o deslocamento da abertura do blastósporo para a direção ventral do embrião. Essa abertura vai se desenvolvendo e transformando-se em fenda. O blastósporo se comunica com o exterior até 39 horas e se fecha, permanecendo a imagem virtual; ao final da gastrulação haverá o aparecimento da boca neste local do blastóporo. A figura conspícua da cruz se transforma ao final da gástrula, pois o braço ventral se alarga.

Trocófora

É a primeira fase larval de B. glabrata, que se caracteriza pela formação do prototroco (região do corpo que separa em duas partes: a região pré-trocal e pós-trocal), que é constituído de duas fileiras de células situadas acima da boca, com cílios recobrindo toda sua superfície. Nesta fase, ocorre o início da movimentação larval, que a princípio é muito lenta e mais tarde vai se tornando mais rápida. O prototroco separa o corpo em duas partes, a região pré-trocal e a região pós-trocal. Na primeira região, encontra-se a futura região cefálica, com a presença de uma placa apical (formada de sete células), duas placas cefálicas (margeando a placa apical, futura região dos olhos e tentáculos) e da vesícula cerebral (formada de 12 células).

Na região pós-trocal encontra-se a boca, situada abaixo da placa apical, e na região oposta encontra-se a glândula da concha.

Essa fase larvária, como em outros pulmonados, transcorre dentro da cápsula do ovo. As diferentes regiões cefálicas serão descritas separadamente.

Prototroco (Pr)

O prototroco é uma estrutura que divide a larva em região pré-trocal e pós-trocal, completamente coberta de cílios. Em B. glabrata é constituída de duas fileiras celulares, uma superior formada pelas células terminais do braço ventral da cruz 2b 111 112 e 2b mais as células ligadas à sua direita, 1a21 22 21 e 1a , e à sua esquerda, 1be

1b 22 (Figura 2-27). A segunda fileira, que se encontra situada logo acima da boca, é formada pelas células descendentes de 2b 122 e 2b 2 12 211 , que se dividem mais duas vezes, e pelas células 2b e 2b 121.

A primeira fileira do trocoblasto é formada por:

Células terminais do braço ventral da cruz:

2b 111 112 e 2b ;

Células do trocoblasto anterior:

1a 21 22 e 1a,

1b 21 22 e 1b.

A segunda fileira do trocoblasto é formada por:

Células do segundo quarteto de micrômeros:

2b 211 121 e 2b;

Descendentes das células

2b 212 122 e 2b (oito células de cada lado).

Na Figura 3-2 observa-se uma trocófora jovem de B. tenagophila com os cílios na região do prototroco.

O prototroco em B. glabrata é formado por uma primeira fileira de seis células e uma segunda fileira de 16 células, obtendo-se, portanto, um conjunto de 24 células no total. Comparando-se com L. stagnalis, que possui somente uma fileira com oito células, como em Acmaea, Haliotis, Aplysia, Trochus e Umbrella, B. glabrata tem o prototroco bem desenvolvido com duas fileiras, como em Polyplacophora, Dreissensia, Patella, Paludina, Pteropoda; outros possuem três fileiras, como Dentalium e Bithynia ou até mais, como Crepidula (Raven, 1958). O prototroco é que dá o movimento rotacional da larva dentro da cápsula.

Placa Apical (PA)

A placa apical é formada por um conjunto de sete células relativamente volumosas, cobertas de microvilosidades, situada

entre as placas cefálicas, no meio da região cefálica. (Figura 2-28).

As quatro células dorsais são formadas pelas células da roseta apical 2a 111 111-2d com 18 horas de idade, permanecendo sem se dividir até a eclosão. As células ventrais da roseta periférica 1a 1121-1b 1121 fazem parte da placa apical, situando-se ventralmente às células da roseta apical. A célula basal do braço ventral da cruz 1b 1211 faz parte da placa apical em B. glabrata, assim como em L. stagnalis (Verdonk, 1965). Em Planorbis, Holmes (1900) verificou que tal célula pertence ao prototroco.

As sete células da Placa Apical:

Células da roseta apical 2a111 111-2d;

Células ventrais da roseta periférica 1a1121 1121 e 1b;

Célula basal do braço ventral da cruz 1b1211.

Placas Cefálicas (PC)

As placas cefálicas são formadas por duas regiões situadas ao redor da placa apical, e é onde irão se desenvolver os olhos e tentáculos. As duas regiões podem ser caracterizadas pelas

formações de grupos de células, como visto nas Figuras 2-24 a 2-

30, todos constituídos pelo primeiro quadrante de micrômeros.

Cada placa cefálica se compõe de (Figura 2-26):

Placa cefálica da Placa cefálica da

direita esquerda

Parte 1d1121 1121 1c

dorsal 1122 1122 1d 1c

1a12111 12111 1c

Parte 1a12112 12112 1c

central 12121 12121 1a 1c

1a12122 12122 1c

 

ventral Parte 12121 12122 1b 1b 1b1122 1122 1b

1b1221 1222 1b

Quanto ao tamanho, número e posição, essas células parecem ser simétricas, apesar de terem sido derivadas de formas diferentes. A parte cefálica do lado direito se origina de três quadrantes (a, b e d), enquanto o do lado esquerdo (b e c), isso em razão da posição do quadrante, que está situado à direita do eixo mediano da larva.

A origem dessas células em B. glabrata é a mesma que em Planorbis (Holmes, 1900); entretanto, em L. stagnalis (Verdonk, 1965), as células da parte mediana externa do braço ventral da cruz 1b 1221 1222 e 1b fazem parte do prototroco.

Vesícula Cerebral (VC)

A vesícula cerebral é formada por um conjunto de doze células relativamente grandes, situadas na região dorsal das placas cefálicas e da placa apical. O embrião com a idade de 21 horas e trinta minutos já possui todas as 12 células, que são originárias dos

braços da cruz (Figura 2-26).

A vesícula cerebral é formada por:

• Células do braço dorsal da cruz

1d 211 1212 e 1d

1d 122 11 e 2d;

• Trocoblasto posterior ou dorsal

1c21 22 e 1c

1d 21 22 e 1d;

• Células dos braços laterais da cruz

1a 122 11 e 2a

1c122 11 e 2c.

Em B. glabrata a vesícula cerebral tem a mesma constituição celular de Planorbis e Lymnaea.

Véliger

Os estádios de véliger jovem (96 horas, Figura 2-29), véliger (120

horas, Figura 2-30) e ‘hippo’ ( estádio utilizado por Raven, 1949 por ter semelhança com a cabeça de um hipopótamo) (144 horas de idade) em B. glabrata ocorrem ainda dentro da cápsula do ovo. O estádio de véliger jovem se apresenta caracterizado pela formação da concha, que começa a cobrir uma parte do corpo. O prototroco evolui para o velum, que é um órgão responsável pela movimentação intensa da larva no interior da cápsula.

No estádio de trocófora, a larva apresenta a formação da concha ou a glândula da concha no lado oposto à boca (blastósporo). No véliger, começa a se evidenciar o início da assimetria pelo desvio da concha, que sofre torção para o lado direito da larva; com o desenvolvimento o corpo vai sendo recoberto na direção anti-horária.

As células que compõem a placa apical e a vesícula cerebral permanecem sem alteração desde a trocófora.

Em véliger, as células que compõem o velum ficam comprimidas entre as placas cefálicas e as células acima da região da boca. As placas cefálicas contêm células menores, em razão das divisões sucessivas e apresentam a futura região do olho e do tentáculo. A região do pé nesse estádio está bem desenvolvida. Em L. stagnalis, o gânglio cerebral se origina na região tentacular.

No véliger mais desenvolvido ou ‘hippo’ (Raven, 1949), o aparecimento do tentáculo bem desenvolvido e dos olhos, do enrolamento e a cobertura do corpo em quase a totalidade pela concha, ainda certas estruturas como a placa apical e a vesícula cerebral são visíveis. A 25oC, a eclosão dos jovens caramujos pode ocorrer a partir de seis dias ou 144 horas de idade.

Segundo investigação de Raven (1958), os primeiros três quartetos de micrômeros produzirão toda a ectoderme. A parte pré-trocal da ectoderme formada pelo primeiro quarteto de micrômeros desenvolverá mais tarde toda a região cefálica do adulto.

A região pós-trocal ectodérmica deriva do segundo e terceiro quartetos de micrômeros. Entre os ectômeros, o 2d se denomina primeiro somatoblasto, que formará a placa somática, da qual deriva grande parte do corpo ectodérmico ventral e dorsal, incluindo a concha e o pé. O segundo e o terceiro quartetos de micrômeros formarão o mesênquima larval (ectomesoderma).

O blastômero 4d é o segundo somatoblasto que, além da endoderma, forma o mesoderma primário. A endoderma se forma também dos blastômeros 4a-4c e dos macrômeros 4A-4D.

As três espécies de Biomphalaria (B. glabrata, B. tenagophila e B. straminea) estudadas até o presente não apresentaram diferenças no seu desenvolvimento embrionário.

Figura 4 – Desenvolvimento do primeiro quarteto de micrômeros

Figura 5 – O desenvolvimento do segundo quarteto de micrômeros

Figura 6 – O desenvolvimento do terceiro e quarto quarteto de

micrômeros

Embriologia experimental

Efeito Morfogenético da Cafeína em Embriões de B. glabrata

A cafeína é conhecida como uma substância mutagênica, de acordo com vários pesquisadores que utilizaram essa droga em vários sistemas, como: Drosophila, em que a cafeína age causando mutações e aberrações cromossômicas (Andrew, 1959; Mittler, Mittler & Owens, 1967). Em outros sistemas, como os de camundongos e em outros organismos, os autores encontraram efeitos teratogênicos (Nishimura & Nakai, 1960; Kihlman, 1977).

Trabalhos utilizando a cafeína foram realizados em B. glabrata (Kawano, Chaves & Simões, 1979), obtendo-se diversas malformações teratomórficas de acordo com a concentração e a idade do embrião tratado. Um trabalho de Kawano & Simões (1987) mostrou que a cafeína atuou em embriões durante o desenvolvimento embrionário, numa análise de linhagem celular. Foi utilizada somente uma dose da cafeína, 0,1%, em embriões no estádio de primeira clivagem do ovo. As desovas foram mantidas a 25 oC por 24 horas e, ao término, foram lavadas três vezes e recolocadas em placas de Petri. Os embriões foram fixados em intervalos de 24 horas, pela técnica de AgNO a 0, 75%. Em 3 intervalos de 24 horas foram fixados cinco grupos de embriões de 24 a 120 horas após a primeira clivagem do ovo. Os grupos 1 e 5 continham vinte embriões e os grupos 2, 3 e 4, trinta embriões. Os desenhos dos embriões foram realizados com base em fotografias tiradas de embriões fixados, e complementadas por uma câmara clara da Zeiss.

Os resultados experimentais apresentados correspondem a embriões com malformações, analisadas através do estereomicroscópio.Os controles foram mantidos nas mesmas condições experimentais, mas com água filtrada.

Grupo I – embrião de 24 horas (Figuras 2-31-33)

O embrião nesse estádio é uma gástrula bem desenvolvida, com a formação da cruz que é caracterizada pelos micrômeros originados do primeiro quarteto. Essa cruz irá formar quase a totalidade da cabeça do animal, pois somente as células terminais da mesma são

formadas pelo segundo quarteto de micrômeros. Na Figura 2-31,

observa-se um embrião-controle, enquanto na Figura 2-32 e na

Figura 2-33 são apresentados embriões tratados com cafeína, que se apresentam com um padrão anormal de arranjo das células e bem menos desenvolvidos em relação ao controle.

Grupo II – embrião de 48 horas (Figuras 2-34-41)

Esse grupo foi fixado 48 horas após a primeira clivagem do ovo e se

encontra no estádio de trocófora jovem. Na Figura 2-34, de um embrião-controle com duas fileiras de células, o prototroco (primeira fileira: 2b 111 112 21 22 21 22 , 2b , 1a , 1a , 1b e 1b; segunda fileira: descendentes das células 2b 121 211 122 212 , 2b , 1b e 2b) se apresenta logo acima da região da boca.

Acima da região do prototroco, encontra-se a região pré-trocal, formada por três regiões distintas: a placa apical, as placas cefálicas e a vesícula cerebral. A placa apical está situada entre as duas placas cefálicas. As duas placas cefálicas, por sua vez, formarão a região dos olhos e dos tentáculos. A vesícula cerebral se encontra na parte dorsal das regiões anteriormente descritas, e é formada por um conjunto de 12 células. A região abaixo do prototroco é a pós-trocal, onde se encontram a boca na parte ventral do embrião e a glândula da concha, na região oposta.

Na Figura 2-35, um embrião exposto no estádio de trocófora é apresentado, com três grupos de células menores, uma situada na parte dorsal da cabeça. Normalmente nesse estádio se encontram dois grupos, um em cada lado, como é observado no controle da

Figura 2-34.

Na Figura 2-36 está exposto um embrião com as placas cefálicas unidas por uma ponte celular, formando uma figura em forma de ferradura. A ponte em ferradura é formada pelas células 1d1211 e 1d 1212, que normalmente não se dividem, mas que nesse caso continuaram a se dividir.

Na Figura 2-37, tem-se um embrião com a placa apical formada por sete células e a vesícula cerebral bem desenvolvida, mas com retardo no desenvolvimento, como nos embriões anteriores.

Na Figura 2-38 há um embrião totalmente anormal após o tratamento com a cafeína, apresentando as células da placa apical e da vesícula cerebral.

Na Figura 2-39, observa-se um embrião com assimetria na região cefálica, sendo a parte direita menos desenvolvida que a parte esquerda e ao mesmo tempo apresentando uma irregularidade nas posições das células.

O embrião da Figura 2-40 se apresenta com posição irregular das quatro células 1d 1211 1212 122 11 , 1d , 1d e 2d, que normalmente estão situadas acima da placa apical.

Na Figura 2-41 observa-se um embrião com a região das placas cefálicas unidas, em forma de ferradura, e um estádio um pouco

mais desenvolvido que o embrião da Figura 2-36.

Grupo III – embrião de 72 horas (Figuras 2-42-46)

Na Figura 2-42, observa-se um embrião-controle com 72 horas após a primeira clivagem do ovo com as três regiões na parte cefálica bem delimitadas.

A Figura 2-43 apresenta um embrião com assimetria na região cefálica, além de um retardo no desenvolvimento em relação ao controle.

Na Figura 2-44, tem-se um embrião com a boca ligeiramente desviada à direita e uma fileira de quatro células formando a placa apical.

O embrião da Figura 2-45 se apresenta com uma fileira de células acima da placa apical.

Na Figura 2-46, uma exogástrula é observada apresentando a conexão das duas placas cefálicas na parte ventral do embrião.

Grupo IV – embrião de 96 horas (Figuras 2-47-50)

Na Figura 2-47 tem-se um embrião controle de 96 horas após a primeira clivagem no estádio de véliger jovem. Esse embrião se caracteriza pelas três regiões anteriormente descritas, porém com as placas cefálicas mais desenvolvidas e a presença dos olhos e tentáculos, da cavidade da boca e da concha que começa a cobrir seu corpo. O prototroco se desenvolve em velum, um órgão de locomoção da larva.

Na Figura 2-48 tem-se um embrião com assimetria no padrão cefálico, além de um expressivo retardo no desenvolvimento.

Na Figura 2-49, observa-se um embrião com a assimetria na região

cefálica apresentando uma redução do lado esquerdo; na Figura 50 o embrião se apresenta com a redução cefálica no lado direito, tem 13 células na vesícula cerebral.

Grupo V – embriões de 120 horas (Figuras 2-51-56)

Ainda nessa fase, os embriões estão dentro da cápsula do ovo. Na

Figura 2-51, um embrião-controle em véliger mais desenvolvido ou estádio de ‘hippo’ é observado. Nessa fase, as estruturas como a placa apical e a vesícula cerebral ainda são evidentes e os olhos e tentáculos são bem desenvolvidos, assim como a concha, a boca e os pés.

Na Figura 2-52, um embrião tratado se apresenta com a formação de duplicação direita dos olhos, uma ponte de células entre a placa apical e a vesícula cerebral, que é formada por dez células, em vez de 12.

Na Figura 2-53 é observado um embrião contendo a duplicação esquerda dos olhos.

Na Figura 2-54, uma monoftalmia (formação de um olho) destra é

observada, enquanto a Figura 2-55 mostra um embrião com a monoftalmia sinistra, a vesícula cerebral em número de dez células e a presença de uma ponte entre as placas cefálicas, havendo uma divisão das células 1d 1211 1212 , 1d.

Na Figura 2-56, um embrião tratado com cafeína tem sua região cefálica apresentando uma monoftalmia sinistra com presença de células supernumerárias na placa apical.

O efeito da cafeína em embriões de B. glabrata foi previamente descrito por Kawano, Chaves & Simões (1979), e todas as malformações cefálicas foram designadas como teratomórficas.

A análise comparativa entre os embriões-controles em relação aos malformados tratados com a cafeína foi possível, em razão do estudo da linhagem celular apresentada anteriormente por Camey e Verdonk (1970).

Ovos de Lymnaea stagnalis (Raven et al., 1947; Verdonk, 1965) tratados com LiCl ou tratados com choque térmico (Geilenkirchen, 1966; Verdonk & de Groot, 1970) foram afetados especialmente perto do pólo animal, resultando no desvio do padrão cefálico. Verdonk (1965) demonstrou que o LiCl é responsável por um desvio na clivagem, num período crucial. Algumas células que permaneceriam sem se dividir, no desenvolvimento normal, continuam se dividindo e por outro lado células que se dividiriam, no seu desenvolvimento normal, param de se dividir.

Estudos mostraram que os embriões de B. glabrata tratados com cafeína tiveram retardo no desenvolvimento; resultados similares foram obtidos com o inseto Telmatoscopus albipunctatus (Sehgal, Simões & Jurand, 1977).

Podem-se sumariar as principais anomalias obtidas pela cafeína em embriões de B. glabrata:

retardo na clivagem de algumas células, ou uma divisão alterada, causando assimetria nas placas cefálicas;

vesícula cerebral formada por 13 células;

presença de células supernumerárias na placa apical;

ocorrência de malformações cefálicas tais como: monoftalmia destra ou sinistra e duplicação de um dos olhos, direita ou esquerda;

formação de exogástrula (a não formação da gástrula).

Foi interessante verificar que a cafeína atuou na mortalidade, em estádios mais iniciais do desenvolvimento embrionário de B. glabrata (Kawano, Chaves & Simões, 1979), ou seja, em estádios de intensa divisão celular; em oposição aos embriões tratados com sulfato de nicotina (Kawano, Simões & Marques, 1993), cuja substância atuou em estádios mais avançados da diferenciação celular, como na gástrula e na trocófora jovem. As anomalias cefálicas foram obtidas com o sulfato de nicotina, quando os embriões foram submetidos ao tratamento no estádio entre a quarta clivagem e a blástula.

Malformações Embrionárias como Biomarcadores de Mutagenicidade: o teste do letal dominante em Biomphalaria glabrata para o biomonitoramento de poluentes mutagênicos

Águas poluídas são, geralmente, misturas complexas de muitas substâncias químicas, mas a análise de algumas fontes de poluição mostrou que agentes mutagênicos estão presentes em muitas delas (Claxton, Houk & Hughes, 1998; White & Rasmussen, 1998).

A contaminação ambiental por poluentes mutagênicos traz riscos tanto para os ecossistemas como para o homem, já que esses compostos podem danificar o material genético de qualquer organismo. Entretanto, os efeitos da indução de mutações têm significados diferentes em ecotoxicologia e toxicologia (Wurgler & Kramers, 1992). O desenvolvimento de neoplasias por indução de mutações somáticas levará à perda de alguns indivíduos, o que não será um evento crítico para a manutenção da maioria das populações naturais expostas. Já mutações germinativas podem levar à perda de gametas, morte fetal e malformações embrionárias, afetando diretamente o potencial reprodutivo (Depledge, 1998). Portanto, se para a toxicologia humana são indesejados tanto os efeitos somáticos quanto os germinativos da indução de mutações, a proteção dos ecossistemas contra a ação de mutagênicos ambientais requer preferencialmente o desenvolvimento de testes que detectem mutações germinativas.

Invertebrados têm sido utilizados em alguns estudos de monitoramento de poluentes mutagênicos (Nacci et al., 1992; Burgeot, His & Galgani, 1995; Steinert et al., 1998). A maior parte dos estudos de biomonitoramento in situ, entretanto, tem sido feita em peixes e, na sua maioria, em espécies marinhas. Levando-se em conta, ainda, a importância ecológica dos invertebrados, que representam cerca de 90% das espécies aquáticas (Barnes, 1990), existe uma carência de dados sobre o efeito de poluentes mutagênicos em invertebrados de água doce.

Caramujos do gênero Biomphalaria podem ser considerados bons bioindicadores para estudos de biomonitoramento. O gênero tem ampla distribuição geográfica; é representado no Brasil por dez espécies distribuídas por todos os estados (Carvalho, 1992), é de fácil coleta e baixa dispersão. Além disso, outras vantagens fazem desse sistema um bom modelo para estudos em laboratório. Os caramujos são fáceis de criar e requerem pouco espaço; sob condições controladas, podem se reproduzir durante todo o ano. Possuem um ciclo de vida relativamente curto: um acompanhamento de ovo a ovo, ou seja, do início do desenvolvimento até a reprodução pode ser feito em dois meses em B. glabrata e, sendo o gênero hermafrodita, diferenças entre os sexos não ocorrem.

Embriões de Biomphalaria constituem um bom sistema experimental, que tem sido empregado em vários estudos toxicológicos, utilizando como biomarcadores a mortalidade e as malformações embrionárias. Já foram estudadas substâncias como o sulfato de nicotina, que induziu malformações em embriões de B. glabrata (Kawano, Simões & Marques, 1993); extratos vegetais, como os extratos de Gomphrena macrocephala, Holocalix glaziovii e Riedeliella graciflora (Yamamoto et al., 1996), em Stevia rebaudiana (Kawano & Simões, 1986) e em Laurus nobilis (Ré & Kawano, 1987); bem como agentes mutagênicos como a cafeína e a radiação gama: a cafeína induziu malformações (Kawano, Chaves & Simões, 1979) e a radiação gama, aberrações cromossômicas e malformações em embriões de B. glabrata (Okazaki & Kawano, 1991).

Malformações embrionárias podem ser usadas como biomarcador em testes de mutagenicidade, já que são um dos efeitos da indução de mutações em células germinativas. Para utilizar apropriadamente esse biomarcador, é necessário, entretanto, poder se distinguir as malformações induzidas por efeitos mutagênicos nas células germinativas daquelas induzidas por efeitos tóxicos ou teratogênicos. Para isso, é possível usar uma estratégia similar à do teste do letal dominante em roedores, que detecta mutações em células germinativas (Bateman, 1966). Nessa técnica, ratos ou camundongos machos são expostos à substância-teste e cruzados com fêmeas não tratadas, que são sacrificadas a meio termo da prenhez, quando são contados os embriões mortos. As mutações letais dominantes resultam de aberrações cromossômicas que, embora não afetem a viabilidade dos gametas, são letais para o embrião.

A adaptação dessa técnica para a Biomphalaria leva em conta o fato de que o animal é hermafrodita simultâneo e a reprodução se dá tanto por auto-fecundação como por fecundação cruzada (Paraense, 1955); assim, são produzidos os dois tipos de embriões

(Figuras 7 e 8). Para identificar os resultantes de fecundação cruzada, o albinismo foi empregado como marcador genético: caramujos selvagens homozigotos tratados são cruzados com

albinos não tratados (Figuras 9 e 10). Para identificar os resultantes de fecundação cruzada, o albinismo foi empregado como marcador genético: caramujos selvagens homozigotos tratados são cruzados com albinos não tratados. Os efeitos observados nos embriões heterozigotos resultam, certamente, de mutações induzidas nos espermatozóides dos selvagens expostos. O indicador usado no teste do letal dominante em Biomphalaria foram as malformações

embrionárias inespecíficas (Figura 11), que afetam múltiplas estruturas e acabam por levar à morte do embrião, assim, mutações que causam esse tipo de malformação são mutações letais.

Foram estudados nesse sistema, no teste do letal dominante, a mitomicina C, a ciclofosfamida e a radiação ionizante, agentes mutagênicos de referência (Nakano et al., 2003; Tallarico et al., 2004).

A ciclofosfamida, uma mostarda nitrogenada utilizada principalmente como antineoplásico, foi empregada como modelo de mutagênico indireto. Relativamente inativa do ponto de vista biológico, é convertida pelas enzimas do sistema citocromo P hepático em 450

seu metabólito ativo, a mostarda de fosforamida, que se liga covalentemente ao DNA por substituição nucleofílica (Korolkovas & Burckhalter, 1988; Calabresi & Chabner, 1990). No teste do letal dominante em B. glabrata, a ciclofosfamida induziu mutações germinativas nos estádios mais avançados da gametogênese. Esses resultados foram compatíveis com os de estudos em células germinativas de roedores (Anderson et al., 1995).

Figura 7 – Desova de caramujo albino B. glabrata cruzado com

selvagem

 

Figura 8 – Desova de caramujo B. glabrata albino cruzado com

selvagem – detalhe da Figura 7

Figura 9 – Caramujo B. glabrata adulto albino

 

Figura 10 – Caramujo B. glabrata adulto selvagem

 

Figura 11 – Embriões de B. glabrata com malformações

inespecíficas

A mitomicina C, antibiótico isolado de Streptomyces caespitosus utilizado como antineoplásico, foi empregada como modelo de mutagênico direto, isto é, que não requer ativação metabólica. Um efeito específico da mitomicina C é a indução de freqüências mais altas de mutações letais dominantes nos estágios pré-meióticos da gametogênese, o que é atribuído à interferência com a síntese de DNA em doses baixas (Witt & Bishop, 1996). Em B. glabrata, o efeito letal dominante da mitomicina C em concentrações não tóxicas foi detectado nas células germinativas em estágios precoces da gametogênese; esse resultado foi similar ao observado em roedores (Ehling, 1971).

A radiação ionizante tem sido empregada nos estudos de mutagênese como o principal modelo de agente direto. Sua atividade genotóxica (causar danos ao DNA) não sofre interferência de fatores farmacocinéticos, já que não requer absorção, distribuição ou metabolismo; assim, pode-se considerar que a radiação age direta e instantaneamente no DNA. A partir daí, as respostas obtidas da exposição à radiação podem ser usadas para inferir alguns parâmetros cinéticos de mutagênicos químicos, como o período de latência e a meia-vida da atividade mutagênica efetiva. No caso de certos compostos, como aqueles que requerem ativação metabólica, com mecanismo de ação desconhecido ou com tempo de ação muito curto ou muito longo, essas informações podem complementar aquelas obtidas dos estudos farmacocinéticos, muitas vezes limitados pela dificuldade de interpretação dos resultados e pela complexidade da correlação entre a farmacocinética do composto e a sua atividade genotóxica (Morales-Ramírez et al., 1997).

Estudos de radiossensibilidade de células germinativas mostram que o efeito mutagênico da radiação ionizante sobre a gametogênese é inespecífico. Como conseqüência, a radiação é capaz de induzir mutações letais dominantes em células gametogênicas em todos os estágios (Mandl, 1964; Ehling, 1971; Egami, Shimada & Hama-Furukawa, 1983).

A eficiência da indução de mutações letais dominantes pela radiação ionizante depende do estágio da gametogênese. Essa sensibilidade diferencial é atribuída às características do processo: o desenvolvimento das células germinativas se caracteriza por alterações bioquímicas correlacionadas com a diferenciação morfológica; assim, as células nos diferentes estágios constituem populações distintas (Ehling, 1971).

Em geral, células nos estágios pré-meióticos da gametogênese são menos sensíveis à indução de mutações letais que as células nos estágios pós-meióticos. Esse efeito é atribuído a dois fatores: as células gametogênicas jovens – mitoticamente ativas – têm maior capacidade de reparo do dano ao DNA em doses subletais; e ocorre eliminação seletiva das células danificadas – é o chamado efeito citotóxico da radiação. Esse padrão de resposta é altamente conservado desde em fungos e plantas até em animais superiores (Mandl, 1964).

Em contraste com a radiação ionizante, mutagênicos químicos têm perfis diferentes de indução de mutações germinativas (Witt & Bishop, 1996). Um estudo comparativo com vários agentes em roedores mostrou que, enquanto o efeito da radiação ionizante é inespecífico, mutagênicos químicos interferem em diferentes processos bioquímicos da gametogênese. Assim, em contraste com a radiação ionizante, os mutagênicos químicos induzem mutações letais dominantes de forma estágio-específica.

A resposta da espermatogênese em B. glabrata à radiação ionizante seguiu o padrão observado em outros sistemas (Mandl, 1964). A indução de mutações letais dominantes foi maior nas células gametogênicas mais maduras que nas mais jovens. Estas, por sua vez, foram altamente sensíveis ao efeito citotóxico da radiação.

O teste do letal dominante em B. glabrata se mostrou eficiente, de fácil execução, baixo custo e sensível na avaliação de mutações germinativas induzidas por agentes mutagênicos de referência. Do estudo realizado com a ciclofosfamida e a mitomicina C, foi possível concluir que B. glabrata é capaz de absorver e de ativar metabolicamente compostos mutagênicos presentes no ambiente aquático. Dos resultados obtidos com a radiação ionizante foi possível estimar alguns parâmetros da espermatogênese em B. glabrata. Esses dados serão necessários no estabelecimento dos tempos de cruzamento e na interpretação de resultados obtidos da análise de amostras ambientais, geralmente misturas complexas de muitas substâncias químicas. A demonstração da sua capacidade de detecção de agentes mutagênicos diretos e indiretos sem a necessidade de adição de sistemas de ativação metabólica capacita o teste para o monitoramento de compostos mutagênicos ambientais, levando-se em conta que muitos desses poluentes são mutagênicos indiretos.

 

Perspectivas

Atualmente poucas pesquisas na área de embriologia de moluscos são conhecidas, uma razão para a realização deste estudo em diferentes espécies, descrevendo detalhes de embriões com desenvolvimento normal para ser comparado com aqueles malformados tratados com algum agente químico ou físico. Eis a embriologia das principais espécies estudadas: Biomphalaria glabrata, B. tenagophila, B. straminea (Mollusca Planorbidae), Pomacea lineata (Mollusca, Caenogastropoda) e Perna perna (Mollusca, Bivalvia. Com a recente aquisição do microscópio de varredura laser confocal Zeiss 510 Meta, abrem-se novos horizontes para a análise mais acurada dos diferentes estádios embrionários de diferentes moluscos.

Aplicações

O teste do letal dominante em B. glabrata (já validado) é proposto como modelo a ser usado em estudos de biomonitoramento ambiental, tornando-se uma ferramenta valiosa na avaliação do impacto ambiental dos poluentes mutagênicos.

 

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