6 – Sistema Neuromuscular e Controle da Motilidade no Verme Adulto François Noël

6 - Sistema Neuromuscular e Controle

da Motilidade no Verme Adulto

 

François Noël

 

Imagem de Schistosoma mansoni fêmea obtida por microscopia

confocal e dupla marcação neuromuscular. Em vermelho: nervos

anticorpo contra neuropeptídeos GYFIRamida de platelminto,

marcado com rodamina). Em verde: músculos (faloidina marcada

com FITC).

Fonte: Mair et al. (1998). Reproduzida da Parasitology Today, 14(2):

73-76, copyright (1998), com permissão da Elsevier.

Há reconhecida necessidade de se desenvolver novos

fármacos esquistossomicidas para oferecer alternativa ao único

fármaco disponível atualmente (praziquantel), para o qual se

teima aparecimento de resistência. Como o sistema

neuromuscular já demonstrou ser uma fonte fértil em alvos para

fármacos anti-helmínticos, há necessidade de conhecer mais

profundamente a fisiologia da neurotransmissão e contração no

Schistosoma mansoni. Neste parasito, assim como nos

platelmintos de forma geral, existiria um sistema de

comunicação rápida envolvendo moléculas de pequeno peso

molecular (aminas biogênicas, acetilcolina e aminoácidos) e um

sistema mais lento, evolutivamente mais primitivo, que usa

peptídeos como mensageiros. Quanto ao controle da

homeostasia do cálcio, segundo mensageirochave no processo

de contração muscular, ele é qualitativamente similar ao dos

mamíferos, o que não deixa de surpreender, tendo em vista a

enorme distância filogenética entre platelmintos e vertebrados

atuais.

Assim, o objetivo principal deste capítulo é rever as informações

disponíveis quanto ao sistema neuromuscular do S. mansoni, já

que a estratégia de desenho molecular de moléculas

candidatos à fármacos fundamenta-se no prévio conhecimento

do processo fisiopatológico e na conseqüente eleição do alvo

terapêutico mais adequado. Nossa abordagem enfoca o

controle da atividade neuromotora do verme adulto, com ênfase

na metodologia e no raciocínio próprios à farmacologia.

 

Sistema nervoso de Schistosoma mansoni

Filogeneticamente, os platelmintos são importantes por serem os mais primitivos dos animais a possuir um sistema nervoso central e uma simetria bilateral, sendo considerados um elo entre os invertebrados inferiores e superiores (Pax & Bennett, 1992; Halton & Gustafsson, 1996). Certos autores remetem a existência dos platelmintos à origem ou a um período próximo ao da origem dos animais multicelulares (metazoários), de tal forma que estudos sobre a neurobiologia de platelmintos atuais podem fornecer informações valiosas quanto à origem evolucionária do sistema nervoso e sua relação com o sistema muscular (Halton & Gustafsson, 1996; Hanson, 1972).

Apesar das dificuldades, em parte relacionadas com o pequeno tamanho do verme e das suas células, tem-se hoje uma boa visão da anatomia geral do sistema nervoso de S. mansoni. Isto se deve principalmente aos bons resultados obtidos com a técnica de localização imunoistoquímica, inicialmente empregada para marcação de acetilcolinesterase e posteriormente para aminas biogênicas, peptídeos e aminoácidos (Pax & Bennett, 1992); vide, adiante, seção intitulada Neurotransmissores Envolvidos no Controle da Atividade Motora). A combinação desta técnica com a microscopia confocal (confocal scanning laser microscopy) permite atingir um grau de detalhamento ainda maior quanto aos circuitos neuronais.

De forma geral, o sistema nervoso dos platelmintos é formado por um par de gânglios cerebrais e nervos longitudinais conectados por comissuras, além de um arranjo periférico de plexos nervosos

sensoriais e motores (Figura 1 A). Os gânglios cerebrais situam-se

dos dois lados da faringe (Figura 1 B), no terço anterior do animal, logo depois da ventosa oral, de onde partem os troncos nervosos anteriores e posteriores. Os troncos anteriores inervam a ventosa oral, a faringe e certas partes da musculatura corporal. Na porção posterior, há três troncos principais (dorsais, ventrais e laterais) que atravessam longitudinalmente o verme e que, por sua vez, são unidos por comissuras transversais, fazendo com que esta estrutura

inteira assemelhe-se a uma escada (Figura 1 A). Além destes troncos nervosos principais, mais fáceis de serem identificados, existe uma rede periférica de plexos nervosos sensoriais e motores altamente ramificados, como os submusculares, por exemplo (Pax & Bennett, 1992; Halton & Gustafsson, 1996). As ventosas oral e ventral de S. mansoni são ricamente inervadas por nervos serotoninérgicos e peptidérgicos que emanam do tronco nervoso ventral e se ramificam em plexos de fibras finas entrelaçadas com as fibras musculares (Marks et al., 1995), como se pode observar na

Figura 1 B.

Certos autores distinguem um sistema nervoso central (SNC), formado pelos gânglios e troncos nervosos principais, e um sistema nervoso periférico (SNP), formado por troncos nervosos auxiliares e pelos plexos nervosos subtegumental, submuscular, digestivo e genital. Em contraste com o sistema nervoso periférico de invertebrados superiores, há uma abundância de corpos celulares ao longo dos troncos nervosos, tal como nos plexos nervosos dos platelmintos. Assim, a maior parte do sistema nervoso dos platelmintos, de forma geral, é composta por vários pequenos neurônios, havendo numerosos interneurônios entre os gânglios cerebrais e as partes mais periféricas do sistema nervoso (Pax & Bennett, 1992).

Considera-se que os gânglios cerebrais formam um 'verdadeiro cérebro', porque eles inibem e controlam os reflexos da rede nervosa periférica (Halton & Gustafsson, 1996). Cada par de gânglios consiste de um amálgama fibrilar de axônios e dendritos, densamente entrelaçados e freqüentemente acoplados por contatos sinápticos e junções comunicantes (gap junctions), rodeado por uma casca de corpos celulares neuronais pouco compactados. Os pares de gânglios são conectados por uma ou mais comissuras, predominantemente fibrosas, em forma de anel (Halton & Gustafsson, 1996). Somente nos gânglios encontram-se células unipolares, evolutivamente mais avançadas, enquanto as células multipolares e bipolares, mais primitivas, são encontradas tanto no SNC quanto no SNP.

Figuras 1A e 1B – Esquema geral do sistema nervoso de

trematódeos

 

ac: acetábulo (ventosa ventral); cg: gânglio cerebral; co: comissura;

dnc: tronco nervoso dorsal; lnc: tronco nervoso lateral; os: ventosa

oral; ph: faringe; smp: plexo submuscular; vnc: tronco nervoso

ventral; tc: conexão transversal. Nota-se que S. mansoni tem a

particularidade de não possuir faringe, já que o esôfago está

diretamente ligado à boca, que se abre no meio da ventosa oral.

Fonte: Halton & Gustafsson (1996).

Uma matriz extracelular de fino material intersticial fibroso, que se ramifica entre vários tipos celulares e ao redor de órgãos, serve de apoio e isolamento para os neurônios. Outrossim, células não neuronais morfologicamente parecidas com células gliais de invertebrados poderiam também exercer um papel de suporte e isolamento dos neurônios, além de participar do metabolismo neuronal, com transporte e troca de substâncias (Halton & Gustafsson, 1996).

Os neurônios dos platelmintos são altamente secretórios e contém um grande número de vesículas intracelulares tanto no corpo celular quanto nos seus prolongamentos (Pax & Bennett, 1991). O conteúdo destas vesículas, de morfologia heterogênea, pode ser liberado em sinapses clássicas ou via secreção parácrina nos espaços extracelulares, perto de células-alvo (Halton & Gustafsson, 1996). Assim, o sistema nervoso dos platelmintos funcionaria não só como um sistema nervoso per se, mas também como um sistema parácrina, por liberar substâncias moduladoras no espaço extracelular próximo de células ou órgãos-alvo. É importante lembrar que uma sinalização a longa distância, através da liberação de neurohormônios num sistema circulatório, não é possível para o Schistosoma (Pax & Bennett, 1992).

 

Sistema muscular de S. mansoni

Entre o tegumento e as células subtegumentares, encontra-se uma região de musculatura lisa, tipicamente organizada em camadas circulares e longitudinais, com algumas fibras adicionais radialmente

dispostas, particularmente no verme macho (Figura 2). Esta musculatura apresenta semelhanças morfológicas com o músculo liso de animais superiores, como por exemplo um retículo endoplasmático relativamente pouco denso (Silk & Spence, 1969), apesar de funcionalmente ativo e capaz de estocar uma quantidade de cálcio suficiente para sustentar a contração do músculo (ver, adiante, a seção Controle da Homeostasia do Cálcio). Experimentos de contração mostraram que a musculatura de S. mansoni é também similar ao músculo liso de mamíferos quando analisados seus aspectos funcionais (Fetterer et al., 1978). É importante ressaltar a existência de diferenças fisiológicas e farmacológicas importantes entre os músculos longitudinais e circulares do corpo do verme adulto macho (Pax, Siefker & Bennett, 1984). A musculatura longitudinal seria importante para a motilidade do verme (ver, adiante, a seção Modelos Experimentais para Avaliação da Atividade Motora do Verme Adulto), ao passo que a musculatura circular teria como função principal a manutenção do diâmetro do canal ginecofórico e, portanto, o pareamento do casal de vermes.

Figura 2 – Diagrama ilustrando a conexão do tegumento (T) à célula

subtegumentar (SC) e às camadas musculares circulares e

longitudinais

 

Fibras musculares : camada circular externa (cmf) e camada

longitudinal mais interna (Imf).

Fonte: Hockley (1973).

Mais recentemente, usando microscópio confocal e um marcador muscular fluorescente (faloidina), Mair et al. (2000) foram capazes de descrever detalhadamente a morfologia da musculatura do verme adulto incluindo a organização das fibras musculares na parede do corpo e nas ventosas. No corpo, as fibras circulares são delgadas e intercaladas entre espinhas que são freqüentes,

sobretudo na parte dorsal do verme macho (Figura 2). As fibras longitudinais, localizadas logo abaixo das circulares, são duas vezes mais espessas e apresentam uma morfologia diferente, do tipo fusiforme (spindle fibre). Estas fibras constituem uma camada muscular compacta de fibras intimamente empacotadas. Debaixo desta camada muscular, encontram-se poucas fibras diagonais que, ao contrário das demais, não formam uma camada muscular compacta. A musculatura corporal bem desenvolvida do verme macho, assim como os espinhos que revestem sua superfície, principalmente na porção posterior à ventosa ventral, facilitam sua locomoção no interior das veias, mesmo em sentido contrário ao da corrente sanguínea. Assim, o macho consegue alcançar os diminutos ramos venosos, permitindo à fêmea, carregada no canal ginecóforo, fazer suas posturas nos lugares mais convenientes (Rey, 2002). Fibras musculares com semelhante organização foram também encontradas nas ventosas ventral e oral (Mair et al., 2000).

Do ponto de vista ultra-estrutural, estudos de microscopia eletrônica indicaram que as fibras musculares são constituídas de miofilamentos delgados e espessos, organizados irregularmente, estando cada filamento espesso rodeado por oito a 14 filamentos delgados (Silk & Spence, 1969). O uso de microscopia confocal e de dupla marcação com anticorpos antifaloidina (marcador de fibras musculares) e anticorpos antineurotransmissor (marcador neuronal) permitiu revelar detalhes até então desconhecidos da inervação dos diferentes órgãos e da relação nervo-músculo (Mair et al., 1998, 2000). Assim, pode-se verificar que fibras nervosas serotoninérgicas (mas não peptidérgicas) formam um plexo nervoso submuscular extenso que se estende ao longo do corpo do verme adulto. As ventosas oral e ventral de S. mansoni são também ricamente

inervadas por fibras serotoninérgicas e peptidérgicas (Figura 3) que emanam dos gânglios cerebrais através do tronco nervoso anterior e se ramificam em plexos de fibras finas entrelaçadas com as fibras musculares (Marks et al., 1995; Mair, 1998). Recentes evidências indicam uma inervação semelhante das ventosas por fibras GABAérgicas (ver, adiante, a subseção Neuropeptídeos, inserida na seção Neurotransmissores Envolvidos no Controle da Atividade Motora)

Figura 3 – Imagem de Schistosoma mansoni fêmea obtida por

microscopia confocal e dupla marcação neuromuscular

 

Em vermelho: nervos (anticorpo contra neuropeptídeo GYFIRamida

de platelminto, marcado com rodamina). Em verde: músculos

(faloidina marcada com FITC).

Fonte: Mair et al. (1998). Reproduzida da Parasitology Today, 14(2):

73-76, copyright (1998), com permissão da Elsevier.

 

Modelos experimentais para avaliação da

atividade motora do verme adulto

A observação do comportamento de S. mansoni in situ é difícil, o que torna praticamente imprescindível seu isolamento fora do habitat natural para estudos in vitro. Infelizmente, o impacto de tais procedimentos sobre o comportamento e a fisiologia do verme é desconhecido, havendo indícios de modificações morfológicas após várias horas de incubação, para o que depende fortemente o meio utilizado (Carlisle, Weisberg & Bentley, 1983).

Os vermes adultos machos em solução salina apresentam uma variedade de movimentos, entre os quais rápidos encurtamento e prolongamento do corpo, movimentos ondulatórios e ondas peristálticas propagadas ao longo do corpo, no eixo anterior/posterior (Mendonça-Silva, Pessôa & Noël, 2002).

Desta forma, os primeiros modelos utilizados para se avaliar a

motilidade1 dos vermes (e o efeito de substâncias sobre esta atividade) baseavam-se na observação visual (Barker, Bueding & Timms, 1966; Tomosky, Bennett & Bueding, 1974; Mellin et al., 1983; Da Silva & Noël, 1995), e avaliação semiquantitativa usando-se diferentes escalas de atividade, baseadas na freqüência e

intensidade das contrações (Quadro 1, adiante). Em combinação com estas medidas de motilidade, certos autores estabeleceram medidas separadas do comprimento do verme (Mellin et al., 1983; Da Silva & Noël, 1995), da atividade elétrica superficial (Mellin et al., 1983) ou da capacidade de fixação do verme à superfície de vidro,

através da sua ventosa ventral (Da Silva & Noël, 1995) (Figura 4 e

Quadro 1, adiante).

Figura 4 – Modelo para avaliação da fixação de Schistosoma

mansoni através da sua ventosa ventral. Vermes adultos machos

eram colocados em 3 ml de solução de Tyrode mantida a 37°C. Os

vermes fixados no fundo do vidro de relógio eram facilmente

discriminados dos outros pelos movimentos rotatórios dos seus

corpos em torno da ventosa, quando o vidro de relógio era

levemente agitado

 

A: Situação-controle, mostrando a posição de um verme fixado

antes (1) e depois de leve agitação do vidro de relógio em posição

'sul' (2) ou 'norte' (3).

B: Exemplo de um verme não fixado, flutuando, com seu corpo

inteiro acompanhando os movimentos do líquido após agitação em

posição 'sul' (2) ou 'norte' (3), como ocorre após adição de

praziquantel.

C: Cinética do efeito (inibidor) do praziquantel 0, 1 (o ) e 1 μM (▲)

sobre a capacidade de fixação de verme (□, controle).

Fonte (C): Da Silva & Noël (1995).

Outros autores desenvolveram um instrumento que permitia registrar automaticamente os movimentos (de deslocamento do

corpo) de forma indireta (Quadro 1, adiante). Hillman & Senft (1973) adaptaram o princípio do teste do campo de atividade (activity cage) utilizando para isso um conjunto de células fotoelétricas e fibras óticas: a cada movimento do verme que levasse ao cruzamento de

um feixe de luz correspondia uma contagem eletrônica (Figura 5 e

Quadro 1). Simultaneamente, Brown et al. (1973) desenvolveram um monitor de atividade baseado no efeito Doppler (deslocamento da freqüência do ultrasom refletido pelos vermes em movimentos).

Figura 5 – Modelo para medição automática dos movimentos

corporais de Schistosoma mansoni

 

A: Instrumento constituído de fonte luminosa (light source), célula

perfundida com meio através de bomba (flow of medium from

pump), em cujo fundo (glass bottom) estão depositados os vermes. Do fundo da célula partem 19 fibras óticas (fiber optic) em direção a

fotocélulas (photocells) ligadas a amplificadores (amplifiers).

B: Detalhes de um casal de vermes no fundo da célula perfurada,

com 19 buracos em contato com as fibras óticas.

C: Efeito de 30 µ M de serotonina (5-HT) e 100 µM de carbacol

(CCH) sobre a motilidade de S. mansoni, expressa em contagens

das fotocélulas num intervalo de dois minutos.

Fonte: Hillman & Senft (1973). Reproduzida do Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics, 185(2): 177-184,

copyright (1973), com permissão da Aspet.

O modelo desenvolvido por Fetterer et al. (1978) e por Fetterer, Pax & Bennett (1977) permite registrar de forma direta os movimentos peristálticos superficiais e de encurtamento, com o uso de eletrodos

de sucção e transdutor de tensão (Figura 6 e Quadro 1, adiante). Estes movimentos peristálticos parecem estar relacionados à capacidade de locomoção do verme in vivo, ao contrário dos movimentos ondulatórios do corpo, cuja relevância fisiológica é desconhecida (Fetterer, Pax & Bennett, 1980).

Um modelo semelhante foi desenvolvido por Soares de Moura & Rozental (1983), tendo tais autores adaptado um sistema classicamente usado em farmacologia para medição da tensão de músculos lisos: neste caso, o verme era fixado nas suas duas extremidades e realizava-se o registro, isométrico, da força desenvolvida durante a contração medindo-se, sobretudo, a contração da musculatura longitudinal. Pax et al. (1996) fizeram uma contribuição interessante ao adaptar um modelo anterior (Fetterer, Pax & Bennett, 1980) para fixar fatias de músculos longitudinais ou circulares em vez de vermes inteiros. Assim, estes autores obtiveram dados interessantes quanto às características específicas das duas musculaturas, cujos papéis fisiológicos seriam diferentes. A musculatura longitudinal seria importante para a motilidade do verme, ao passo que a musculatura circular teria como função principal a manutenção do diâmetro do canal ginecofórico e, portanto, o pareamento do casal de vermes (Pax, Siefker & Bennett, 1984). Apesar de esta preparação ser um pouco menos heterogênea, evitando registrar um efeito muscular oriundo de uma

ação no sistema nervoso central (Quadro 1, adiante), ela ainda continha terminações nervosas.

Figura 6 – Modelo para medida direta do encurtamento de

Schistosoma mansoni

 

A: Instrumento para registro simultâneo do encurtamento do verme

adulto e da atividade elétrica superficial, em dois pontos: um

pequeno eletrodo fixo de sucção (stationary electrode) é ancorado

na ponta da cauda (electrode anchor) e outro flexível (flexible

electrode), na porção dorsal do verme. Este segundo eletrodo é

utilizado como elemento de ligação entre o verme e o transdutor (transducer) de tal forma a medir o movimento (de encurtamento) do

verme.

B: Registro de tensão muscular de um verme adulto macho,

mostrando o efeito rápido, elevado e mantido do praziquantel (1 µ

M). Escala em mg de tensão.

C: Efeitos de 10 µM de serotonina (5-HT) e 100 µ M de carbacol

(CCH) sobre a atividade mecânica (aqui expressa como

encurtamento da porção do verme entre os dois eletrodos) de um

verme adulto macho. Escala em mm.

Fontes: Fetterer, Pax & Bennett (1980).

Graças à obtenção, por digestão de pedaços de vermes adultos, de fibras musculares isoladas, Blair et al. (1991) permitiram o estudo direto de substâncias sobre as células musculares sem a interferência de células nervosas.

Devemos, contudo, ficar cautelosos quanto à generalização dos dados obtidos, pois somente é usado um tipo de fibras com

morfologia bem peculiar (fibras esfiapadas, vide Figura 7 e Quadro

1), as quais poderiam corresponder às fibras dorsoventrais que delineiam o canal ginecofórico e não às fibras longitudinais (fusiformes) que constituem boa parte da musculatura somática do verme (Mair et al., 2000 ) e que são responsáveis pelo seu encurtamento.

Recentemente, implantou-se um novo modelo experimental (Mendonça-Silva, Pessôa & Noël, 2002) para que se pudesse avaliar a atividade motora de S. mansoni, baseado na observação macroscópica dos vermes não manipulados e na análise das

imagens captadas continuamente por uma câmera digital (Figura 8). Desta forma, tentou-se aliar as vantagens das técnicas antigas de observação dos padrões comportamentais de postura, complexos mas ricos, às vantagens de técnicas de análise mais objetivas e

quantitativas (Quadro 1, adiante).

Figura 7 – Modelo para estudo do estado contrátil de fibras

musculares dispersas, isoladas de Schistosoma mansoni

 

A: Foto mostrando fibras contráteis obtidas por digestão de pedaços

de vermes adultos machos. São destacados os três tipos de fibras

contráteis encontrados: poucas fibras fusiformes (spindle fibers) e

um número semelhante de células com terminações bifurcadas ou

esfiapadas (frayed cells) e de fibras crescentes, em forma de lua

(crescent fibers). Uma fibra esfiapada é mostrada antes (B) e logo

depois (C) da adição do neuropeptídeo YIRFamida (1 nM), que

produz intensa contração da parte não-esfiapada da fibra. (D)

representa a fibra alguns segundos após a perfusão do peptídeo,

quando começa a 'relaxar'.

Fonte: Tim Day (figuras originais, comunicação pessoal).

Figura 8 – Modelo para avaliação quantitativa do efeito de fármacos

sobre a atividade motora de S. mansoni

 

A: Equipamento utilizado: recipiente de vidro dividido em duas

células, contendo 3-4 vermes cada, em banho-maria. Câmera digital

ligada a um videocassete e a uma televisão. O sinal é também

direcionado para um computador, onde as imagens são analisadas. B: Fotos típicas, mostrando os vermes na condição-controle e após adição de três substâncias. Nota-se que as moléculas empregadas produziram padrões bem distintos de mudança de atividade motora

e aspecto dos vermes. O praziquantel produz um encurtamento

rápido, intenso e mantido do verme que adota a forma de meia-lua e

perde toda a sua motilidade (paralisia espástica). Os efeitos do

praziquantel sobre a musculatura do verme são detalhados no

Quadro 1, adiante. A nicotina produz um alongamento do verme e

uma paralisia flácida (ver detalhes na Figura 9, adiante). O ácido caínico produz o encolhimento dos vermes, que se apresentam em

forma de saca-rolhas e perdem sua motilidade (Figura 10, adiante).

Utilizando os recursos de um programa de análise de imagem (Image-Pro®), pôde-se quantificar tanto o encurtamento dos vermes induzido por praziquantel ou ácido caínico, mediante cálculo da área corporal, como medir a diminuição dos movimentos (paralisia

flácida) provocada pela nicotina (Figura 9, adiante). Para esta última análise, foi necessário criar um parâmetro 'deslocamento' para se quantificar a motilidade do verme (Pessôa, Castro & Noël, 2005).

Quadro 1 – Comparação entre as diferentes técnicas usadas para

medir a atividade motora de Schistosoma mansoni

Método Tipo de Vantagens Desvantagens Refs.**

atividade

medida

Microscopia Deslocamento

global ou Direto

parcial do Custo e (1)

Subjetivo

corpo* + facilidade (2)

Semiquantitativo

peristaltismo Riqueza de (3)

+ alteração de informações comprimento3

Deslocamento

global ou Direto

parcial do Custo e

corpo + facilidade

Subjetivo

Visual peristaltismo Riqueza de (4)

Semiquantitativo

+ alteração de informações

comprimento Ventosa

+ fixação pela (fixação)

ventosa

Deslocamento

Fotoelétrico (5) parcial do global ou Quantitativo Indireto Intensa

Automático luz

corpo

Deslocamento

Ultra-som global ou Quantitativo Indireto (6) parcial do Automático

corpo

Encurtamento + Direto

Transdutor, Quantitativo peristaltismo Estresse mecânico (7)

eletrodo músculo

+ atividade Manipulação (8)

móvel longitudinal

elétrica delicada

= Isotônico

superficial

Transdutor, Tensão Direto Estresse (9)

eletrodo longitudinal + Quantitativo mecânico

fixo peristaltismo músculo Manipulação

longitudinal delicada

Isométrico

 

musculares Fatias Tensão do Direto Quantitativo músculo Presença de músculo longitudinal terminações circular (10) + Tensão do nervosas Sem transdutor músculo periféricas influência circular do SNC

 

musculares Fibras Contração Quantitativo (esfiapada): muscular Sem (11) fibra isoladas ‘pura' influência dorsoventral e Direto tipo de fibra Somente um

do SN

não longitudinal

 

Software Imagem Deslocamento Análise dos Direto global ou Quantitativo dados parcial do (12) digital + Controle trabalhosa e corpo + (13) paralelo da variável em alteração de gravação função do efeito comprimento

* movimento ondulatório do corpo (parcial ou de uma extremidade a

outra), a ser diferenciado do movimento peristáltico superficial (que

não leva a um deslocamento do verme).

* * Referências relacionadas ao Quadro 1: (1) Barker, Bueding & Timms (1966). (2) Tomosky, Bennett & Bueding (1974). (3) Mellin et al. (1983). (4) Da Silva & Noël (1995). (5) Hillman & Senft (1973). (6)

Brown et al. (1973). (7) Fetterer et al. (1978). (8) Fetterer, Pax &

Bennett (1977). (9) Soares de Moura & Rozental (1983). (10) Pax,

Siefker & Bennett (1984). (11) Blair et al. (1991). (12) Mendonça-

Silva, Pessôa & Noël (2002). (13) Pessôa, Castro & Noël (2005). Neurotransmissores envolvidos no controle da

atividade motora

A maioria dos neurônios se comunicam entre si e com outras células por intermédio de mensageiros químicos (neurotransmissores) que eles sintetizam e secretam. Nos platelmintos, de forma geral, existiria um sistema de comunicação rápida envolvendo moléculas de pequeno peso molecular (aminas biogênicas, acetilcolina e aminoácidos) e um sistema mais lento, e evolutivamente mais primitivo, que usaria peptídeos como mensageiros (Halton & Gustafsson, 1996). O estatuto de candidato a neurotransmissor baseia-se em evidências neuroanatômicas e fisiológicas/farmacológicas. As evidências neuroanatômicas são obtidas por experimentos de citoquímica que fazem uso de anticorpos e técnicas microscópicas anteriormente descritas, ao passo que as evidências farmacológicas são obtidas por meio de diversos modelos experimentais que permitem avaliar o efeito de substâncias exógenas sobre a motilidade ou contração/relaxamento

da musculatura do verme. No Quadro 2 são apresentas as substâncias que podem ser consideradas neurotransmissores ou neuromoduladores em S. mansoni, assim como seus efeitos sobre a atividade motora do verme adulto.

Quadro 2 – Candidatos a neurotransmissores envolvidos no controle

da motilidade de Schistosoma mansoni adulto

Atividade

motora

(motilidade);

Contração

do verme

Localização Fibras isoladas

Mediadores inteiro;

Contração

de fatia de

músculo

(L/C)

SNC SNP MS

Aminas

↑

motilidade(4),

(5) (6) ,

↑ freqüência

 

Serotonina P(1) (1) e amplitude (1) P P (7) ↑ resposta ao (2) (2) contração (2) P P P + (9) induz K (3) (3) (3) P P P contração

rítmica (8)

↑ (L) ou ↓ (C)

tônus

muscular(8)

Dopamina P(2) (2) (2) P A → (↓) resposta ao

P(10) (4) (11) (10) (10) P A motilidade , FMRFamida

(5)

↑

comprimento

verme (4) (5) ,

↓ tônus

muscular (L

e C)(8)

→

motilidade(4),

Noradrenalina, (2) (2) (2) (5) P P A

Adrenalina (10) (10) (10) P P A ↑

comprimento

verme (4) (5) ,

paralisia

flácida(4) (5) , ,

 

Acetilcolina (12) (6) (13) (14) , , , resposta ao (15) (11) FMRFamida (12) * P P ↓ tensão (L) ↓ (M) (13) → (N) ↓ tônus

muscular (L

e C)(8)

Aminoácidos

→

 

(ácido caínico) Glutamato motilidade(5), (17) Contração (16) (17) → motilidade: ↓

(16) (5) →

 

GABA P (18) (18) P P (5) (18) → → resposta ao (11) motilidade FMRFamida

Neuropeptídeos

→

FaRPs P (2) (2) P A (20) ↑ tensão da (2) motilidade (19) (19) Contração,

fatia(5)

SNC: sistema nervoso central. SNP: sistema nervoso periférico. MS:

musculatura somática. L: músculo longitudinal. C: músculo circular.

P: presente. A: ausente.

* Os efeitos indicados são de substâncias colinomiméticas seletivas

(muscarínicas M e nicotínicas N) ou não (por exemplo, carbacol) e

não necessariamente da própria acetilcolina. Localização de

atividade acetilcolinesterásica (e não de acetilcolina).

FaRPs: peptídeos relacionados a FMRFamida (RYIRFa, GNFFRFa,

GYIRFa ou YIRFa).

Detalhes das técnicas utilizadas para medir a atividade motora

global do verme (motilidade), a contração do verme inteiro

(encurtamento do músculo longitudinal + peristaltismo) e a contração

de fibras isoladas são fornecidos anteriormente.

Referências relacionadas ao Quadro 2:

(1) Mair et al. (2000). (2) Gustafsson (1987). (3) Bennett & Bueding

(1971). (4) Tomosky, Bennett & Bueding (1974). (5) Mellin et al.

(1983). (6) Hillman & Senft (1973). (7) Pax et al. (1996). (8) Pax,

Siefker & Bennett (1984). (9) Day, Bennett & Pax (1994). (10) Gianutsos & Bennett (1977). (11) Day et al. (1996). (12) Fripp

(1967). (13) Pax & Bennett (1991). (14) Barker, Bueding & Timms

(1966). (15) Pessôa, Castro & Noël (2005). (16) Mendonça-Silva et

al. (2002). (17) Miller et al. (1996). (18) Mendonça-Silva et al. (2004).

(19) Day & Maule (1999). (20) Day et al. (1994).

Serotonina

A serotonina (5-HT) parece ser a amina biogênica dominante em todos os platelmintos, e há evidências experimentais de que exerça um papel importante no controle neuromuscular de S. mansoni, sendo um neurotransmissor (ou modulador) excitatório.

Evidências neuroanatômicas

Estudos de microscopia outrora mencionados demonstraram a existência de uma inervação serotoninérgica extensa e uma aparência varicosa das fibras serotoninérgicas, sugerindo a presença de numerosos sítios de liberação do neurotransmissor ao longo dos axônios (Mair et al., 2000; Gustafsson, 1987).

Evidências fisiológicas e/ou farmacológicas

A adição de serotonina no meio de incubação aumenta a motilidade

do verme adulto, in vitro, (Figura 5 C e Quadro 2) e aumenta a freqüência e amplitude das contrações do verme inteiro, quando fixado de forma a se medir, principalmente, a contração da sua

musculatura longitudinal (Figura 6 C e Quadro 2).

Estes efeitos podem ser o resultado de ativação de neurônios serotoninérgicos que inervam a massa muscular corporal e/ou de ativação direta da musculatura. Experimentos com fibras isoladas mostraram que a serotonina é capaz de ativar diretamente a célula muscular. Porém, este efeito é mais sutil: a serotonina não contrai a fibra (pelo menos a fibra de tipo 'esfiapada'), mas é indispensável para que a fibra mantenha sua contratilidade (Day, Bennett & Pax, 1994). Desta forma, a serotonina poderia atuar como modulador (e não neurotransmissor) excitatório, pelo menos no que diz respeito à junção neuromuscular. A situação parece mais complexa ainda, pois a serotonina tem efeitos diferentes dependendo do músculo somático estudado: apesar de induzir uma atividade contrátil rítmica em ambos os músculos, ela aumenta o tônus do músculo longitudinal enquanto diminui o tônus do músculo circular (Pax, Siefker & Bennett, 1984).

Quanto à presença e natureza de um receptor serotoninérgico em S. mansoni, estudos funcionais indicam a presença de um receptor com perfil farmacológico diferente dos subtipos de receptores serotoninérgicos presentes em mamíferos (Pax, Siefker & Bennett, 1984; Mellin et al., 1983; Willcokson & Hillman, 1984). Basicamente, esta caracterização farmacológica é realizada avaliando-se a atividade de diversos agonistas e antagonistas serotoninérgicos, sendo alguns seletivos para determinados subtipos de receptores serotoninérgicos em mamíferos. Graças aos avanços das técnicas de biologia molecular, estão agora disponíveis informações estruturais quanto à natureza do receptor serotoninérgico de S. mansoni. De fato, um cDNA codificando um possível receptor serotoninérgico foi clonado por Hamdan & Ribeiro (Hamdan & Ribeiros, 1999) e uma seqüência organizada de etiquetas de regiões codantes (EST: Expressed-Sequence Tags) correspondendo a um gene codificando um receptor serotoninérgico foi reportado por

Verjovski-Almeida et al. (Verjovski-Almeida, 2003) (Quadro 3).

A maior fonte de 5-HT de S. mansoni parece provir do hospedeiro, por difusão passiva e carreadores específicos (Wood & Mansour, 1986). Por um lado, esta dependência de serotonina poderia explicar o tropismo do parasito para o sistema venoso mesentério do hospedeiro, onde a concentração plasmática de serotonina, produzida pela mucosa gastrintestinal, é três vezes maior do que no sangue arterial (Erspamer & Testini, 1959). Por outro lado, a recente caracterização de uma enzima triptofano-hidroxilase funcional em S. mansoni (Hamdan & Ribeiros, 1999) sugere que este verme é capaz de sintetizar a serotonina a partir de triptofano, de forma endógena, ao contrário do que se pensava até então.

Catecolaminas e Histamina

Evidências neuroanatômicas

Com técnicas histoquímicas e bioquímicas (Quadro 2), pequenas quantidades de catecolaminas (dopamina, noradrenalina e/ou adrenalina) foram detectadas nos gânglios cerebrais e troncos nervosos, assim como numa rede de fibras inervando o parênquima e a camada muscular de S. mansoni (Bennett & Bueding, 1971). Quatro pares de grandes neurônios reativos foram localizados ao longo dos troncos nervosos do verme (Gianutsos & Bennett, 1977). As catecolaminas têm uma distribuição mais discreta e mais restrita do que a serotonina que é encontrada de forma difusa e ampla dentro do parênquima, em numerosos grânulos de armazenamento (Bennett & Bueding, 1971).

Evidências fisiológicas e/ou farmacológicas

Dopamina, noradrenalina e adrenalina não afetam a motilidade do verme adulto mas produzem um grande aumento do seu

comprimento (ver Quadro 2), correspondendo ao relaxamento da sua musculatura longitudinal (Pax, Siefker & Bennett, 1984). Estes efeitos seriam decorrentes da ação em receptor dopaminérgico, já que eles são bloqueados efetivamente por antagonistas dopaminérgicos, enquanto antagonistas a e β-adrenérgicos são pouco eficientes (Tomosky, Bennett & Bueding, 1974).

Considerando-se a possibilidade de haver aminas não catecolaminérgicas envolvidas na neurotransmissão do esquistossoma, vale ressaltar a clonagem de um cDNA codificando uma proteína acoplada à proteína G, que poderia corresponder a uma nova classe de receptor histaminérgico, própria dos platelmintos, e que estaria relacionada ao controle da motilidade do verme (Hamdan et al., 2002).

Acetilcolina

Evidências neuroanatômicas

Estudos histoquímicos revelaram uma extensa marcação para atividade colinesterásica, uma prova indireta da presença de acetilcolina, no sistema nervoso de S. mansoni (Fripp, 1967) assim como de todos os platelmintos estudados. Como a serotonina, a acetilcolina tem distribuição ampla, em vários órgãos.

Evidências fisiológicas e/ou farmacológicas

Assim como na maioria dos trematódeos, a acetilcolina (ACh) parece ter um papel fisiológico importante como neurotransmissor inibitório em S. mansoni, já que a atividade muscular deste verme é

reduzida por agentes colinomiméticos (carbacol e nicotina, 2 por exemplo) e inibidores de acetilcolinesterase (Tomosky, Bennett & Bueding, 1974; Mellin et al., 1983) produzindo uma paralisia flácida

(Quadro 2). Esta paralisia flácida pode ser definida como perda de motilidade acompanhada por alongamento do verme em decorrência do relaxamento da sua musculatura longitudinal

somática (Figura 9).

Figura 9 – Imagens digitalizadas mostram as posturas de vermes

adultos machos na ausência (controle, A-D) e na presença de 100

de nicotina (E-H). As imagens A e E correspondem à postura dos vermes antes da adição de nicotina (E). As imagens F e G mostram

o efeito da nicotina um e dez minutos após sua adição: os vermes

são alongados e permanecem exatamente na mesma posição

durante todo este intervalo de tempo (paralisia flácida). B e C são

imagens correspondendo aos controles temporais. Nota- se que o

efeito da nicotina é completamente revertido dez minutos após

lavagem (H). Detalhes da técnica utilizada para medir a atividade

motora global do verme (motilidade) são fornecidos na Figura 8

 

Fonte: Pessôa, Castro & Noël (2005).

Quanto ao tipo de receptor colinérgico envolvido, evidências farmacológicas apontam para um receptor diferente dos receptores de mamíferos, já que tanto agonistas muscarínicos (porém, não a própria muscarina) como nicotínicos mimetizam o efeito da acetilcolina (Pax & Bennett, 1991). Uma diferença qualitativa entre os efeitos de um análogo sintético da acetilcolina sobre a atividade motora de S. mansoni e preparações neuromusculares de vertebrados foi evidenciada por Willcockson et al. (1981), que propuseram ser possível desenhar moléculas com neurotoxicidade espécie-seletiva (vide seção Sistema Neuromuscular como Alvo para Fármacos Esquistossomicidas: perspectivas). Evidentemente, a complexidade deste modelo não permite conclusão definitiva, não se podendo excluir a hipótese da existência de vários tipos de receptores colinérgicos e de ação em múltiplos sítios (SNC, SNP e musculatura). Em um modelo menos heterogêneo, com um tipo

peculiar de fibras musculares isoladas (Figura 7 e seção Sistema Muscular do Schistosoma mansoni), os dados experimentais apontam também para um receptor nicotínico de farmacologia não convencional (Day et al., 1996). Neste caso particular, agonistas muscarínicos como a arecolina e o carbacol (mas não a muscarina), por um lado, são capazes de bloquear o efeito contrativo da FMRFamida, ao passo que a nicotina não tem efeito. Por outro lado, este efeito colinérgico é bloqueado pela α-bungarotoxina (clássico bloqueador do receptor nicotínico ‘muscular’ e das isoformas contendo a subunidade α ), mas não pela atropina, antagonista 7

muscarínico clássico em mamíferos, que bloqueia também o efeito paralisante que o carbacol exerce quando aplicado em vermes inteiros (Mellin et al., 1983).

O papel da acetilcolina como neurotransmissor é reforçado pelo fato de o verme possuir as enzimas necessárias para sua síntese e degradação – colina acetiltransferase e acetilcolinesterase, respectivamente. Esta última enzima é encontrada na cercária e em todos os estágios do ciclo evolutivo de S. mansoni (Day et al., 1996). A acetilcolinesterase está presente em tecidos musculares e há uma clara evidência de que está envolvida no controle da função muscular (Pax, Siefker & Bennett, 1984). Nota-se que a acetilcolinesterase é também encontrada na superfície do parasito, covalentemente ancorada ao tegumento via fosfatidilinositol, onde teria papel fisiológico importante na captação de glicose. Esta enzima parece ser o alvo terapêutico do metrifonato, anticolinesterásico particularmente eficaz contra S. haematobium, espécie que se caracteriza por uma alta atividade acetilcolinesterásica (Camacho et al., 1994).

Glutamato Apesar de ser candidato a neurotransmissor em pelo menos dois cestódios (Halton & Gustafsson, 1996), não há evidências diretas da presença de um sistema de neurotransmissão glutamatérgico em trematódeos, muito menos em S. mansoni. Entretanto, há índices como a presença de imunomarcação com anticorpos antiglutamato no sistema nervoso central e periférico de F. hepatica adulta (Brownlee & Fairweather, 1996) e de cercárias de S. mansoni (Solis-Soto & Brink, 1994), assim como a existência de um transportador de glutamato em fibras musculares isoladas de S. mansoni adulto (Miller et al., 1996).

Mais recentemente, estudos de binding realizados em frações subcelulares de S. mansoni evidenciaram a presença de sítios de ligação de baixa afinidade para o [3H]-ácido caínico, um ligante dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo cainato em mamíferos, reforçando a possibilidade de uma via de sinalização, no parasito, para o glutamato (Mendonça-Silva, Pessôa & Noël, 2002). A adição de ácido caínico no meio de incubação produziu uma drástica alteração do padrão de motilidade dos vermes adultos, os quais se apresentavam encolhidos em forma de saca-rolhas, sem

movimentos (Figura 10).

Figura 10 – Na imagem digitalizada visualizamos o padrão de

postura de Schistosoma mansoni adultos machos na ausência

(controle, A-C) e presença de 10 de ácido caínico (D-F). Os vermes

controles apresentam uma variedade de posturas, incluindo

movimentos peristálticos (A). Nota-se que o ácido caínico produziu o

encolhimento dos vermes, que se apresentam em forma de saca-

rolhas e perderam sua motilidade, de forma tempo-dependente (vide

efeitos após dois minutos, em D, e vinte minutos, em E). Os efeitos

do ácido caínico são reversíveis, tendo sido completamente

revertidos dez minutos após a lavagem (F). Detalhes da técnica

utilizada para medir a atividade motora global do verme (motilidade)

são fornecidos na Figura 8 B

 

Fonte: Mendonça-Silva, Pessôa & Noël (2002).

Como um todo, os dados existentes indicam a presença de um sistema de sinalização glutamatérgico em S. mansoni, talvez envolvido no controle da motilidade do verme adulto, apesar de que os efeitos do ácido caínico sobre a motilidade do verme podem ter se originado em receptores superficiais localizados no tegumento e, portanto, ter relevância farmacológica e não fisiológica (Mendonça-Silva, Pessôa & Noël, 2002).

A identificação de receptores de glutamato, acoplados tanto a canais iônicos, como também à proteína G, assim como de

glutamato sintase e glutamato desidrogenase (Quadro 3), corroboram a hipótese de existir uma via de sinalização do L-glutamato, em S. mansoni.

 

GABA

O γ-ácido aminobutírico (GABA) é um importante neurotransmissor inibitório de grande ocorrência tanto em vertebrados como em invertebrados. Entretanto, apesar de numerosas provas da presença de transmissão GABAérgica em nematódeos, houve pouca exploração quanto ao papel fisiológico deste aminoácido em platelmintos. A presença de GABA no sistema nervoso central de todos os (poucos) platelmintos estudados, sua grande concentração e a capacidade destes animais de sintetizarem tal aminoácido sugerem um papel funcional, talvez como um neurotransmissor inibitório (Halton & Gustafsson, 1996). No entanto, ainda não foram detectados receptores para o GABA, tampouco algum efeito que este aminoácido possa causar sobre a atividade motora de platelmintos, in vivo. Estudos de motilidade com agonistas GABAérgicos, antagonistas e bloqueadores do canal de cloreto, não revelaram nenhum efeito sobre a atividade motora de S. mansoni (Mellin et al., 1983).

Recentemente, várias evidências apontaram, pela primeira vez, a existência de uma via de sinalização GABAérgica que poderia exercer um papel fisiológico no sistema neuromuscular de S. mansoni adulto (Mendonça-Silva et al., 2004). Tais evidências foram:

Detecção de imunorreatividade anti-GABA em células e fibras nervosas dos gânglios cerebrais, troncos nervosos longitudinais e plexos se ramificando nos parênquimas

(Figuras 11A e 11B). Uma forte marcação foi também

encontrada associada às ventosas oral e ventral (Figura 11

C), assim como nos testículos (Figura 11 D), indicando um papel do GABA na fixação à parede vascular do hospedeiro e na espermatogênese.

Detecção imunológica e bioquímica de uma glutamato decarboxilase (GAD) funcional.

Observação de uma modificação da motilidade de vermes adultos in vitro na presença de picrotoxina, um antagonista não-competitivo do receptor GABA . Este efeito poderia A refletir um estímulo excitatório indireto devido ao bloqueio de um tônus GABAérgico inibitório.

Esta hipótese é compatível com a recente descrição da existência de transcritos para transportador de GABA e proteínas associadas a receptor GABA, em S. mansoni.

Neuropeptídeos

Potencialmente, há uma grande quantidade de peptídeos bioativos em platelmintos, sendo alguns semelhantes aos encontrados no sistema nervoso de mamíferos e outros próprios dos platelmintos. De fato, seis neuropeptídeos originários de platelmintos foram isolados e suas seqüências de aminoácidos determinadas, o que permitiu gerar antisoros altamente específicos usados para imunoistoquímica. Quatro destes peptídeos são relacionados a

FMRFamidas (FaRPs)3 e dois são neuropeptídeos F, originários de M. expansa e A. triangulata, respectivamente (Gustafsson et al., 2002).

Figura 11 – Imagens digitalizadas de Schistosoma mansoni adulto

macho, obtidas pela técnica de imunocitoquímica com anticorpos

anti-GABA e sistema de detecção biotina/avidina-peroxidase

(microscopia ótica). As barras correspondem a 50 μm

 

A: Corte transversal (20 µm) do corpo, mostrando uma

imunorreatividade anti-GABA (GABA-IR) nos troncos nervosos (seta

comprida) e na rede periférica (P). GABA-IR na rede periférica é

formada por corpos celulares neuronais (cabeça de seta) e fibras

nervosas. Notam-se numerosas terminações nervosas (pequenas

setas) em protusões do tegumento ao longo da superfície externa.

(G) corresponde ao trato alimentar.

B: Corte longitudinal (20 µm): aspecto típico dos troncos nervosos

longitudinais, com fibras apresentando reatividade positiva aos

anticorpos anti-GABA e percorrendo, em grupos ou sozinhas, o

corpo inteiro. Notam-se nervos laterais que se dirigem para a

superfície externa e vários grupos de fibras indo para o centro do

verme.

C: Corte longitudinal (20 µm) mostrando imunorreatividade anti-

GABA (GABA-IR) nas estruturas de fixação: imunomarcação forte e

difusa na ventosa oral (OS) e na ventosa ventral (VS).

D: Corte longitudinal (20 µm) mostrando GABA-IR no sistema

reprodutivo. Uma intensa imunomarcação, com aspecto amorfo, é

observada nos lobos testiculares (TL). G: trato alimentar.

Fonte: adaptado de Mendonça-Silva et al. (2004).

Evidências neuroanatômicas

As fibras peptidérgicas formam a maior parte dos gânglios cerebrais e contribuem na formação dos troncos nervosos principais e das

comissuras (ver Figura 3 e seção Sistema Nervoso de Schistosoma mansoni). Elas inervam ricamente a musculatura das ventosas e dos aparelhos digestivo e reprodutor (Gustafsson et al., 2002). A imunomarcação encontrada em S. mansoni foi contra substância P e Leu-encefalina, claramente associados a receptores sensoriais. A reatividade a FaRPs, por exemplo, é de intensidade média. Em contrapartida, a maioria dos platelmintos estudados exibem uma forte reatividade a FaRPs e GHRF (Gustafsson, 1987). Há uma sobreposição freqüente entre a imunomarcação peptidérgica e colinérgica, podendo ser indício de co-transmissão, enquanto a imunomarcação serotoninérgica é freqüentemente distinta, sendo localizada em feixes de neurônios diferentes (Gustafsson et al., 2002). Não há indícios de inervação das fibras musculares longitudinais por fibras contendo neuropeptídeos P ou FaRPs, ao contrário do que foi observado para serotonina, com elevados níveis de expressão numa extensa rede de plexos nervosos submusculares (Mair et al., 2000). Porém, há presença de fibras peptidérgicas nos plexos nervosos associados às fibras dorsoventrais do canal ginecofórico, assim como nos plexos inervando as ventosas oral e ventral (Mair et al., 2000). É de se notar que a ausência de fibras peptidérgicas inervando a musculatura somática pode ser considerada controversa, já que um desses mesmos autores – Maule – reportou a ocorrência de imunorreatividade contra estes peptídeos, uma revisão anterior (Day & Maule, 1999).

Evidências Fisiológicas e/ou Farmacológicas

A FMRFamida não afeta a atividade motora dos vermes inteiros, in vitro, provavelmente porque estas moléculas muito polares (e de peso molecular razoável) não têm como alcançar o interior do animal ou porque são rapidamente degradadas por peptidases do verme (Day et al., 1994). Entretanto, há evidências diretas implicando os FaRPs no controle da musculatura somática de S. mansoni: tais peptídeos são mioexcitatórios não somente em fatias de músculos contendo nervos (Day & Maule, 1999) como também

em fibras musculares isoladas (Day et al., 1994; Figura 7 C). A contração destas fibras musculares é dependente da entrada de cálcio extracelular, aparentemente por via diferente dos canais de cálcio dependentes de voltagem ativados por altas concentrações de K + (Day et al., 1994), sendo proposto o envolvimento de canais de cálcio regulados por receptores (ROCC), conforme

esquematizado na Figura 12 (seção Controle da Homeostasia do Cálcio). A ação potente, específica e imediata dos peptídeos FaRPs sobre a musculatura do verme sugere que eles estão atuando como neurotransmissores rápidos e não como moduladores, como é o caso em espécies mais evoluídas (Day & Maule, 1999).

Baseado na localização das fibras imunorreativas em relação ao neuropeptídeo F, este peptídeo teria papel na coordenação dos processos reprodutivos, da musculatura somática (devido a sua presença nos plexos periféricos associados a esta musculatura), das ventosas e da alimentação do Schistosoma.

Para terminar, encontram-se resumidas, no Quadro 3, as evidências ‘gênicas’ da existência de vias de neurotransmissão para as moléculas anteriormente citadas e a relação das proteínas que supostamente fazem parte destes sistemas, quer sejam receptores, proteínas de transporte ou enzimas envolvidas na síntese/degradação dos neurotransmissores.

Quadro 3 – Evidências gênicas da existência dos diferentes

neurotransmissores em esquistossomas

Neurotransmissor Função Refs.* Homólogo

 

Serotonina SmAE Transportador de Transportador serotonina 709958.1 (camundongo)

Receptor de

Receptor SmAE serotonina 702111.1 acoplado à

proteína G

Enzima Triptofano-(1) (síntese) hidroxilase

Transportador de

dopamina

(Drosphila

SmAE

Dopamina Transportador melanogaster)

611646.1

Transportador de

noradrenalina

(galinha)

Precursor cadeia

α receptor 2 colinérgico

SmAE

Acetilcolina Receptor (galinha)

606306.1 Cadeia β rec. 3

nicotínico

(humano)

Subunidade α3

SmAE receptor nicotínico

710243.1 neuronal (gato e

humano)

Precursor

SmAE polipeptídeo S 719264.1 receptor nicotínico

(humano)

AY392154(2) e Subunidade α 7

AY392155(2) α receptor 8

nicotínico

(vertebrados)

Colina-O-

Enzima SmAE acetiltransferase (síntese) 705718.1 (Echinococcus

multilocularis)

Precursor de

Enzima SmAE acetilcolinesterase (metabolismo) 713648.1 (Schizaphis

graminum)

Receptor NMDA

 

Glutamato SmAE tipo 1 Receptor Receptor NMDA 705975.1 tipo 1, subunidade

3 (humano)

Receptor NMDA

SmAE Receptor NMDA

716672.1 tipo 1, subunidade

3 (humano)

Precursor

 

SmAE receptor metabotrópico 610861.1 subtipo 3

(camundongo)

Transportador de

glutamato

(abelha)

Transportador Transportador de 711869.1 SmAE

aminoácidos

excitatórios, tipo 2

(humano)

Enzima SmAE Precursor da (síntese) 609636.1 glutamato sintase

(NADH2)

(Neurospora

crassa)

 

Enzima Glutamine SmAE sintetase (catabolismo) 600176.1 (camundongo)

Glutamato

desidrogenase

(GDH) 3

Enzima SmAE (Oncorhynchus (catabolismo) 604097.1 mykiss)

Glutamato

desidrogenase

(humano)

Variante da

GABA Receptor 709016.1 SmAE subunidade e do

receptor GABAA (rato)

Proteína

SmAE receptor GABA associada ao

GABARAP A 604360.1 (Gillichthys

mirabilis)

* Refs.: os números entre parênteses – (1) e (2) – correspondem,

respectivamente, às referências Hamdan & Ribeiros (1999) e

Bentley et al. (2004); os códigos, aos do GenBank; e os SmAE, às

seqüências organizadas de etiqueta de região codante (EST) de S.

mansoni (Verjovski-Almeida et al., 2003).

Homólogo: proteína que apresenta a maior homologia no banco de

gene (GenBank NR best hit).

 

Controle da homeostasia do cálcio

Assim como para os mamíferos (Putney, 1999; Rizzuto, Pozzan & Carafoli, 2002), a manutenção de baixas concentrações citossólicas de cálcio (na faixa de 100 nM) parece ser muito importante para a fisiologia celular, como um todo, e para a contratilidade muscular, em particular, de S. mansoni.

Por analogia com os mamíferos, é de se esperar que a contração do músculo liso presente em S. mansoni seja mais dependente do cálcio extracelular, entrando via canais de cálcio presentes na membrana plasmática (ver subseção Membrana Plasmática: canais de cálcio dependentes de voltagem – VOCC, adiante), do que do cálcio intracelular armazenado no retículo endoplasmático, ao contrário do que é observado em músculos estriados (Anderson, 1978). De fato, dados morfológicos mostraram que o retículo endoplasmático do músculo de S. mansoni é relativamente esparso, de tal forma que se pensou inicialmente que este não poderia conter estoques de cálcio suficientes para sustentar a contração (Silk & Spence, 1969). Experimentos com fibras musculares isoladas de vermes adultos demonstraram o contrário (ver item CA2+-ATPase), como previsto por um conjunto de estudos de farmacologia bioquímica (ver itens CA 2+-ATPase e Retículo Endoplasmático: RyR e IP R) que indicou a presença de bombas de cálcio e de canais de 3

cálcio no retículo endoplasmático.

O estudo da homeostasia do cálcio em S. mansoni revelou, de forma um pouco surpreendente tendo em vista a enorme distância filogenética entre platelmintos e vertebrados atuais (Halton & Gustafsson, 1996; Hanson, 1972), que aquele parasito controla sua concentração citossólica de cálcio de forma qualitativamente similar

à dos mamíferos (ver Figura 12). Em função desta conclusão, podemos imaginar que os sistemas atuais de controle da homeostasia do cálcio foram selecionados muito cedo durante o processo evolutivo e que a presença de diferentes isoformas de certas proteínas para exercer um mesmo trabalho pode ser considerada uma vantagem filogenética (Noël et al., 2001).

Já dado o contexto, inicia-se agora uma pequena revisão dos achados experimentais relacionados às proteínas que participam no controle da homeostasia do cálcio em S. mansoni, agrupadas em ATPases de transporte, canais de cálcio e proteínas (intracelulares) ligantes de cálcio. Uma representação sinóptica destas proteínas, com sua localização subcelular e interações funcionais, é

apresentada na Figura 12, em esquema do que poderia ser uma célula muscular hipotética de S. mansoni.

ATPases de Transporte

Na+ + , K-ATPase

A Na+ + , K-ATPase é uma enzima transmembranar, presente em praticamente todas as células do reino animal, que utiliza a energia proveniente da hidrólise de uma molécula de ATP para transportar, contra seus gradientes eletroquímicos, dois íons K + para o interior celular e três íons Na+ para o meio extracelular (Sweadner, 1989). Desta forma, esta 'bomba de sódio' mantém os gradientes iônicos necessários para diversas funções celulares, entre as quais a manutenção do potencial de membrana e a extrusão de cálcio citossólico através da troca Na + 2+-Ca, além de ser o receptor dos digitálicos (Sweadner, 1989), fármacos (ainda) utilizados no tratamento da insuficiência cardíaca.

Em + + S. mansoni , a presença da enzima Na , K-ATPase foi demonstrada pela primeira vez por Nechay et al. (Nechay, Hillman & Dotson, 1980), que identificaram uma pequena atividade ATPásica, estimulada por sódio e inibida por ouabaína, em homogeneizado de verme adulto. Utilizando seu novo modelo de estudo da atividade

contrátil do verme (Figura 6), (Fetterer et al.; Fetterer, Pax & Bennett, 1981) propuseramque há um papel relevante daquela enzima na contração muscular e na manutenção do potencial de membrana tegumentar, baseando-se na despolarização importante do tegumento e na contração intensa da musculatura somática provocadas pela ouabaína, inibidor seletivo da Na + + , K-ATPase. Mais recentemente, foi sugerido que esta enzima poderia também conferir resistência ao efeito danoso do complemento (Tarrab-Hazdai et al., 1997). Em 1986, inicia-se um estudo mais detalhado das propriedades bioquímicas da Na + + , K-ATPase neste verme. Apesar de ser muito semelhante à enzima de mamífero no que diz respeito aos seus ativadores fisiológicos (Noël & Soares, 1986), a enzima do parasito mostrou certas diferenças farmacológicas, sendo muito mais resistente ao vanadato, um clássico inibidor das ATPases do tipo P (Noël & Pardon, 1989) e à ouabaína, um inibidor específico das Na+ + , K-ATPases. Nesta ocasião, detectou- se uma diferença de sensibilidade entre as atividades presentes no tegumento e na carcaça do verme (Noël & Soares, 1986), o que indicava a possibilidade de haver pelo menos duas isoformas da Na+ + , K-ATPase em S. mansoni, como é a regra em mamíferos (Sweadner, 1989). Esta hipótese foi reforçada quando caracterizou-se a presença de duas populações de sítios de ligação para [3H]-ouabaína, em homogeneizado de verme adulto (Pardon & Noël, 1994). Uma isoforma da subunidade da Na + + , K-ATPase de S. mansoni (SNaK1) foi recentemente clonada e caracterizada (Skelly et al., 2001). Esta isoforma está presente na musculatura periférica assim como em vesículas neuronais de axônios associados à camada muscular periférica, mas não no tegumento do verme. SNaK1 apresenta aproximadamente 70% de identidade e 80% de similaridade com as isoformas humanas. Nota-se que um fragmento deste cDNA, codificando 104 aminoácidos (SMIV), já havia sido descrito anteriormente (De Mendonça et al., 1995).

Figura 12 – Esquema sinóptico das proteínas envolvidas no controle

da homeostasia do cálcio numa célula muscular de Schistosoma

mansoni adulto

 

ER: retículo endoplasmático. CaM: calmodulina. DOCC: canal de cálcio ativado por depleção dos estoques de cálcio intracelulares (modelo capacitativo, depletion-operated calcium channel). IP R: 3

receptor de inositol 1, 4, 5-trifosfato. Kca: canal de potássio ativado

por cálcio. PM: membrana plasmática. PMCA: Ca2+-ATPase da

membrana plasmática (Plasma Membrane Ca-ATPase). ROCC:

canal de cálcio ativado por receptor (receptor-operated calcium

channel) 2+ . RyR: receptor da rianodina. SERCA: Ca-ATPase de

Retículo Endo ou Sarcoplasmático” (Sarcoendoplasmic Reticulum

Ca-ATPase). VOCC: canal de cálcio dependente de voltagem

(voltage-operated calcium channel).

Nota-se que ainda não há evidência de troca Na+ 2+-Ca nem de DOCC. Como exemplo de ROCC, tem-se o canal ativado pelos

neuropeptídeos.

Este esquema constitui uma versão atualizada daquela publicada

anteriormente (Noël et al., 2001)

Ca2+-ATPase

Em mamíferos, as (Ca 2+ 2+ +Mg)-ATPases são responsáveis pela captação de cálcio pelo retículo endo/sarcoplasmático e constituem parte do sistema de efluxo de cálcio presente na membrana plasmática, sendo assim peças importantes na homeostasia do cálcio citossólico (Carafoli, 1987). (Ca2++ 2+ Mg)-ATPases estão também presentes no aparelho de Golgi e no envelope nuclear (Rizzuto, Pozzan & Carafoli, 2002).

Em franco contraste com os inúmeros estudos em mamíferos, as informações sobre Ca 2+-ATPase em S. mansoni era restrita, até pouco tempo, a poucos estudos demonstrando a presença de ATPases ativadas por altas concentrações de Ca 2+ 2+ e/ou Mg, parecidas com a ATPase ‘basal’ descrita no tegumento do verme (Cunha & Noël, 1988). Somente em 1988, pôde-se demonstrar a presença de uma verdadeira (Ca2+ 2+ +Mg)-ATPase, isto é, uma Mg 2+-ATPase estimulada por concentrações micromolares de cálcio, em S. mansoni (Cunha, De Souza & Noël, 1988). Esta atividade, presente sobretudo na fração microssomal, apresentava características clássicas de uma 'bomba de cálcio', o que foi definitivamente demonstrado mais tarde quando realizados experimentos de captação de 45 2+ Ca (Cunha, Meyer-Fernandes & Noël, 1988). Enquanto a ativação (fisiológica) desta enzima ocorria nas mesmas concentrações micromolares de cálcio observadas em mamíferos, observou-se uma diferença na modulação farmacológica pela tapsigargina, um inibidor específico das Ca 2+-ATPases de Retículo Endo ou Sarcoplasmático (SarcoendoplasmicReticulum Ca-ATPase ou SERCA) (Noël et al., 2001; Cunha, Reis & Noël, 1996). A presença de SERCA em S. mansoni foi mais tarde comprovada pela clonagem de um gene codificando uma proteína (SMA1) com 67% de homologia com as SERCAs humanas (De Mendonça et al., 1995). O papel fisiológico das SERCAs em S. mansoni foi confirmado quando um clone do cDNA de uma segunda SERCA (SMA2) foi expresso em leveduras deficientes em (Ca2+ 2+-Mg)-ATPase, restaurando sua capacidade de seqüestrar cálcio (Talla et al., 1998).

Assim como nos mamíferos, detectou-se em S. mansoni a presença de uma segunda atividade (Ca 2+ 2+-Mg)-ATPásica, resistente a tapsigargina, que é classicamente atribuída à presença de uma Ca2+-ATPase da membrana plasmática (Plasma Membrane Ca-ATPase ou PMCA) (Cunha, Reis & Noël, 1996). Alternativamente, esta Ca2+ 2+-ATPase poderia corresponder à SMA3, uma Ca-ATPase presente no tegumento de S. mansoni (Da'dara et al., 2001) e com grande homologia (40%-50% de identidade) com a família de Ca2+-ATPases da via secretória (Secretory Pathway Ca-ATPases ou SPCA), possivelmente localizada em um subcompartimento do aparelho de Golgi.

Canais de Cálcio

Membrana Plasmática: canais de cálcio dependentes de voltagem (VOCC)

Canais de cálcio dependentes de voltagem (Voltage Operated Calcium Channels – VOCC), presentes na membrana plasmática, intermediam o influxo de cálcio em resposta à despolarização, permitindo assim o acoplamento entre alterações de potencial de membrana e diversos eventos celulares, como a contração muscular. Existem vários tipos de canais de cálcio ativados por alta voltagem, classificados farmacologicamente em pelo menos cinco subclasses: tipos L, N, P. Q e R (Spedding & Paoletti, 1992). Em vertebrados, os canais de tipo L, predominantes na musculatura lisa, são bloqueados por diidropiridinas e verapamil, enquanto os outros canais são insensíveis a estas moléculas, mas bloqueados por diversas toxinas.

Há evidências de que os VOCCs exercem um papel no controle da musculatura somática em esquistossomas e em outros platelmintos. A despolarização produzida por altas concentrações de K + extracelular induz a contração muscular de vermes in vitro (Fetterer, Pax & Bennett, 1980) e este efeito é bloqueado por diidropiridinas. Neste modelo experimental, não há como saber se a despolarização induz diretamente um influxo de cálcio na célula muscular ou se a resposta é intermediada pela liberação pré-sináptica de algum neurotransmissor. Como a despolarização produz também a contração de fibras musculares isoladas (Day, Bennett & Pax 1994; Day et al., 2000), a explicação mais plausível é de que a despolarização produziu a abertura dos VOCCs presentes na membrana plasmática das fibras musculares e, conseqüentemente, a entrada de cálcio extracelular. O bloqueio deste efeito pela diidropiridina nicardipina favorece ainda mais tal interpretação (Day et al., 1994; Day et al., 1994). Dados mais recentes de biologia molecular confirmaram a presença de VOCCs em S. mansoni. De fato, três cDNAs de subunidade α1 de canais de cálcio ativados por alta voltagem foram clonados (Kohn et al., 2001a.), sendo um do tipo L, sensível às diidropiridinas. É interessante notar que o efeito contrativo que o praziquantel exerce sobre o verme adulto in vitro, cuja componente tônica é bloqueada na ausência de cálcio externo ou na presença de verapamil (Da Silva & Noël, 1995; Pax, Bennett & Fetterer, 1978), é atribuído à modulação da subunidade β deste canal de cálcio do tipo L, levando à abertura do mesmo (Kohn et al., 2001b, 2003). Desta forma, o canal de cálcio do tipo L seria o receptor farmacológico do praziquantel, pelo menos no que diz respeito ao seu efeito sobre a musculatura do verme, como sugerido pelos experimentos descritos a seguir.

Na concentração de 1 µM, alcançada no plasma após uma dose terapêutica (Andrews, 1981), o praziquantel produz um encurtamento rápido, intenso e mantido do verme in vitro (Pax,

Bennett & Fatterer, 1978; Figura 6 C), o que leva à paralisia

espástica do verme (Figura 8 B). A hipótese de relação causa-efeito entre contração da musculatura longitudinal do verme e perda de motilidade é reforçada pela cinética idêntica não somente do efeito como também da sua reversibilidade, depois da retirada do praziquantel (Da Silva & Noël, 1995). Na ausência de cálcio no meio de incubação, ou na presença de verapamil, um bloqueador de canais de cálcio do tipo L, o efeito contrativo do praziquantel é

somente transitório (Figura 13). Desta forma, concluiu-se que a contração induzida pelo praziquantel é de natureza bifásica, já que o componente fásico não depende da entrada de cálcio no verme, enquanto o componente tônico depende desta entrada de cálcio (Da Silva & Noël, 1995; Pax, Bennett & Fetterer, 1978). A contração fásica poderia resultar da liberação de cálcio de um estoque intracelular presente na fibra muscular (ver próxima subseção, Retículo Endoplasmático: RyR e IP3R) ou da entrada de cálcio na fibra muscular, a partir de um pool extracelular (‘intraverme’, de tamanho limitado) (Da Silva & Noël, 1995).

No entanto, a contração tônica, de forma clássica, seria sustentada pela entrada de cálcio extracelular, de forma contínua, já que este pool extracelular seria alimentado pelo cálcio presente no meio de incubação, através de canais de cálcio do tipo L existentes na membrana plasmática das fibras musculares. Os achados recentes do grupo de Greenberg apontam nesta direção, agora de forma muito mais direta e convincente. Estes autores clonaram a subunidade β de um canal de cálcio voltagem-dependente (VOCC) do tipo L, em S. mansoni, e identificaram diferenças estruturais em relação à subunidade p presente em mamíferos, aparentemente responsáveis por uma forte diminuição da amplitude da corrente, como indicado por experimento de coexpressão com subunidades α1 de mamífero (Kohn et al., 2001b). É a falta de duas serinas altamente conservadas no domínio de interação beta (BID) que seria responsável por esta diminuição de condutância do canal, assim como pela sensibilidade ao efeito do praziquantel, que é capaz de reverter parcialmente esta queda de condutância (Kohn et al., 2003). Nota-se que foi descoberta uma segunda subunidade β em S. mansoni, que, à imagem das subunidades de mamíferos, contém as duas serinas críticas no domínio BID, aumenta a corrente de cálcio quando coexpressa com a subunidade α1 de mamífero e não confere sensibilidade ao praziquantel (Kohn et al., 2003).

Figura 13 – Cinética do efeito contrativo do praziquantel sobre

Schistosoma mansoni, na ausência de cálcio externo. Após 15 minutos de incubação em solução fisiológica livre de cálcio, foi

adicionado 1 µM de praziquantel (▲) ou salina (□) a vermes machos

adultos. Para detalhes do modelo experimental, ver descrição no

Quadro 1 (método 2)

 

Fonte: Da Silva & Noël (1995).

Desta forma, teria sido finalmente elucidado o mecanismo molecular da ação do praziquantel, pelo menos no que diz respeito ao seu efeito sobre a musculatura do verme. Curiosamente, porém, o praziquantel não contrai a fibra muscular 'esfiapada', em cultura, apesar de esta apresentar contrações, induzidas pela despolarização, que são bloqueadas pela diidropiridina nicardipina (Day et al., 1994). Esta aparente contradição poderia agora ser explicada caso as fibras esfiapadas expressassem a segunda isoforma da subunidade β, parecida com a subunidade de mamífero e, portanto, insensível a este fármaco.

Retículo Endoplasmático: RyR e IP3R

Em mamíferos (e muitos invertebrados), a membrana celular não é a única fonte de cálcio ‘desencadeador de sinal’ (triggering calcium). De fato, a maioria das células desenvolveu uma via adicional para gerar sinais cálcicos, localizados e rápidos, mediante envolvimento de organelas intracelulares especializadas em estocar/liberar este segundo mensageiro intracelular (Putney, 1999; Fill & Copelo, 2002). As principais organelas são o retículo endoplasmático e o retículo sarcoplasmático (no músculo estriado), os quais possuem dois tipos de canais liberadores de cálcio que apresentam uma grande homologia estrutural (Fill & Copelo, 2002): os receptores da rianodina (RyR), assim chamados por serem sensíveis a este alcalóide, e os receptores do 1, 4, 5-inositol trifosfato (IP R). 3

RyR

Apesar de a musculatura de S. mansoni possuir um retículo

endoplasmático relativamente pouco denso (Silk & Spence,

1969, vide parágrafo II), como o músculo liso de animais

superiores, a participação de estoques intracelulares de cálcio

na contração muscular deste parasito foi inicialmente sugerida

pela caracterização de uma Ca2+-ATPase do tipo SERCA (ver

item CA2+-ATPase). Mais recentemente, pôde-se caracterizar a

presença de sítios específicos de ligação para a [3H]-rianodina

com sensibilidade semelhante àquela dos RyR de mamíferos

(Silva et al., 1998). Estes sítios apresentavam características

próprias de RyR, já que a ligação da [3H]-rianodina era

modulada pela cafeína e a rianodina induzia a contração de

vermes adultos, in vitro. Estes dados foram corroborados por

Day et al. (Day et al., 2000), que mostraram que a cafeína, um

agonista de RyR, era capaz de contrair fibras musculares

isoladas de vermes adultos. Assim, ficou demonstrado que

existem RyR funcionais em S. mansoni e que o retículo

endoplasmático estoca quantidades suficientes de Ca2+ para

exercer um papel fisiológico na contração muscular do verme

adulto. Outrossim, a recente análise do transcriptoma de S.

mansoni (Verjovski-Almeida et al., 2003) permitiu identificar

duas seqüências de etiquetas de regiões codantes (EST)

apresentando homologia com a isoforma 3, 'cerebral' (SmAE

704945.1), e a isoforma 2, 'cardíaca' (SmAE 600004.1), do

receptor da rianodina.

IP3R

Os receptores de inositol trifosfato (IP3R) se diferenciam dos

RyR por não serem sensíveis à rianodina e à cafeína e

necessitarem de 1, 4, 5-lP , além de cálcio, para serem 3

ativados (abertos). Em S. mansoni, há pouca evidência da

presença deste tipo de canais de cálcio, a não ser a detecção

de uma (fraca) ligação específica de [3H]- IP em frações 3

subcelulares de verme adulto (dados não publicados do

laboratório), a demonstração da presença de uma via de

sinalização envolvendo fosfoinositídeos no verme (Wiest et al.,

1992) e uma seqüência de etiqueta de região codante (SmAE

706881.1) compatível com a expressão de um IP R do tipo 1 ou 3

2 (Verjovski-Almeida et al., 2003).

Canais de Potássio Ativados por Cálcio: KCa

Estudos de patch-clamp realizados em fibras musculares isoladas de verme adulto demonstraram a presença de um canal de potássio de grande condutância, ativado pela presença de Ca2+ intracelular na faixa de 0, 1-1 µ-M (Blair et al., 1991). Esse tipo de canal, já descrito numa grande variedade de organismos filogeneticamente distantes, poderiam estar envolvidos intimamente na atividade muscular rítmica e espontânea de S. mansoni, que parece ser miogênica (Pax et al., 1996). De fato, em músculo liso de vertebrados, tais canais controlariam a atividade elétrica de ondas lentas: já que níveis elevados de cálcio intracelular ativam estes canais, eles poderiam ser responsáveis pelo fim da entrada de cálcio via VOCCs, ao repolarizar a célula e, assim, participar de seu relaxamento.

Outro aspecto muito interessante da descoberta reside na possibilidade de haver interação fisiológica entre estes canais K , Ca os canais de cálcio dependentes da voltagem (VOCC), ambos presentes na membrana plasmática, e os canais de cálcio ativados por rianodina (RyR), presentes no retículo endoplasmático. Este tipo de interação, facilitada pela próxima localização espacial da membrana plasmática e do retículo endoplasmático no músculo liso, levaria à constituição de uma unidade funcional responsável pelo controle do tônus muscular, como foi proposto para o caso de artérias e certos músculos lisos não vasculares de mamíferos (Jaggar et al., 1998). Extrapolando esta unidade funcional para o

caso de S. mansoni (Figura 12), poder-se-ia imaginar a seguinte seqüência de eventos: o cálcio extracelular, que entra via VOCC e, portanto, depende da despolarização da membrana plasmática, ativa os RyR, os quais são responsáveis pela liberação de quanta de cálcio de Ca 2+ 2+ (Ca sparks) por um mecanismo conhecido como liberação de cálcio induzida pelo próprio cálcio 2+ 2+ (Ca -induced, Ca

release). Devido à proximidade do retículo endoplasmático e da membrana plasmática em músculo liso, estes 2+ quanta de Ca

ativam os K + , levando a uma corrente transitória de saída de K, Ca

classicamente denominada de corrente de saída transitória espontânea (Spontaneous Transient Outward Current ou STOC). Esta repolarização da célula inibe a abertura dos VOCCs e a entrada de Ca2+ na célula. Assim sendo, existiria um ciclo de eventos auto-regulados que controlam a contratilidade da célula muscular.

Além destes canais de K+ + ativados por cálcio, duas correntes de K

ativadas por voltagem foram descritas em fibras musculares do verme adulto: uma semelhante às correntes retificadoras presentes em células musculares de praticamente todos os organismos eucarióticos e outra semelhante às correntes A, descritas em vários músculos (Pax et al., 1996). Infelizmente, não há como especular sobre a função destas correntes, no momento.

Proteínas Ligantes de Cálcio

Em mamíferos, há dois tipos de proteínas (intracelulares) ligantes de cálcio que participam do controle da homeostasia do cálcio: aquelas que atuam como estoques intracelulares de cálcio, como a parvalbumina, e aquelas que evoluíram para funcionar como proteínas reguladoras de processos específicos, como a troponina C.

Em S. mansoni adulto, diferentes proteínas ligantes de cálcio foram

reportadas (Figura 12), a começar pela calmodulina (CaM), uma proteína citossólica de configuração EF (EF-hand), que é a parceira onipresente do cálcio em diversas vias enzimáticas (Thompson et al., 1986; SmAE C600256.1) (ver Verjovski-Almeida et al., 2003). Uma segunda proteína com configuração EF, a Sm20, tem grande homologia com a calmodulina e poderia ser o equivalente funcional das proteínas ligantes de cálcio solúveis do retículo, presentes em moluscos e crustáceos, onde atuaria como estoque de cálcio para o músculo, no qual é majoritariamente expressa (Stewart, Smith & Havercroft, 1992). A calreticulina, uma proteína que não possui a configuração EF e se encontra normalmente no retículo endoplasmático, foi também descrita em S. mansoni (Sm58), mas parece estar principalmente expressa no epitélio do trato digestivo e nos órgãos genitais onde teria um papel na proliferação celular (Khalife et al., 1994). A análise do transcriptoma de S. mansoni (Verjovski-Almeida et al., 2003) identificou um EST (seqüência de etiqueta de região codante: SmAE 710732.1) correspondendo à isoforma 1 da calsequestrina, proteína ligante de cálcio presente em músculo esquelético de mamíferos (Putney, 1999). Pode-se ainda citar, no grupo das proteínas reguladores da contração dependentes de cálcio, uma proteína de 38, 3 kDa, aparentada à calponina, encontrada na musculatura lisa de S. japonicum adulto, que está associada aos miofilamentos e ao retículo endoplasmático (Yang et al., 1999).

 

Sistema neuromuscular como alvo para

fármacos esquistossomicidas: perspectivas

A descoberta e o desenvolvimento da maioria dos fármacos utilizados no tratamento das doenças tropicais foram incentivados pelas necessidades coloniais, durante a primeira parte do século XX. À medida que os interesses ocidentais se afastavam dessas regiões tropicais, as doenças próprias dos trópicos foram progressivamente negligenciadas, principalmente porque não ofereciam retorno financeiro suficiente para que a indústria farmacêutica investisse em pesquisa e desenvolvimento (Trouiller et al., 2002). Assim, somente 1% dos 1.393 novos fármacos aprovados entre 1975 e 1999 tratam especificamente de doenças tropicais e todos foram desenvolvidos com participação do setor público (Trouiller et al., 2002). Por esta razão, as doenças infecciosas tropicais continuam causando morbidade e mortalidade significativas, principalmente nos países em desenvolvimento, apesar dos progressos realizados no conhecimento básico das doenças infecciosas (Trouiller et al., 2002). A falha do sistema em vigor para desenvolver novos fármacos de interesse para os países em desenvolvimento foi recentemente enfatizada pela organização não governamental Médecins sans frontières, que concluiu haver necessidade de novas iniciativas, envolvendo órgãos públicos, instituições de pesquisa e unidades de produção dos países diretamente interessados, como é o caso do NDGi (Neglected Diseases Group Initiative), criado oficialmente em julho de 2003.

No caso da esquistossomose, a Organização Mundial da Saúde (OMS) incluiu esta parasitose na sua lista das dez doenças parasitárias prioritárias, havendo destaque quanto à necessidade de pesquisa de novos fármacos (Remme et al., 2002; Fenwick et al., 2003) (ver capítulo 29 deste livro – Terapêutica Clínica na Esquistossomose Mansoni -, inserido na Parte IV – Tratamento).

De forma geral, o ponto de partida de qualquer programa de desenvolvimento de fármacos visa identificar uma molécula ativa

inicial (hit).4 Tais moléculas 'iniciais' podem ser geradas de várias formas, que podem ser agrupadas em duas estratégias, de filosofias

distintas (Figura 14):

Métodos baseados no 'acaso inteligente' (o serendipity dos ingleses) e na força (bruta, dirão alguns) dos métodos de

química combinatorial e screening farmacológico de alto débito (high-throughput screening). Estes métodos não requerem nenhuma informação prévia sobre o receptor ou o ligante endógeno e, devido ao alto custo dos equipamentos robotizados envolvidos, é desenvolvido exclusivamente nas grandes indústrias farmacêuticas, ou em algumas empresas prestadores de serviços especializados;

Métodos racionais, baseados no conhecimento, que se baseiam em estruturas descritas na literatura científica e/ou de patentes, em ligantes endógenos ou em dados estruturais dos receptores. Estes métodos não são exclusivos das grandes indústrias farmacêuticas e podem ser empregados em ambientes universitários, já que são mais 'artesanais' e demandam, sobretudo, capacidade intelectual (Noël, Mendonça-Silva & Quintas, 2001). Neste caso, a estratégia de desenho molecular destas moléculas iniciais (hit) fundamenta-se no prévio conhecimento do processo fisiopatológico e na conseqüente eleição do alvo terapêutico mais adequado (Barreiro & Fraga, 2003).

Figura 14 – Desenvolvimento de novos fármacos

esquistossomicidas: necessidade e estratégias

 

Fonte: Bleicher et al. (2003). Reproduzida com permissão da Nature

Reviews Drug Discovery (www.nature.com/reviews), 2(5): 369-378,

copyright (2003), Macmillan Magazines Ltd.

Após obtenção das moléculas iniciais, deve-se prosseguir com a geração de uma molécula-protótipo (lead compound). Este processo envolve várias etapas e um constante diálogo entre química e farmacologia, para sua otimização. Em seguida, a molécula-protótipo otimizada deverá atravessar o caminho, longo e dispendioso, da toxicologia e do desenvolvimento clínico.

Havendo reconhecida necessidade de se desenvolver novos fármacos esquistossomicidas, serão tecidos alguns comentários sobre a oportunidade de se considerar o sistema neuromuscular de S. mansoni adulto, cujo funcionamento foi assunto deste capítulo, como alvo terapêutico. A idéia, regularmente expressa, de que o sistema neuromuscular do verme seria um alvo particularmente atrativo (Geary et al., 1992) para substâncias esquistossomicidas pressupõe um conhecimento profundo da fisiologia da neurotransmissão e contração neste parasito. A priori, o alvo ideal seria constituído por um receptor peculiar, próprio ao parasito, o que deixaria augurar uma seletividade de ação, com pouco efeito adverso para o hospedeiro. Tal situação é exemplificada pelo sucesso da ivermectina como nematicida eficaz e pouco tóxico por possuir relativa seletividade para bloquear um canal de cloreto ativado por glutamato, inexistente nos mamíferos (Arena et al., 1995).

Por analogia, pode-se entender por que o sistema peptidérgico (ver seção Neurotransmissores Envolvidos no Controle da Atividade Motora, subseção Neuropeptídeos) emergiu como uma fonte promissora para novos anti-helmínticos (Day & Maule, 1999). Se por um lado o alvo farmacodinâmico é atraente, por ser próprio do parasito, por outro há de se esperar empecilhos farmacocinéticos, como baixa biodisponibilidade e curto tempo de meia-vida, característicos dos peptídeos administrados por via oral (Goldberg & Gomez- Orellana, 2003). Poder-se-ia pensar em duas alternativas para contornar esta limitação intrínseca: uma, própria, da química medicinal, seria sintetizar análogos (agonistas ou antagonistas) não peptídicos; a outra, própria da biofarmácia, seria adotar uma formulação farmacêutica modificada, capaz de aumentar a biodisponibilidade de macromoléculas e/ou uma via alternativa de administração, como a nasal ou a transdérmica (Goldberg & Gomez-Orellana, 2003).

Foi visto que S. mansoni possui um sistema de neurotransmissão e controle da atividade motora qualitativamente similar ao dos mamíferos, o que não deixou de surpreender, tendo em vista a enorme distância filogenética entre esses animais. Felizmente, o estudo detalhado da modulação farmacológica dos receptores envolvidos, assim como das proteínas envolvidas no controle da homeostasia do cálcio, mostrou que existem diferenças entre parasito e hospedeiro, que poderiam ser levadas em conta para síntese de moléculas relativamente específicas. A recente caracterização de receptores glutamatérgicos e de uma via de transmissão GABAérgica em S. mansoni (ver seção Neurotransmissores Envolvidos no Controle da Atividade Motora, subseções Glutamato e GABA) os tornam possíveis alvos de agentes esquistossomicidas, ainda mais depois de se ter mostrado que a1gonistas e/ou antagonistas destes sistemas produziram alterações do padrão de atividade motora do verme. No caso dos receptores para aminoácidos, os quais estão presentes também no sistema nervoso central do hospedeiro, uma segunda esperança de alcançar a desejada seletividade pode embasar-se na localização intravascular (sistêmica) do parasito adulto. Para ilustrar este conceito, considere-se o ácido caínico (uma neurotoxina) como exemplo. Teoricamente, há possibilidade de se alcançar altas concentrações plasmáticas (que estarão, portanto, em contato direto com o parasito) de um derivado do ácido caínico, ao mesmo tempo em que se evita sua distribuição no sistema nervoso central do hospedeiro, onde poderia provocar morte neuronal. Este objetivo poderia ser alcançado ao se administrar um éster (ou diéster), que facilitaria a absorção, por mascarar as funções ácidas, mas seria rapidamente metabolizado, pelas esterases plasmáticas, em ácido caínico. Este último, sendo demais hidrofílico para atravessar a barreira hematoencefálica, não alcançaria os neurônios do hospedeiro, deixando assim de apresentar toxicidade.

Outro alvo molecular a ser (re)avaliado, em função da recente caracterização de uma transmissão GABAérgica (Mendonça-Silva et al., 2004), é o receptor benzodiazepínico, sítio alostérico modulador do receptor GABA . Ligantes deste receptor poderiam ter efeito A

esquistossomicida, pois foi demonstrado que um derivado benzodiazepínico (3-metil clonazepam) se ligava a sítios específicos no verme e possuía atividade contrativo parecida com a do praziquantel, além da atividade letal para S. mansoni (Pax, Bennett & Fetterer, 1978). Em função deste efeito esquistossomicida, poder-se-ia considerar que este alvo molecular está validado, o que constitui uma etapa importante do processo de farmacogenia (ver figura 14). O fato de se terem evidenciado sítios de ligação específicos para o [ 3H]-flunitrazepam com perfil farmacológico diferente do receptor benzodiazepínico central de mamífero (Mendonça-Silva et al., 2004) suscita a possibilidade de síntese de moléculas relativamente seletivas para o receptor de S. mansoni. Aqui, também, a preocupação com aspectos farmacocinéticos (biodisponibilidade e barreira hematoencefálica) parece essencial para se assegurar o sucesso terapêutico.

 

Resumo

Sistema nervoso de Schistosoma mansoni – o sistema nervoso de S. mansoni funcionaria não só como um sistema nervoso per se, havendo liberação de neurotransmissores em sinapses clássicas, mas também como um sistema parácrino, com a liberação de substâncias moduladoras no espaço extracelular próximo de células e órgãos-alvo.

Musculatura corpórea de S. mansoni – o verme adulto macho possui uma musculatura corporal bem desenvolvida, organizada em três camadas: debaixo do tegumento, encontram-se fibras circulares delgadas; logo abaixo, encontram-se fibras longitudinais, mais espessas e fusiformes, que constituem uma camada muscular compacta; debaixo desta camada, encontram-se umas poucas fibras diagonais. O músculo é do tipo liso com retículo endoplasmático pouco desenvolvido, mas funcional.

Atividade motora de S. mansoni – os vermes adultos machos apresentam uma variedade de movimentos, entre os quais rápidos encurtamento e prolongamento do corpo, movimentos ondulatórios e ondas peristálticas propagadas ao longo do corpo, no eixo anterior/posterior.

Neurotransmissores em S. mansoni – nos platelmintos, de forma geral, existiria um sistema de comunicação rápida envolvendo moléculas de pequeno peso molecular (aminas biogênicas, acetilcolina e aminoácidos) e um sistema mais lento, e evolutivamente mais primitivo, que usa peptídeos como mensageiros. O estatuto de candidato a neurotransmissor baseia-se em evidências neuroanatômicas e fisiológicas/farmacológicas. As evidências neuroanatômicas são obtidas por experimentos de citoquímica e imunolocalização que fazem uso de anticorpos e técnicas microscópicas, ao passo que as evidências farmacológicas são obtidas por intermédio de diversos modelos experimentais que permitem avaliar o efeito de substâncias exógenas sobre a motilidade ou contração/relaxamento da musculatura do verme ou até de fibras musculares dispersas em cultura.

Homeostasia do cálcio em S. mansoni – este parasito controla sua concentração citossólica de cálcio de forma qualitativamente similar à dos mamíferos, o que não deixa de surpreender, tendo em vista a enorme distância filogenética entre platelmintos e vertebrados atuais. Em função desta conclusão, parece que os sistemas atuais de controle da homeostasia do cálcio foram selecionados muito cedo durante o processo evolutivo e que a presença de diferentes isoformas para exercer um mesmo trabalho pode ser considerada uma vantagem filogenética.

Sistema neuromuscular como alvo para fármacos esquistossomicidas – como o sistema neuromuscular do verme é um alvo atrativo para substâncias esquistossomicidas, há necessidade de se conhecer mais profundamente a fisiologia da neurotransmissão e contração neste parasito. De fato, a estratégia de desenho molecular de moléculas ativas iniciais (hit) fundamenta-se no prévio conhecimento do processo fisiopatológico e na conseqüente eleição do alvo terapêutico mais adequado. A

priori, o alvo ideal seria constituído por um receptor peculiar, próprio ao parasito, o que favoreceria uma seletividade de ação com pouco efeito adverso para o hospedeiro, como sugerido para os receptores de neuropeptídeos. No entanto, o estudo detalhado da modulação farmacológica dos receptores envolvidos no controle da atividade motora mostrou que existem diferenças entre os receptores do parasito e do hospedeiro que poderiam ser levadas em conta para síntese de moléculas relativamente específicas.

 

Perspectivas

Com o reconhecimento da necessidade em desenvolver novos fármacos esquistossomicidas, espera-se que haja incentivos públicos para aprofundar o conhecimento da fisiologia da neurotransmissão e contração neste parasito. De fato, a estratégia de desenho molecular de novas moléculas ativas fundamenta-se no conhecimento do processo fisiopatológico e na conseqüente eleição do alvo terapêutico mais adequado. Outrossim, tais estudos sobre a neurobiologia de platelmintos atuais podem fornecer informações valiosas quanto à origem evolucionária do sistema nervoso e sua relação com o sistema muscular.

 

Referências

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1 Motilidade: atividade motora ‘global’ do verme (tanto deslocamento do corpo, ou porção dele, quanto onda peristáltica).

2 Há dados controversos quanto ao efeito de nicotina exógena: enquanto Barker, Bueding & Timms (1966) e Mellin et al. (1983) não registraram nenhum efeito sobre a motilidade do verme, Pax & Bennett (1991) registraram diminuição da tensão basal do verme

(relaxamento do músculo longitudinal). A Figura 9 demonstra que a nicotina induz a paralisia flácida. Tal discrepância de resultados pode estar relacionada à adição ou não de serotonina no meio de incubação.

3 FMRFamida = fenil-metil-arginina-fenil-NH2. Os quatro peptídeos estruturalmente relacionados a FMRFamida e de origem platelmíntica são: YIRFamida (Bdelloura candida); GYIRFamida (Dugesia tigrina); RYIRFamida (Artioposthia triangulata); GNFFRFamida (Monezia expansa).

4 Hit: molécula ativa, com certa seletividade em ensaios de binding, que apresenta uma atividade acima de um limite préestabelecido em um determinado ensaio.