2 – Filogenia, Co-Evolução, Aspectos Morfológicos e Biológicos das Diferentes Fases de Desenvolvimento do Schistosoma mansoni José Roberto Machado e Silva, Renata Heisler Neves Delir Corrêa Gomes

2 - Filogenia, Co-Evolução, Aspectos

Morfológicos e Biológicos das

Diferentes Fases de Desenvolvimento

do Schistosoma mansoni

 

José Roberto Machado e Silva; Renata Heisler Neves; Delir Corrêa Gomes

Vermes adultos acasalados de Schistosoma mansoni, corados por

carmim clorídrico.

Os trematódeos digenéicos são endoparasitos de vertebrados,

com corpo achatado dorsoventralmente, de simetria bilateral,

sem segmentação, tendo o tegumento coberto por uma

citomembrana de aspecto sincicial. São acelomados, com o

espaço entre os órgãos preenchido por células

parenquimatosas e tecido conectivo. Os órgãos de fixação são

constituídos por duas ventosas: a mais anterior, oral, onde se

encontra a abertura bucal; e a ventral ou acetábulo. O sistema

digestivo termina em um fundo cego, isto é, sem ânus. O

aparelho excretor é protonefridial, com células vibráteis,

terminando em um poro excretor posterior. São hermafroditas,

com exceção das famílias Schistosomatidae (Looss, 1899)

Poche, 1907 e Didymozoidae (Monticelli, 1888) Poche, 1907,

que são dióicos.

As características morfológicas das formas evolutivas de

Schistosoma mansoni Sambon, 1907, como os demais

helmintos, apresentam valor taxonômico para caracterização e

identificação. O conhecimento topográfico dos órgãos é de

extrema utilidade nos diferentes experimentos, principalmente

quando se necessita identificar o local onde ocorrem as

transformações, reações etc., além de se saber quais as

funções específicas dessas estruturas em cada fase evolutiva.

Essas características, juntamente com a filogenia e a relação

com os diversos hospedeiros e o ambiente, têm sido abordadas

em trabalhos mais recentes, para complementar e atualizar os

dados existentes, que vinham sendo passados há algumas

décadas, aceitando-se o que existia.

S. mansoni se diferencia dos demais trematódeos

hermafroditas, por apresentar um dimorfismo sexual acentuado,

apesar de ter evoluído de um ancestral hermafrodita (Basch,

1990). De acordo com Combes (1990), primeiramente o

helminto se adaptou a roedores, mais tarde foi transferido para

hominídeos e enfim chegou à forma encontrada nos atuais

hospedeiros. Ao contrário, outros consideram que, primeiro, a

adaptação ocorreu em hominídeos e depois nos roedores

(Locker et al., 2003). Admitindo-se que a hipótese da

associação entre as condições fisiológicas do hospedeiro

natural e a expressão fenotípica do helminto têm uma

correlação estreita, a necessidade do conhecimento de todas

as estruturas, nas diferentes formas evolutivas, é importante

como informação básica e fundamental para o conhecimento da

esquistossomose, complementando e auxiliando outras áreas

de pesquisa.

Neste capítulo a filogenia, a posição taxonômica e a morfologia

das formas evolutivas são apresentadas, a partir de

observações em microscopia de campo claro, contraste de

interferência diferencial, microscopia eletrônica de varredura,

microscopia eletrônica de transmissão, microscopia de

varredura laser confocal e nos aspectos biológicos do

desenvolvimento das diferentes fases evolutivas.

 

Posição taxonômica

Na classificação dos helmintos (Gibson, Jones & Bray, 2002; Olson et al., 2003), o gênero Schistosoma se encontra assim localizado:

Filo Plathyhelminthes (Gegenbauer, 1859)

Classe Trematoda Rudolphi, 1808

Subclasse Digenea Carus, 1863

Ordem Strigeiforme La Rue, 1926

Superfamília Schistosomatoidea Stiles & Hassal, 1898

Família Schistosomatidae Stiles & Hassal, 1898

Gênero Schistosoma Weiland, 1858

Família Schistosomatidae

A família Schistosomatidae é representada por trematódeos parasitos, que em sua fase adulta vivem no sistema venoso de mamíferos, alguns répteis (crocodilos) e aves. Algumas análises filogenéticas sugerem que a família tenha se originado em animais pecilotérmicos, aves e depois mamíferos (Morand & Muller- Graf, 2000). Os autores de tais análises consideram que, nessa família, a presença do canal ginecóforo é um caráter plesiomórfico, com várias reduções durante a diversificação da família. O pequeno número de testículos é um estágio plesiomórfico, tendo ocorrido a variação numérica por diversas vezes (Morand & Muller-Graf, 2000). Estudo recente sugere que o gênero Orientobilharzia Dutt & Srivatava, 1955 deve ser incluído no gênero Schistosoma, apesar de apresentar um número muito maior de lóbulos testiculares (Locker et al., 2003). Devido à diversidade nessa família, esse caráter não foi considerado adequado para a análise filogenética (Morand & Muller-Graf, 2000).

As fases larvares das espécies do gênero Schistosoma Weinland, 1858 ocorrem em moluscos gastrópodes aquáticos, principalmente dos gêneros Biomphalaria, Bulinus ou Oncomelania. Os representantes desta família se diferenciam de outros trematódeos por apresentarem sexos separados, eliminarem ovos não operculados, com espinho lateral ou terminal, embrionados (com miracídio) e ter como formas infectantes para o hospedeiro vertebrado (definitivo) as cercárias que penetram por via transcutânea. Em geral, nos trematódeos digenéicos que causam infecção humana, a forma infectante é a metacercária, transmitida por via oral.

Levando-se em consideração as características morfológicas dos vermes adultos, do espinho do ovo, do ciclo biológico, da especificidade pelo hospedeiro e genéticas (padrão de isoenzimas e DNA), as espécies do gênero Schistosoma podem ser divididas em quatro grupos (Comité OMS, 1993; Bont & Vercruysse, 1998):

Grupo japonicum (S. japonicum Katsurada, 1904, S. sinensium Pao, 1959; S. mekongi Voge, Bruckner & Bruce, 1978, S. malayensis Greer et al, 1988);

Grupo haematobium (S. haematobium (Bilharz, 1852) Weinland, 1858, S. bovis (Sonsino, 1876) Blanchard, 1895, S. mattheei Veglia & Le Roux, 1929, S. margrebowiei Le Roux, 1933, S. intercalatum Fisher, 1934, S. leiperi Le Roux, 1955);

Grupo indicum (S. indicum Montgomery, 1906, S. spindale Montgomery, 1906, S. incognitum Chandler, 1926, S.

nasale Rao, 1933);

Grupo mansoni (S. mansoni Sambon, 1907, S. rodhaini Brumpt, 1931; S. hippopotami Thurston, 1963, S. edwardiense Thurston, 1964).

A ausência de fósseis dificulta estabelecer a origem do gênero Schistosoma (Morgan et al., 2001). A filogenia desse gênero foi estudada com base nas características morfológicas, associações entre hospedeiros, biogeografia e análise molecular, resultando em duas teorias (Locker et al., 2003; Morand & Muller-Graf, 2000; Morgan et al., 2001; Barker & Blair, 1996; Platt & Brooks, 1997; Snyder & Loker, 2000). Uma propõe que essa origem tenha sido no Gondwana, com a participação de moluscos pulmonados e pomacídeos. A partir dessa região, o ancestral na Ásia deu origem aos grupos japonicum e indicum e, na África, haematobium e mansoni (Morgan et al., 2001). Na outra, a Ásia é o centro irradiador de Schistosoma (Combes, 1990). Os dados moleculares favorecem a teoria da origem asiática (Locker et al., 2003; Morand & Muller-Graf, 2000; Morgan et al., 2001; Snyder & Loker, 2000). O ancestral asiático parasito de molusco pulmonado se deslocou para a África (12-19 mil anos), por conta da migração dos mamíferos. A permanência desse ancestral na Ásia deu origem ao grupo japonicum e, na África, aos grupos mansoni e haematobium (1 mil a 4 mil anos). Posteriormente, o ancestral retornou à Ásia com os hominídeos e seus animais domésticos (Barker & Blair, 1996).

De acordo com Combes (1990), S. mansoni primeiramente se adaptou a roedores, mais tarde foi transferido lateralmente para hominídeos e chegou à forma encontrada nos atuais hospedeiros. Ao contrário, outros consideram que, primeiro, a adaptação ocorreu em hominídeos e depois nos roedores (Locker et al., 2003).

As espécies do grupo mansoni, em geral, realizam o ciclo assexuado em moluscos do gênero Biomphalaria (Américas Central e Sul e África). Os espécimes adultos são encontrados nos vasos mesentéricos e no sistema porta de mamíferos das ordens Primates, Rodentia, Artiodactlyla e Carnivora.

Schistosoma mansoni Sambon, 1907

Espécie que acomete humanos e pequenos mamíferos na região neotropical e na África. A análise comparativa entre o DNA mitocondrial de cepas africanas e da região neotropical, confirmou a sua introdução mais recente na América do Sul, ao que tudo indica, com o tráfico de escravos (Desprès, Imbert-Establet & Monnerot, 1993). Apesar de a Europa também receber população de escravos e o encontro de ovos de S. mansoni em coprólitos, o helminto ali não se estabeleceu, devido à inexistência do molusco suscetível (Bouchet et al., 2002).

A espécie atual e seus ancestrais, provavelmente, tiveram uma co-evolução com hospedeiros pecilotérmicos ou homeotérmicos, pertencentes a distintas classes zoológicas: peixes e tartarugas no Período Devoniano – Era Paleozóica (350-400 mil anos); dinossauros e formas transitórias para aves – Era Mesozóica (250 mil anos); aves e roedores – Paleogêneo (57-68 mil anos); hominídeos – Período Quaternário (1,6 mil anos) (Lenzi et al., 1997).

É consensual que os ancestrais de S. mansoni eram trematódeos hermafroditas (Basch, 1990; Combes, 1990, Platt & Brooks, 1997; Lenzi et al., 1997). Os fatores determinantes da mudança de hermafrodita para dióico estão em discussão há algumas décadas (Basch, 1990). Para a separação dos sexos foram apresentadas três hipóteses: mudança de hábitat arterial para venoso, desenvolvimento do sistema porta nos animais homeotérmicos e adaptação em mamíferos pulmonados terrestres (Basch, 1991). Essas hipóteses foram negadas com base nas análises cladísticas morfológica e filogenética (Morgan et al., 2001). Os autores dessas análises também negam que a separação de sexos tenha evoluído em hospedeiros homeotérmicos, já que crocodilos e hospedeiros pecilotérmicos já eram parasitados por esquistossomos.

O sistema imune também foi aventado como um dos possíveis determinantes da mudança de tipo de reprodução (Lenzi et al., 1997). De acordo com os resultados por análise filogenética, a colonização nos mamíferos que têm um sistema imune mais elaborado parece ter ocorrido depois da separação dos sexos. Restou, portanto, a hipótese de a mudança ter sido determinada pela necessidade de um local especializado, onde os ovos pudessem ser depositados e eliminados para o ambiente externo (Morand & Müller-Graf, 2000).

O dimorfismo sexual foi acompanhado de alterações fenotípicas, como o afilamento do corpo das fêmeas e o surgimento da protandria nos machos (Platt & Brooks, 1997). A modificação surgida no corpo das fêmeas pode ter sido resultado de diferenças determinadas pela especialização na deposição dos ovos. Nas atuais fêmeas houve redução na capacidade de locomoção e musculatura faringiana, porém elas investiram na produção e seleção de local para postura de ovos. Aparentemente, o papel mais importante dos machos para garantir a espécie não é a fecundação, mas a sua musculatura. Aos machos coube o papel de transporte das fêmeas para as pequenas vênulas e a ajuda na ingestão de sangue (Basch, 1990).

Fato pouco comum no reino animal é o acasalamento permanente entre dois espécimes, como ocorre em Schistosoma (Popiel, 1986). Além dos aspectos já mencionados que envolvem a filogenia, essa união prolongada poderia mimetizar um hermafroditismo. A dominância do sexo masculino não está limitada à sua maior proporção em um hospedeiro (Morand & Muller-Graf, 2000; Boissier & Moné, 2000), pois os machos controlam a expressão de genes das fêmeas, influenciando o desenvolvimento somático, o sistema reprodutivo e a fertilidade (LoVerde & Chen, 1991; Kunz et al., 1995; Ribeiro-Paes & Rodrigues, 1997; Southgate, Jourdane & Tchuenté, 1998; Kunz, 2001).

Outros caracteres morfológicos, como o canal ginecóforo e os lóbulos testiculares não foram considerados como determinantes da mudança para sexos separados (Morand & Müller-Graf, 2000). Autores admitem a possibilidade de ter ocorrido uma seleção sexual determinada pela desproporção entre machos e fêmeas, com maior número de machos presentes em infecções naturais ou experimentais (Morand & Müller-Graf, 2000).

Ainda que o sistema imune não tenha sido o determinante da separação entre os sexos, há evidências de que a sua modulação seja específica para cada sexo. Por conta disso, só os machos são capazes de realizar transdução de sinais do sistema imune e subseqüentemente estimular o desenvolvimento das fêmeas (Hernandez et al., 2004). O desenvolvimento e a sobrevivência do helminto dependem da habilidade em interpretar sinais do meio em que ele está vivendo (Vermeire et al., 2003). Isto significa que as fases de vida do helminto apresentam uma extrema capacidade de adaptação, que envolve sucessivas mudanças morfológicas e fisiológicas. O ciclo biológico compreende a realização de uma etapa de reprodução sexuada (vermes adultos dióicos), com produção de ovos em um hospedeiro vertebrado, outra de reprodução assexuada (esporocistos) nos hospedeiros intermediários e fases de vida livre (miracídios e cercárias).

Ovo

É composto por células produzidas por dois diferentes órgãos das fêmeas: glândulas vitelínicas e ovário (Michel, Knobloch & Kunz, 2003). Ao que tudo indica, o sexo do helminto já é cromossomicamente definido no ovo fertilizado (Ribeiro-Paes & Rodrigues, 1997). O miracídio do sexo feminino é heterozigoto (ZW) e os machos, homozigotos (ZZ). Por ocasião da postura dos ovos pelas fêmeas na parede dos vasos mesentéricos (a partir da quarta semana de infecção), nota-se que os ovos ainda são pequenos, imaturos, de simples organização, com uma casca protéica envolvendo um zigoto com 20-30 células vitelínicas. Por microscopia eletrônica de transmissão, o ovo é caracterizado pela casca protéica com uma densa série de microespinhos na sua parte externa e, internamente, o seu maior conteúdo corresponde às células vitelínicas com citoplasma rico em mitocôndrias, gotículas de gordura, vesículas de vários tipos e inclusões granulares. A membrana plasmática da célula vitelínica está em contato direto com a membrana interna da casca do ovo (Ashton et al., 2001). Desde as fases iniciais da formação dos ovos no interior das fêmeas

(Figuras 1A, 1B), enquanto estão mudando de estágio (primeiro ao quarto), aumentam até a oitava semana e passam por modificações morfológicas e fisiológicas. Por microscopia de campo claro se evidenciam aumentos cerca de três vezes e meia seu tamanho na área, perímetro e diâmetros. Nos estágios iniciais, placas finas de citoplasma se interpõem entre a casca do ovo e as células vitelínicas. Nos ovos imaturos mais desenvolvidos, as placas se tornam uma membrana contínua de citoplasma (0,2-0,3 μm de espessura), separando a casca das células vitelínicas e envolvendo completamente o conteúdo do ovo, como uma protomembrana.

Os ovos maduros (com um miracídio formado) medem 150 μm de comprimento médio por 65 μm de largura e são facilmente reconhecidos pela presença de um espinho lateral, situado no pólo

posterior do ovo (Figura 1C). Entretanto, ovos com dois miracídios já foram encontrados em fezes humanas (Dias & Ribeiro, 1980).

Figura 1 – Fotomicrografia de ovos de Schistosoma mansoni:

microscopia de varredura laser confocal de ovos uterinos (A, B) e

nas fezes (C)

 

A análise biométrica de ovos de S. mansoni em focos de Guadaloupe (Antilhas) mostra que nos focos urbanos de transmissão, onde o homem é o principal hospedeiro, o tamanho é de 186 x 75 μm e os ovos são menos polimórficos no formato do espinho. Nos focos silvestres de responsabilidade dos roedores (Rattus rattus), os ovos são menores 176 x 74 μm e mais polimórficos (Théron, 1986).

O espinho mede cerca de 20 μm de comprimento e é formado apenas pela membrana externa do ovo (córion). Nesta etapa, o envelope atinge uma espessura de 0,5-0,6 μm. A membrana plasmática externa prolonga-se em extensões do tipo de microvilosidades, o que demonstra a função de transporte interno desta camada. A membrana interna é lisa. O citoplasma é diferenciado em distintas regiões, onde a maior área é ocupada por microagregrados de natureza granular, e com menor distribuição aparecem grandes vesículas, provavelmente para estocagem de lipídeos. A presença de retículo endoplásmico granuloso é um indicativo de síntese protéica. O espaço existente entre a membrana e a casca (camada de Reynolds) tem 1 μm de largura e é preenchida por material granular. A porção anterior do ovo apresenta poros de diferentes larguras, que estão alinhados por projeções citoplasmáticas que se aderem bem próximo à superfície interna do ovo. Os ovos recuperados de animais infectados ou mantidos in vitro apresentam poros (Race et al., 1971) que atravessam obliquamente a casca do ovo (Neill et al., 1988).

Por imunocitoquímica se verifica que o envelope é a região com mais atividade de secreção de proteínas, o que sugere que esta camada é uma fonte secretora mais importante do que o miracídio. A secreção do ovo contribui para a sua travessia dos tecidos digestivos até atingirem a luz intestinal, onde são eliminados com as fezes. Depois de eliminados pelo hospedeiro, no ambiente a longevidade do ovo depende da consistência das fezes e da temperatura. Em fezes sólidas a sobrevida varia entre dois a cinco dias, ao passo que, em fezes líquidas, os ovos duram três dias.

Miracídio

O miracídio tem uma forma cilindrocônica e mede cerca de 160-180 μm de comprimento por 60 μm de largura. A sua superfície é composta por 21 placas epidérmicas ciliadas, anucleadas, ligadas por junções septadas a cristas sinciciais estreitas conectadas a corpos celulares, profundos no corpo. As placas são agrupadas em quatro fileiras, cujos cílios anteriores aumentam de tamanho (4-12 μm) da região anterior para a posterior, principalmente na primeira fila. Na região anterior, o miracídio consiste de uma papila apical em forma de cone (terebratorium), que é representada por pregas anastomosadas do tegumento, semelhantes a favos de mel (Eklu-Natey et al., 1985), não ciliadas e retráteis, e contém a abertura de glândulas (adesivas e de penetração) e numerosos receptores sensoriais. A parede do corpo contém também fibras musculares.

Há uma membrana basal cruzando duas camadas de musculatura lisa que cobrem as estruturas internas que estão banhadas em um líquido claro. O sistema nervoso do miracídio é formado pela união de fibras conectadas às células nervosas por um grande gânglio cefálico localizado após as glândulas cefálicas e composto de uma massa de fibras nervosas com corpos celulares periféricos. Diferente de outros trematódeos, os miracídios de S. mansoni não apresentam glândulas cefálicas. Entretanto, por meio de análise transcriptômica foi confirmada a presença de componentes de um sistema de detecção de luz (uma paralogia de rodopsina e rodopsina quinase) consistente com o fototropismo positivo (Verjovski-Almeida et al., 2003).

O sistema excretor é composto de dois pares de células em flama ou solenócitos, que drenam para túbulos coletores que se abrem para o exterior nas laterais do corpo. A principal função seria regular os fluidos internos e eliminar produtos de excreção. Na região posterior do corpo estão presentes numerosas células germinativas primitivas que entrarão em intensa atividade na fase de esporocistos. Nos ovos prestes a eclodir, o miracídio pode ser visto com movimentos de extensão e retração, batimento dos cílios e atividade dos solenócitos. No ambiente aquático os miracídios eclodem do ovo devido à hipotonicidade do meio, que promove a passagem de água para o interior da casca, à temperatura (ótima, em torno dos 28°C), à luminosidade e à própria movimentação do embrião. Como o ovo não é operculado, a ruptura da casca ocorre em seu ponto de menor resistência, que se apresenta como uma fenda oblíqua.

Após eclodirem dos ovos, as larvas nadam ativamente no meio aquático até o encontro de um hospedeiro. Por videomicroscopia calcula-se que atinjam uma velocidade média de 2 mm/seg, que é produzida por batimentos sincrônicos dos cílios na placa epitelial.

Os movimentos ciliares do miracídio são dependentes da osmolaridade do meio. A alta osmolaridade inibe os movimentos dos miracídios, o que é revertido quando se eleva o conteúdo intracelular de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) (Matsuyama et al., 2004). Os autores desses estudos sugerem que a AMPc seja um segundo mensageiro na transdução de sinal para a motilidade ciliar regulada pela osmose nos miracídios.

Não há evidências de que o miracídio alimente-se no ambiente, portanto a sua longevidade e a sua infectividade dependem da exaustão de suas reservas nutritivas (glicogênio). Quanto maior a sua atividade sem encontrar o hospedeiro menor pode ser a sua capacidade de infectá-lo. Em condições de laboratório, em uma placa de Petri, isto pode ser evidenciado em larvas que perdem seus movimentos intensos e passam a nadar em ziguezague e cessam completamente o seu deslocamento, mantendo apenas os movimentos ciliares.

Uma das características da interação de S. mansoni com o molusco é o seu grau de especificidade, que se manifesta a partir da atração do molusco pelo miracídio e continua durante as fases de reprodução intramolusco. O encontro do hospedeiro intermediário está ligado a quimiorreceptores localizados nas fibras conectadas às células nervosas. Esses quimiorreceptores são capazes de perceber substâncias existentes no muco produzido pelo molusco, atraindo ou repelindo. Observações de laboratório demonstram que a presença de glicoconjugados da camada superficial do muco do caramujo é o fator desencadeador para a sua localização pelo miracídio (Haas, 1995). Os movimentos destas larvas aumentam quando elas são colocadas em água previamente condicionada pela presença de Biomphalaria glabrata (Hassan et al., 2003).

O contato do miracídio com espécies que não sejam hospedeiras, posteriormente, pode reduzir a sua habilidade de infectar uma espécie de molusco suscetível. Ao longo do processo evolutivo, os miracídios desenvolveram uma atração específica pelo hospedeiro (Combes & Moné, 1987). Estudo recente mostrou que os miracídios de uma cepa simpátrica de S. mansoni do Egito apresentam maior quimiorientação a moluscos simpátricos compatíveis (Biomphalaria alexandrina ou B. arabica) do que as outras espécies, B. glabrata, B. truncatus e Physa acuta. No mesmo experimento, uma cepa brasileira (Recife) não apresentou capacidade de discriminação entre estas espécies (Hassan et al., 2003). Esta especificidade no comportamento para o encontro do hospedeiro também tem base hereditária. A manutenção de uma cepa do Egito por cinco gerações em B. glabrata do Brasil manteve a especificidade do miracídio pelo hospedeiro original, B. alexandrina (Kalbe et al., 2004).

A atração miraxonal não ocorre quando o molusco está infectado com esporocisto secundário (Magalhães, Zanotti-Magalhães & Carvalho, 1997). Também se verificou nessas abordagens que esta atração não é afetada pelo fato de o molusco ser infantil ou adulto. Outros resultados mostram que há maior atração miracidiana avaliada pela taxa de formação de esporocistos primários, quando os moluscos ainda não são adultos (7-9 mm de diâmetro da concha) (Théron, Rognon & Pagès, 1998).

Os miracídios, quando entram em contato direto com o molusco, aderem-se e penetram neles através das secreções glandulares do terebratorium e movimentos rotatórios. A invasão dura de três a quinze minutos e pode ser feita em qualquer parte mole do tegumento. Em condições de laboratório e mesmo na natureza, o molusco pode ser infectado por apenas um miracídio. Os experimentos que avaliam a capacidade infectante de miracídios, em geral, demonstram que os machos apresentam maior capacidade infectante (Liberatos, 1987).

Nas fases seguintes (esporocistos) do desenvolvimento intramolusco, as células germinativas se dividem e se diferenciam, mantendo o mesmo sexo do miracídio que as originou. Um único miracídio pode gerar de 100 a 300 mil cercárias.

Esporocisto Primário

Devido à imposição de habitar um novo ambiente com diferentes condições fisiológicas (osmolaridade, temperatura, pH, conteúdo de oxigênio, entre outros), os miracídios que penetraram no molusco sofrem rápidas remodelações estruturais nas proximidades de seu ponto de penetração. Por algum tempo permanecem neste local (pés, manto etc.), onde crescem e se transformam em um saco que

pode ter a forma alongada ou ovalada (Figura 2). Em duas horas após a penetração, os miracídios perdem o seu revestimento epitelial ciliado e demais estruturas externas (órgãos de penetração). As cristas epiteliais se alargam gradualmente, até que, no segundo dia, uma nova camada superficial contínua aparece ao redor do esporocisto primário ou mãe. Na superfície externa desta membrana aparecem numerosas dobras tipo microvilosidades cobertas com camada eletrodensa que faz trocas metabólicas com a hemolinfa e interage com os hemócitos do molusco. O novo tegumento sincicial contém mitocôndrias, ribossomos, retículo endoplásmico, glicogênio, lipídio e permanecem conectados com os corpos celulares nucleados situados mais sob a superfície. O esporocisto não possui boca e nem sistema digestivo, portanto os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento são absorvidos através do seu tegumento. No tegumento é que são lançados os produtos de excreção/secreção e onde as moléculas do hospedeiro e o plasma interagem com o parasito, desencadeando as respostas imunopatológicas do hospedeiro (Yoshino, Boyle & Humphries, 2001).

Figura 2 – Corte histológico de Biomphalaria sp. com esporocisto

primário (ES1) e esporocisto secundário (ES2) de Schistosoma

mansoni

O estabelecimento de técnicas que possibilitam a manutenção de formas larvares in vitro facilitou as pesquisas de diferentes aspectos biológicos de S. mansoni. A função muscular do esporocisto primário é regulada pela presença de serotonina (5-hidroxitriptamina), que aumenta a sua motilidade e comprimento, via ativação de receptores de serotonina (Boyle, Zaide & Yoshino, 2000). A transição da fase de vida livre do miracídio para a parasitária (esporocisto) é caracterizada pelo aumento da dependência de serotonina exógena. A análise por auto-radiografia sugere que a serotonina se localiza nas células glandulares apicais (Boyle et al., 2003).

Esporocisto Secundário

Durante o desenvolvimento posterior, as camadas musculares e as células parenquimatosas degeneram, as células germinativas difusas se tornam mais proeminentes e a porção central do esporocisto se diferencia em uma câmara de maturação, onde as células propagatórias ou germinativas se reproduzem

assexuadamente (Figura 2). Em menos de uma semana, o embrião do esporocisto começa a se formar por subdivisões e diferenciações das células germinativas que brotaram da parede interna do esporocisto primário. Após cinco ou seis dias, o esporocisto secundário ou filho abandona o esporocisto mãe e se desloca para o hepatopâncreas (glândulas digestivas) e o ovotéstis do molusco. Nesta etapa os esporocistos medem cerca de 250 μm de comprimento, contêm fibras musculares, sistema nervoso e protonefrídeos. O tegumento assemelha-se à fase anterior pelo seu aspecto sincicial, anucleado, sob uma membrana basal com conexões com os corpos celulares nucleados abaixo das fibras musculares (Brusca & Brusca, 1990).

Para atingirem o estágio de maturidade, os esporocistos secundários sofrem modificações anatômicas, caracterizadas pela presença de três compartimentos: uma região posterior com células indiferenciadas; uma zona dilatada de parede estendida, com cercárias em processo de diferenciação ou já diferenciadas; e uma região anterior, com movimentos próprios, o poro de nascimento da cercária. O poro está situado no centro de uma depressão formada pela invaginação do tegumento do esporocisto. O estudo ultraestrutural desta região revela que a camada citoplasmática do sincício é fina (0,05 a 0,1 μm), contendo mitocôndrias, ribossomos e retículo endoplásmico (Fournier & Théron, 1985).

O tempo necessário para o desenvolvimento no molusco é de três a quatro semanas, quando as cercárias estão maduras para serem liberadas do esporocisto pelo poro de nascimento. Estudos de laboratório evidenciaram a ocorrência de esporocistos replicadores, capazes de produzir novas gerações de esporocistos cercariogênicos, principalmente entre 69 e 77 dias em Biomphalaria glabrata. Estes têm a denominação de esporocistos terciários, quaternários etc. Este mecanismo explica a eliminação prolongada de cercárias, ainda que não sejam conhecidos, com precisão, os mecanismos que regulam a formação de novas gerações. Recentemente, demonstrou-se a heterogeneidade genética entre clones de esporocistos secundários mantidos in vitro (Bayne & Grevelding, 2003).

Cercária

A transição da vida parasitária das cercárias para vida livre requer que, ao atravessarem o poro de nascimento no esporocisto, as cercárias já estejam em condições morfológicas e fisiológicas para desempenharem funções especializadas no novo ambiente: ser eliminada do molusco, viver no ambiente externo, apresentar intensa locomoção, ter a capacidade de localizar e penetrar em um hospedeiro vertebrado (homem ou pequenos mamíferos). Assim como os miracídios, as cercárias não apresentam uma região fototrópica (manchas ocelares). Esta ausência é compensada pela presença de uma proteína de 36-KDa (rodopsina de S. mansoni), localizada nas células subtegumentares e que tem extensa preservação filogenética entre invertebrados aquáticos (Hoffman et al., 2001).

A cercária é toda revestida por um tegumento sincicial, com uma região citoplasmática anucleada, diretamente subjacente à membrana superficial contínua, com corpos celulares situados mais profundamente no parênquima. Uma membrana plasmática trilaminada sobre uma membrana basal também trilaminada formam a superfície externa do tegumento, que é coberta por numerosas fibrilas (glicocálix), com 0,008-0,01 μm de espessura. O glicocálix é uma molécula complexa formada de oligossacarídeos que atuam, entre outras funções, protegendo a permeabilidade da cercária. O glicocálix cobre também os espinhos, dirigidos para trás no tegumento, exceto no ápice oral do órgão anterior, com suas curvaturas laterais e papilas sensoriais, na depressão ao redor da boca, no colar da junção corpo/cauda e na extremidade das furcas (Dorsey et al., 2002). A espessura do tegumento do corpo tem cerca de 0,5 μm e a cauda, 0,2 μm.

A cercária mede cerca de 500 μm de comprimento, tem uma organização complexa, com corpo alongado e cilíndrico e cauda de extremidade curta e bifurcada, fundamental para o deslocamento no

ambiente (Figura 3 A). O corpo cercariano, com cerca de 200 μm de comprimento, tem duas regiões bem definidas: a região anterior, especializada na fixação e invasão do seu hospedeiro, e a posterior, com as glândulas que desembocam na ventosa oral (órgão anterior), uma ventosa ventral (acetábulo), células do sistema digestivo, células nervosas, células musculares, papilas sensoriais, células do sistema osmorregulador e células germinativas que originam os órgãos sexuais nos vermes adultos. Por ser um organismo acelomado, a cercária possui uma quantidade substancial de parênquima celular, consistindo de células de suporte que funcionam como um celoma e uma matriz extracelular fibrosa (Dorsey et al., 2002). Para um melhor entendimento da localização das estruturas, a cercária pode ser dividida em 13 segmentos

(Figura 3 B), a partir do órgão anterior (1 a 4), dessa área até a junção corpo/cauda (5 a 10) e a cauda (11 a 13) (Dorsey et al., 2002).

Figura 3 – Organização geral de cercárias de Schistosoma mansoni

(A, B) e distribuição de papilas argentofílicas (C)

 

No parênquima do corpo há quatro tipos de células subtegumentares (I, II, III e IV), com o pericário associado ao tegumento através de pontes citoplasmáticas. Cada célula consiste de um núcleo envolvido por inclusões específicas a cada tipo celular. As células do tipo I se localizam subjacentes às camadas musculares periféricas mais externas da parede e estão distribuídas ao longo de todo o corpo da cercária. O citoplasma do pericário contém um grande núcleo heterocromático, uma pequena quantidade de complexo de Golgi (aparelho de Golgi), poucas mitocôndrias, numerosos ribossomos e corpos secretores.

As células do tipo II têm formas irregulares, um grande núcleo heterocromático e pontes citoplasmáticas, pouco organizadas, ao redor do cone muscular da ventosa oral. Essas células estão aglomeradas na extremidade dorso-anterior do corpo, à mesma altura do par anterior das células em flama e do músculo, que delimita a região anterior do corpo do restante corpo cercariano (segmentos 4-5). As células do tipo III têm um pequeno pericário em forma de ferradura e ficam localizadas próximas à parede muscular do corpo, exatamente anteriores à ventosa ventral (segmentos 7-8). A morfologia celular e a reatividade ao teste de Pearse sugerem que essas células sejam células biogênicas de aminas (moduladores de neurotransmissores). As células subtegumentares do tipo IV são pouco numerosas, com o pericário e as pontes citoplasmáticas situadas na região mediana do corpo cercariano, região imediatamente anterior ao fundo da glândula pré-acetabular (segmentos 6-7).

Nas formas de vida livre dos trematódeos, a região mais apical das cercárias é diferenciada, com uma ventosa oral (órgão anterior), assimétrica, em forma de disco sem espinhos no ápice, onde desembocam na área ântero-dorsal os longos ductos das glândulas de penetração ou acetabulares (pré e pós) e na área ântero-ventral, os da glândula cefálica (segmentos 1 a 3). O fundo desta glândula é adjacente à curvatura póstero-dorsal muscular que delimita a região posterior da ventosa oral (Dorsey et al., 2002). Para as glândulas de penetração existem 10 ductos circundados por uma borda pregueada do tegumento e distribuídos lateralmente em dois semicírculos, com cinco aberturas em cada (McLaren, 1980).

A extremidade anterior é também composta por receptores sensoriais (papilas), que respondem a sinais térmicos, químicos e mecânicos, regulando o comportamento das cercárias no ambiente. Papilas sensoriais são terminações nervosas situadas na superfície das cercárias, que fazem contato com o ambiente através de cílios ou aberturas no tegumento. Existem aproximadamente 76 papilas distribuídas bilateralmente e simetricamente no corpo, na extremidade oral e, em menor quantidade, na cauda (Short & Cartrett, 1973). Na extremidade convexa das pregas tegumentares externas de cada semicírculo são encontradas sete papilas sensoriais (McLaren, 1980). As papilas são classificadas em seis tipos, de acordo com as suas características morfológicas e a sua distribuição, que varia entre o órgão anterior, o corpo e a cauda. Ainda que na ventosa oral sejam encontrados cinco tipos de papilas, os três seguintes são apenas desta região:

terminação nervosa bulbar do tipo I – encontradas no parênquima, medem 2,5 por 2,0 μm de diâmetro e consistem de uma cavidade em cuja parede nasce um cílio que se projeta para o lume;

depressões multiciliadas – em número de quatro ou mais. Cada depressão tem uma cavidade aberta que é exposta à superfície e conectada ao tegumento por um desmossoma septado;

terminação nervosa bulbar do tipo II – encontradas entre o tegumento e os músculos subtegumentares na região apical do órgão anterior. Essa terminação nervosa consiste de uma cavidade com um lúmen contendo vesículas neurosecretoras.

Comum a outras áreas, as papilas uniciliadas embainhadas geralmente estão localizadas na extremidade apical da região oral; entretanto, algumas são encontradas na ventosa ventral e na cauda. Os cílios têm 2,5 μm de comprimento e são embainhados quase até as suas extremidades ou completamente cobertos. As papilas consideradas embainhadas são envolvidas pelo tegumento em pelo menos metade de sua altura. Outro tipo, papilas uniciliadas não embainhadas, as mais abundantes das papilas das cercárias, estão presentes no órgão anterior, no restante do corpo (inclusive na ventosa ventral) e na cauda. A conexão com o tegumento se dá por um desmossoma septado, circular. O cílio tem 1-1,5 μm de comprimento e tem um modelo (9+2) de microtúbulos simples e duplos (Dorsey et al., 2002).

O sistema digestivo se inicia na região anterior. O tegumento e as miofibras longitudinais e circulares da parede do corpo se dobram para o interior para circundar a cavidade bucal (dobra da parede) e o esôfago. A parede externa é constituída de finas projeções situadas na matriz granular que separa a musculatura do esôfago. No fundo da boca tem a cavidade bucal, onde o esôfago se une, penetra no cone muscular e se conecta ao ceco. No lúmen do esôfago existem três tipos de células subesofagianas (I, II e III), assim classificadas de acordo com a sua localização. As células do tipo I ficam posteriores aos fundos da glândula cefálica. Cada célula parece estar conectada à extremidade anterior do esôfago por uma ponte citoplasmática simples. As células do tipo II ficam agrupadas ao redor do esôfago, próximo ao cone muscular na extremidade da ventosa oral (planos 3-4). As células do canal alimentar não parecem funcionais na cercária (Dorsey et al., 2002), o que é condizente com a suspeita de que as larvas não se alimentam no ambiente.

Na região anterior das cercárias, o miócito é uma célula alongada com duas áreas distinguíveis, dependendo da presença ou ausência de miofilamentos. O corpo celular é geralmente em forma de bastão e contém um grande núcleo heterocromático. A maioria das organelas celulares (muitas mitocôndrias, pequenas quantidades de complexo de Golgi, retículo endoplasmático, grande número de ribossomos livres e partículas de glicogênio) está situada próxima à zona afibrilar (Dorsey et al., 2002).

Entre o cone muscular espesso da ventosa oral e a musculatura circular subtegumentar (segmentos 3-4), há uma estrutura alongada, em forma de pêra, que se afila em direção posterior. Ao que parece, possui função sensorial (Dorsey et al., 2002).

As duas células de suporte da ventosa oral são grandes, compactas, situadas na região dorsal próxima ao esôfago, e estão justapostas com os ductos das dez glândulas acetabulares e os da glândula cefálica (Dorsey et al., 2002). Um grupo de células de suporte do corpo consiste de duas ou três células, que são encontradas próximo ao cone muscular na extremidade anterior do corpo cercariano (segmentos 4 e 5).

As miofibras das cercárias variam em tamanho e distribuição entre a ventosa oral (órgão anterior) e o corpo. As fibras musculares grandes são características da musculatura subtegumentar, da ventosa ventral e dos músculos radiais. A marcação dos filamentos de actina com palodina marcada com isotiocianato de fluoresceína e análise por microscopia de varredura laser confocal permitiu evidenciar que no órgão anterior há fibras musculares circulares e transversais, inclusive no cone anterior que rodeia a boca (Mair et al., 2003). A organização da parede muscular no corpo consiste de fibras musculares circulares externas e longitudinais internas, entrelaçadas, cuja contração, possivelmente, permite o alongamento e o encurtamento do corpo (Mair et al., 2003). Na metade anterior do corpo são evidenciados três feixes de fibras diagonais que se localizam abaixo da camada de fibras musculares longitudinais. Essas fibras estão presentes em posição ventral e dorsal, sugerindo que a sua atividade permite o movimento lateral da região anterior e um certo grau de torção (Mair et al., 2003). As miofibras pequenas com miofilamentos esparsos acompanham a boca, cavidade bucal, esôfago, glândulas acetabulares, cecos, células em flama, anéis nervosos, túbulos osmorreguladores e vesícula excretora (Dorsey et al., 2002). A musculatura do esôfago é constituída também por fibras musculares circulares e transversais (Mair et al., 2003).

O sistema digestivo da cercária termina em um fundo de saco fechado, que se conecta ao final do esôfago por um complexo desmossoma septado. No interior da parede do ceco se evidencia um núcleo eucromático, ribossomos, quantidades esparsas de retículo endoplasmático, aparelho de Golgi e poucas mitocôndrias com crista longa. A superfície do lúmen do ceco é complexa, com muitas vilosidades, e geralmente contém corpos com diferentes formas e eletrodensidades. A superfície externa é irregular devido às pregas, talvez representando seu estado de fluxo constante. Imediatamente anterior ao ceco (segmentos 5-6), são evidenciadas células subesofagianas do tipo III. Parece que essas células formam a principal glândula esofagiana, que está alinhada ao esôfago, à altura do gânglio central (Dorsey et al., 2002).

O sistema nervoso da cercária consiste de um gânglio central e seis pares de troncos nervosos longitudinais. O gânglio central cobre a parte anterior do esôfago até o ceco bifurcado. O pericário tem uma forma irregular com núcleo heterocromático e citoplasma com mitocôndrias, pequenas quantidades de retículo endoplasmático, partículas de ARN e vesículas. As papilas multiciliadas embainhadas têm um corpo bulbar com dois ou três cílios projetando de sua superfície. Esse tipo de papila é observado principalmente na parte central do segmento anterior do corpo cercariano (segmentos 4 a 6) (Dorsey et al., 2002).