3 – Migração e Desenvolvimento de Schistosoma mansoni no Hospedeiro Definitivo Henrique Leonel Lenzi, Arnon Dias Jurberg, Paulo Marcos Zech Coelho e Jane Arnt Lenzi

3 - Migração e Desenvolvimento de

Schistosoma mansoni no Hospedeiro

Definitivo

 

Henrique Leonel Lenzi; Arnon Dias Jurberg; Paulo Marcos Zech Coelho; Jane Arnt Lenzi

 

Casal de vermes adultos de Schistosoma mansoni (extremidade

anterior) em veia mesentérica de camundongo Swiss Webster

(folheto mesentério corado por Giemsa de Lennert).

Durante uma infecção parasitária, eventos complexos são

decisivos para a patogênese, o sucesso reprodutivo e a

continuação do ciclo biológico do agente etiológico. Na

esquistossomose mansoni, causada pelo trematódeo

Schistosoma mansoni, os ovos que atingem a massa de água,

em condições adequadas, eclodem, liberando uma forma larvar,

chamada miracídio, infectante para caramujos, normalmente do

gênero Biomphalaria. Nesses hospedeiros intermediários, uma

série de divisões celulares e modificações morfológicas leva à

formação das cercárias. Tal forma larvar é o agente penetrante

na pele ou na mucosa de mamíferos suscetíveis, os

hospedeiros definitivos (humanos, alguns primatas e diversos

roedores). No contato com a pele e no subseqüente

reconhecimento dos sítios de penetração, inicia-se uma longa

jornada: primeiro, de modo extravascular, o parasito adere e

rasteja através das camadas superficiais, orientando-se por

meio de pistas físicas e bioquímicas pelo estrato córneo e,

subseqüentemente, sobrepujando os estratos granuloso,

espinhoso e basal, até atingir a derme, onde localiza e invade

preferencialmente vasos venosos; na migração intravascular, os

parasitos são carregados passivamente para o coração, de

onde são bombeados para os pulmões e têm que lidar com a

estreiteza dos capilares pulmonares para retornarem ao

coração e serem novamente bombeados, agora para a

circulação sistêmica. Os esquistossômulos perfazem dois ou

três ciclos sistêmicos até ficarem retidos nos sinusóides

hepáticos, onde se desenvolvem, devido aos estímulos do soro

sangüíneo portal, e amadurecem sexualmente, a partir de

complexas e pouco compreendidas interações moleculares

entre os sexos. Outras rotas de migração propostas também

são apresentadas. No sistema porta-hepático intestinal, as

fêmeas maduras passam a liberar ovos, ainda imaturos, que

necessitam desenvolver-se nos tecidos do hospedeiro

vertebrado, para então serem eliminados através das fezes,

dando continuidade ao ciclo biológico. Os intrincados

mecanismos responsáveis pelo estabelecimento e manutenção

dessa espécie de parasito em seus hospedeiros são relatados e

discutidos, bem como, por fim, algumas lacunas no

conhecimento de sua biologia são destacadas.

 

Visão panorâmica da penetração cercariana, com

detalhes da histologia da pele Para a maior parte dos parasitos, a entrada num hospedeiro adequado é somente o primeiro passo de uma longa jornada (Tragger, 1986). Isso vale também para S. mansoni, que usa a cercária como agente penetrante em mucosa ou pele. Após a penetração, num longo percurso inicialmente extravascular e, depois, intravascular, o parasito perfaz vários ciclos na circulação sistêmica mudanças marcantes ocorrem na sua morfologia. Este passa de cercária para esquistossômulo de pele, esquistossômulo pulmonar, verme imaturo e verme adulto macho ou fêmea. As fêmeas maduras passam a depositar ovos, que ao saírem do hospedeiro vertebrado, através das fezes, liberam miracídios, que infectam o hospedeiro invertebrado, mantendo o ciclo biológico. O enorme crescimento corporal entre esquistossômulo de pele e

verme adulto pode ser visto na Figura 1. O desenvolvimento e a maturação de S. mansoni no hospedeiro vertebrado apresentam duas fases bem nítidas: pré-hepática e hepática/pós-hepática.

Figura 1 – Estágios evolutivos de Schistosoma mansoni no

hospedeiro definitivo. (A) Comparação de tamanho entre o verme

adulto macho e um esquistossômulo dérmico (cabeça de seta;

número 1 em B). Estereomicroscopia. (B) Representação

esquemática das etapas do desenvolvimento dos esquistossomos,

classificadas segundo a forma do ceco gástrico – Schistograma.

Esquistossômulos de estágio 1 apresentam coloração clara e uma

pequena mancha escura, o início do ceco. No estágio 2, os

esquistossômulos possuem uma mancha mais escura, agora

bifurcada, sem entretanto perpassar o acetábulo. Em

esquistossômulos de estágio 3, a mancha escura bifurcada

perpassa o acetábulo e se liga posteriormente. No estágio 4, a

mancha escura bifurcada reconectada cresce para a extremidade do

parasito, mas sem estender-se mais que sua parte bifurcada. Já no

estágio 5, o ceco conectado estende-se mais que sua secção

bifurcada, mas ainda é três vezes menor do que o seu tamanho

final. Por fim, no estágio 6, sempre em vermes adultos maduros, o

ceco está completamente desenvolvido, sendo três vezes maior do

que no estágio 5 (Barbosa et al., 1978)

Na penetração cutânea, as cercárias usam mecanismos bioquímicos de interação agonista-receptor, além da liberação de enzimas proteolíticas, de ação variada. Para atingir vasos sanguíneos, em geral venosos, e/ou linfáticos, os parasitos transitam por uma série de estruturas complexas, que compõem a epiderme e a derme extravascular. A epiderme consiste de uma camada de epitélio escamoso estratificado, formada principalmente por queratinócitos e, em menor número, melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel (Kierszenbaum, 2002). A célula de Merkel forma desmossomos com queratinócitos e está ligada a uma pequena placa nervosa (fibra nervosa terminal) (Storm & Elder, 2006). Os queratinócitos são arranjados em cinco camadas ou estratos:

basal ou germinativo;

espinhoso;

granuloso;

lúcido;

córneo.

Os estratos basal e espinhoso formam o estrato de Malpighi (Kierszenbaum, 2002). Uma célula que se desprende do estrato germinativo leva 14 dias para atingir, em humanos, o estrato córneo, e mais 14 dias para nele transitar, até ser descamada (Haake & Holbrook, 1999). Os queratinócitos produzem uma variedade de citocinas, notavelmente interleucina 1a (IL-1a) e IL-1b, bem como eicosanóides (Storm & Elder, 2006). Na camada germinativa, os queratinócitos expressam predominantemente queratinas cinco e 14, que permanecem em todo o estrato espinhoso, adicionando-se, nesse estrato, as queratinas 1 e 10. No estrato granuloso, predominam as queratinas 2e e 9 (Haake & Holbrook, 1999; Kierszenbaum, 2002). Os queratinócitos também são diferenciados por dois outros produtos estruturais: grânulos querato-hialinos e corpúsculos lamelares de Odland ou queratinossomos (Storm & Elder, 2006). Os grânulos querato-hialinos compõem-se de proteína basofílica elétron-densa, rica em histidina, a profilagrina, que está associada a filamentos intermediários de queratina, que contém também loricrina. Durante a transição de célula granular para célula cornificada, ocorre a conversão de profilagrina para monômeros de filagrina (Haake & Holbrook, 1999). Tanto o estrato lúcido como o córneo consistem de várias camadas de queratinócitos contendo agregados de queratina ligados à filagrina, catalizados por transglutaminases (Kierszenbaum, 2002). Nos estratos lúcido e córneo, os primeiros a entrarem em contato com as cercárias, proteínas depositadas na parte interna da membrana plasmática, formam o envelope celular cornificado. Esse envelope apresenta três camadas: interna ou citoplasmática, composta, em mais de 90%, por loricrina, que se encontra entrecruzada, intra e intercadeias, com pequenas proteínas ricas em prolina um e dois (small proline-rich proteins = SPRRs). O terço médio do envelope consiste em aproximadamente 85% de loricrina e SPRRs, bem como de elafina, inibidor de protease. O terço externo, que está conectado a um envelope lipídico, contendo W-hidroxiacil-esfingosina, é constituído principalmente por involucrina e cistatina a (queratolinina), podendo conter também, embebidos, filamentos intermediários de queratina (Kierszenbaum, 2002; Latkowski & Freedberg, 1999). Filamentos de queratina, agregados com filagrina, interagem com a face interna da membrana plasmática para formar o envelope celular (Kierszenbaum, 2002). As células epiteliais envoltas por envelope cornificado são chamadas de corneócitos (Downing, Stewart & Strauss, 1999). É importante destacar que os lipídeos que envolvem o envelope celular, formando o envelope celular composto, derivam da dispersão de discos lamelares provenientes dos corpos lamelares ou queratinossomos (Downing, Stewart & Strauss, 1999; Kierszenbaum, 2002). Os lipídeos têm uma importante participação na atração de cercárias e, no estrato córneo, são constituídos principalmente por ceramidas, colesterol e ácidos graxos livres. As ceramidas e os ácidos graxos livres derivam de fosfolipídeos acumulados nos grânulos lamelares, que após extrusão sofrem várias clivagens enzimáticas hidrolíticas. Esses grânulos (queratinossomos) contêm fosfolipídeos, esfingomielina, colesterol, glicosilceramidas e outros glicerolipídeos (Downing, Stewart & Strauss, 1999; Elias & Feingold, 1999; Latkowski & Freedberg, 1999).

Durante o processo de penetração cutânea, as cercárias passam inicialmente pelo estrato córneo, onde cada célula está envolta pelo envelope celular composto, antes referido, que é altamente resistente a agressões físicas e químicas (Elias & Feingold, 1999). Além dessa enorme barreira, as cercárias também têm que superar a barreira epitelial formada pelo conjunto de adesões celulares, tais como as junções ancorantes [caderinas e integrinas (α β , α β 6 4 21 α β )] e as junções comunicantes (gap junctions, com conexinas) 3 1

(Alberts et al., 2002; Haake & Holbrook, 1999). Cada desmossomo é formado, intracelularmente, por duas placas citoplasmáticas, compostas por seis polipeptídeos: placoglobina, desmoplaquinas I e II, queratocalmina (desmocalmina), desmoioquina e proteína de banda seis, que intermediam a conexão entre filamentos de queratina e proteínas de adesão transmembranosas. Essas proteínas de adesão (desmogleínas I e III e desmocolinas I e II) pertencem à família das caderinas (Alberts et al., 2002; Haake & Holbrook, 1999).

Vencida a barreira celular, as cercárias passam por uma forte barreira, constituída pela interface ou junção dermo-epidérmica ou zona da membrana basal (ZMB). Ultra-estruturalmente, essa zona inclui:

a parte mais profunda dos queratinócitos basais, incluindo a membrana plasmática e os tonofilamentos que se ligam à face profunda dos hemidesmossomos;

os hemidesmossomos;

os filamentos de ancoragem (laminina cinco), que se estendem das placas densas subdesmossômicas através da lâmina lúcida e inserem-se na lâmina densa;

a lâmina lúcida composta por lamininas,

entactina/nidogênio e fibronectina;

a lâmina densa, rica em colágeno IV (± colágeno V) e proteoglicanos sulfatados (perlecan);

fibrilas de ancoragem, que são arranjos de colágeno do tipo VII, estendendo-se desde a face interna da lâmina densa, por uma distância curta, para dentro da derme papilar;

as microfibrilas de fibras elásticas oxitalânicas, que se misturam ao sistema elástico subjacente de fibras elaunínicas e elásticas. Na região onde se localizam as fibrilas ancorantes e as fibras oxitalânicas, logo abaixo da lâmina densa, chamada de lâmina reticular, há também a presença de colágenos intersticiais (tipos I, III, V e VI) (Haake & Holbrook, 1999; Storm & Elder, 2006).

Assim que as cercárias superam a zona da membrana basal, caem na derme, encontrando ali um conjunto variado de proteínas da matriz extracelular, a depender da região dérmica em que se encontram. A derme papilar é constituída por fibrilas delicadas de colágenos intersticiais, fibras do sistema elástico, proteoglicanos (decorina) e tenascina. A derme reticular encontra-se abaixo da derme papilar e contém a maioria do colágeno dérmico, que está organizado em feixes grosseiros e associado com fibras elásticas (Haake & Holbrook, 1999; Storm & Elder, 2006). Colágeno é o principal componente da derme, totalizando 75% de seu peso seco [colágenos I, III, V, VI, VII (fibrilas ancorantes) e IV (parede de vasos, placas ancorantes, apêndices epidérmicos)]. O sistema elástico é responsável por 4% e proteoglicanos [condroitinsulfatos/dermatansulfatos (biglicano, decorina, versicano), heparano/heparansulfatos (perlecan, sindecan), condroitin-6 sulfato] e glicosaminoglicanos (ácido hiarurônico), por 0,2% do peso seco da derme. As seguintes glicoproteínas não colagênicas também participam na composição da matriz extracelular da derme: fibronectina, laminina (restrita às membranas basais), trombospondina, vitronectina (= epibolina, fator de espalhamento sérico, proteína S do complemento) e tenascina (Haake & Holbrook, 1999). Na derme há também células residentes, como fibroblastos (populações heterogêneas), macrófagos e mastócitos. Pequenas coleções de linfócitos podem ser encontradas ao redor de vasos sanguíneos em pele normal. Pericitos e células veladas envolvem a parede de vasos sanguíneos e células de Schwann cercam fibras nervosas. O sistema mononuclear-fagocítico da pele pode ser dividido em duas linhagens: a linhagem monocítica-macrofágica e a linhagem de células dendríticas. Essa inclui células de Langerhans, células indeterminadas, células interdigitantes e dendrócitos dérmicos (Haake & Holbrook, 1999).

Na pele, a última barreira a ser vencida pelos esquistossômulos antes de caírem na circulação sanguínea ou linfática é a parede dos vasos. Os capilares venosos e as vênulas pós-capilares de maior diâmetro apresentam múltiplas camadas de lâmina basal separadas por fibrilas colagênicas interpostas e uma bainha frouxamente organizada de pericitos e de células veladas (tipo especial de célula da linhagem dendrítica). Os vasos linfáticos têm parede delgada, constituída apenas por endotélio, lâmina basal descontínua e fibras elásticas (Haake & Holbrook, 1999).

No decorrer deste capítulo serão apresentados, em detalhe, os principais mecanismos envolvidos na penetração cercariana na pele e no desenvolvimento e maturação de S. mansoni em hospedeiro vertebrado, além de sítios de atrito, encontrados no hospedeiro, com a penetração e a migração do parasito.

 

Localização do hospedeiro definitivo pelas

cercárias

A penetração das cercárias de S. mansoni na pele de hospedeiros mamíferos suscetíveis é antecedida por uma fase de movimentos natatórios de propulsão retrógrada (tail-first), que ocorrem intermitentemente. As cercárias de S. mansoni tendem a iniciar a natação quando expostas a um aumento ou a um decréscimo da intensidade luminosa (Saladin, 1982). Quando ativa, a cercária usualmente se desloca para a superfície da água, alternando com momentos de passividade, nos quais afunda. Todavia, o afundamento é retardado por influência da água, que arrasta a cercária quando esta adota posturas características, tal como a extensão da fúrcula, de pregas estabilizadoras ou de estruturas semelhantes aos pêlos (Haas, 1994). Além disso, o comportamento cercariano e seu sistema nervoso estão intimamente relacionados, já que a presença de diversas papilas sensoriais e de neurônios na extremidade anterior do segmento corporal, na região ventral, na ventosa oral e na cauda estão expostas aos estímulos externos durante a natação (Cousin et al., 1995; Cousin & Dorsey, 1991; Dorsey et al., 2002).

A aproximação em direção ao hospedeiro é favorecida por respostas específicas às perturbações na água, ao toque (Haas, 1992), à formação de um gradiente termal tão fraco como 0,15°

C/mm (Haas, Granzer & Brockelman, 1990) e, mais fracamente, aos estímulos químicos emitidos pela pele (Wilson, 1987) e a estímulos fóticos (Saladin, 1982). O sombreamento e a turbulência provocados por mamíferos que tenham entrado na água (Wilson, 1987), bem como estímulos químicos, não parecem ser fatores relevantes para cercárias de S. mansoni. As cercárias aumentam seu reduzido nível de atividade, o que faz economizar energia, saindo do fundo da coluna de água para a superfície, o que provavelmente melhora as suas chances de encontro com o hospedeiro, já que os parasitos passam a explorar um maior volume de água (Haas, 1994).

 

Reconhecimento, invasão e migração

(penetração) através da pele

Aspectos Moleculares

As cercárias de S. mansoni apresentam um padrão bastante diferenciado de reconhecimento e invasão do hospedeiro, realizando as seguintes e distintas fases:

natação próximo à superfície da água, lá permanecendo em resposta a luz, gravidade e temperatura, como visto anteriormente;

adesão, quando a cercária é tocada pelo hospedeiro. Calor e L-arginina são os sinais estimulantes por parte do hospedeiro (Granzer & Haas, 1986; Haas, 1976; Haas et al., 1994);

contato duradouro com o hospedeiro, em resposta ao calor e a lipídeos da superfície da pele, principalmente ceramidas (Haas, 1976; Haas et al., 2002);

rastejamento até sítios adequados de entrada, pelos quais as cercárias respondem a gradientes de temperatura e de concentração de arginina (Haas, 1976; Haas et al., 1994);

penetração e transformação do tegumento, estimulados por ácidos graxos livres (Austin, Stirewalt & Danziger, 1972; Haas & Schmitt, 1982a, 1982b; Shiff et al., 1972);

secreção de enzimas proteolíticas derivadas de conteúdo de glândulas acetabulares, em resposta a ácidos graxos definidos (provavelmente na superfície da pele) e a glicosilceramidas e fosfolípídeos (provavelemente em camadas mais profundas da epiderme) (Haas et al., 1997). As fases da penetração cercariana na pele estão

esquematizadas na Figura 2, adiante.

A adesão ao hospedeiro ocorre através da região da ventosa oral, após a realização de um padrão característico de movimentos, no qual a cercária inverte seu modo de natação com a cauda para frente e assume uma postura com o corpo na posição anterior, passando a executar freqüentes reversões na direção da natação (Wilson, 1987). Ao tocar na pele de mamíferos suscetíveis, as cercárias fixam-se fortemente, sendo estimuladas pelo calor e por sinais de L-arginina, e permanecem em contato duradouro com o hospedeiro, em resposta a lipídios de superfície, principalmente ceramidas, e igualmente ao calor gerado pelo substrato. As cercárias então exploram (por arrastamento ou rastejamento) a pele, seguindo gradientes de temperatura e de concentração de arginina (que não é específica para a superfície da pele humana), buscando sítios adequados para realizar a penetração nas camadas mais profundas da pele. A resposta à estrutura particular da molécula L-arginina é muito específica, mostrando grande sensibilidade a concentrações tão pequenas quanto 0,1 µ-M. Assim, a modificação de qualquer parte da estrutura dessa molécula, seja do grupamento guanidino, da cadeia de hidrocarbonetos, do grupamento α-amino ou do grupamento carboxila, bem como de qualquer grupamento funcional isolado, não possui qualquer atividade estimulante na resposta das cercárias (Haas et al., 1997).

Figura 2 – Principais fases de penetração cercariana na pele,

passando pelos estratos córneo (a), granuloso (b), espinhoso (c) e

basal ou germinativo (d), ultrapassando a zona da basal, penetrando

na derme e invadindo preferencialmente vasos venosos e, secundariamente, vasos linfáticos. As cercárias, durante a

penetração, costumam perder suas caudas (f), embora possam

mantê-las durante um período inicial (e). Célula de Langerhans (seta

longa). Célula de Merkel (seta curta)

 

No entanto, somente outros dois aminoácidos básicos, L-histidina e L-ornitina, assim como a L-homoarginina, também possuem algum efeito estimulante em baixas concentrações, enquanto as cercárias não respondem a nenhum aminoácido, ácido ou neutro, de extratos da superfície da pele humana. Uma característica comum entre os aminoácidos básicos citados é a presença de um grupamento radical positivamente carregado, que poderia ser um dos pré-requisitos dessas moléculas para se ajustarem em um sítio hipotético do receptor de L-arginina das cercárias. Somente alguns compostos, como a L-lisina e alguns análogos da L-arginina, mostram atividade estimulante significativa em concentrações maiores (Haas et al., 1997).

Diversas hipóteses (Haas et al., 1997) já foram levantadas para explicar o papel da L-arginina na adesão, penetração e migração das cercárias na pele de hospedeiros mamíferos. A mais clássica (Granzer & Haas, 1986; Haas, 1994; Stirewalt, 1971) faz referência a um possível papel desse aminoácido como feromônio intraespecífico, segundo o qual os conteúdos das glândulas pós-acetabulares, que possuem arginina (Granzer & Haas, 1986), serviriam como um sinal de atração para as outras cercárias aderirem ao hospedeiro apropriado. Esse mecanismo, portanto, possibilitaria uma importante vantagem seletiva, já que facilitaria a penetração de grupos de cercárias, que preparariam o caminho para outras que as seguissem (Griffiths, 1953), como observado em condições experimentais (Stirewalt, 1971). Assim, a penetração até a derme, se desencadeada por muitas cercárias, é mais rápida do que aquela efetivada por poucas, graças à utilização de túneis, deixados na pele pelas cercárias anteriores (Griffiths, 1953), economizando energia e conteúdo glandular, além de contornar mais facilmente o sistema imunológico do hospedeiro (Stirewalt, 1971).

Todavia, mesmo que as cercárias tenham uma alta sensibilidade e especificidade à arginina proveniente das glândulas pós-acetabulares, orientando, assim, sua fase de exploração da pele por um gradiente crescente de concentração desse aminoácido, parece improvável que a arginina cercariana atue como feromônio intraespecífico, já que o conteúdo de arginina da pele humana, por si só, evoca respostas máximas das cercárias (Haas et al., 1997; Ingram et al., 2003). Logo, a secreção adicional de arginina pelas cercárias em penetração possivelmente não exerce nenhum efeito quimioatrativo nas cercárias adjacentes, e isto decorre também do fato de as glândulas acetabulares conterem somente uma pequena quantidade de arginina livre ou ligada (Haas et al., 2002). Isso parece ser bastante plausível, pois sob condições naturais, onde as cercárias estão amplamente dispersas, a chance de algumas se encontrarem e explorarem, simultaneamente, a grande extensão relativa da superfície da pele humana, é teoricamente mínima. Estudos de campo realizados em Santa Lúcia (Upatham & Sturrock, 1973), por exemplo, relatam densidades de cercárias por litro de água, em alguns locais, que variam de 0,01 a 150 indivíduos, enquanto em experimentos controlados em laboratório, no qual a penetração de grupos de cercárias também não foi observada, a densidade por litro de água chegou a atingir 20 mil cercárias (Ingram et al., 2003). Como alternativa, é possível que, ao invés da atração via feromônio cercariano, componentes liberados pela pele perto das cercárias possam estimular a sua penetração, em grupo (Haas et al., 2002).

Outras explicações (Haas et al., 2002) para a especificidade de L-arginina como estímulo para adesão, penetração e migração cercarianas foram baseadas no seguinte:

os níveis de arginina do soro do hospedeiro diminuem muito após a infecção com S. mansoni, já que a doença aumenta os níveis de arginase no soro e no fígado (Page & Newport, 1977) e converte arginina em prolina, que é então utilizada na síntese de colágeno pelo fígado (Dunn et al., 1978; Senft, 1966; Senft, 1966; Senft 1967; Tanabe; Kaneko & Tageuchi, 1989). Além disso, a arginina é ativamente incorporada pelos vermes adultos e ovos. Dessa forma, se uma infecção também diminuísse a concentração de arginina na pele, as cercárias poderiam evitar os hospedeiros já cronicamente infectados e preservar a sua infectividade para os indivíduos mais

promissores (Haas et al., 2002). Porém, o conteúdo de arginina na pele não varia significativamente e as cercárias não possuem mecanismos para diferenciar entre hospedeiros infectados, com hepatoesplenomegalia avançada, alta densidade de granulomas no fígado, baço e intestino, e hospedeiros saudáveis (Haas et al., 2002);

a utilização da L-arginina como precursor de óxido nítrico (NO), que tem um efeito vasodilatador, normalmente sintetizado pelo endotélio (Cohen, 2000; Cosentino & Lüscher, 1996; Pohl & Wit, 1999), favoreceria a entrada dos esquistossômulos nos capilares sanguíneos (Coulson, 1997), e a sua migração posterior. No entanto, esse mecanismo não parece ser possível, já que os esquistossômulos, à primeira vista, não são capazes de converter L-arginina em citrulina. Não obstante, não pode ser excluída a possibilidade, numa fase posterior da migração na pele, de os esquistossômulos produzirem NO na presença de um sinal vasoespecífico;

a remoção de L-arginina dos tecidos circundantes, pelos esquistossômulos, através da ligação em receptores específicos ou pela sua conversão em derivados metabólicos (Haas et al., 2002), poderia ser um mecanismo de escape dos esquistossômulos ao ataque de macrófagos e de células endoteliais sanguíneas do hospedeiro, com a produção de NO-reativo (Ahmed et al., 1997; James & Boros, 1994). A produção de NO necessita de L-arginina como fonte, e é catalisada por NO sintase sob indução de citocina (Oswald et al., 1994b). A ausência de L-arginina, portanto, inibe o efeito citotóxico dessas células imunocompetentes (James & Glaven, 1989). Todavia, os esquistossômulos não ligam mais L-arginina do que outros aminoácidos (Haas et al., 2002), o que não descarta a possibilidade de tal ligação ocorrer em estágios mais tardios do seu desenvolvimento. O efeito protetor da remoção de arginina dos tecidos pode não ter a sugerida

importância para os esquistossômulos, pois a atividade citotóxica do NO é provavelmente menos relevante in vivo do que nos experimentos in vitro (Haas et al., 2002);

logo após a penetração, os esquistossômulos migram paralelamente à superfície da epiderme, entre o estrato córneo superficial e o estrato granuloso ou suprabasal, em peles mais delgadas. Essa localização é arriscada para o parasito, já que eles podem ser eliminados caso a cobertura do estrato córneo se rompa. Parece, assim, ser de grande importância para a sobrevivência dos esquistossômulos que eles tenham informação sobre a posição das camadas internas (a direção da migração a seguir) e da superfície da pele (direção a ser evitada na migração). Essa informação posicional necessária parece ser obtida por meio de gradientes de concentração de resíduos de L-arginina na epiderme humana, criados pela atividade de peptidil-arginina deiminases (PADs). Essas enzimas convertem arginina em citrulina, num processo chamado de citrulinação ou deiminação. A concentração desses resíduos é menor no estrato córneo superficial e vai progressivamente aumentando até o estrato germinativo basal (Senshu et al., 1995), podendo ser aproveitada pelos esquistossômulos para ajustarem sua correta posição na epiderme e orientarem sua posterior migração pelos tecidos dermais (Haas et al., 2002). Isso foi observado, in vitro, em um primeiro período de migração, no qual os esquistossômulos mostraram-se sensíveis a gradientes crescentes de D-glicose e L-arginina (Haas et al., 2002). Assim, seria possível que a especialização das cercárias de S. mansoni ao sinal de L-arginina possa ter evoluído para esse importante papel de orientação na migração inicial pelo hospedeiro, tendo o receptor de L-arginina obtido a função de identificação da superfície da pele na resposta de adesão e de quimiorientação durante a fase de exploração da epiderme (Haas et al., 2002).

No entanto, ácidos graxos livres da pele foram identificados como os principais fatores estimulantes para a penetração das cercárias na pele (Stirewalt, 1971). As características químicas desses ácidos graxos sugerem que as moléculas se encaixam em receptores cercarianos, que interagem com a terminação do grupamento carboxílico e as ligações duplas cis; todavia, algum efeito pode ser ocasionado pela permeabilização passiva das moléculas na superfície do corpo da cercária (Haas, 1984; Haas & Schmitt, 1982a; Haas & Schmitt, 1982b). Contudo, ainda não é conhecido qual dos receptores cercarianos já identificados responde a esse estímulo. De outra forma, outros ácidos graxos essenciais, não ligados ao processo de penetração, adicionalmente evocam a síntese de vários eicosanóides pela cercária de S. mansoni, que podem funcionar na evasão imunológica (Fusco, Salafsky & Delbrook, 1986; Fusco & Salafsky, 1987; Salafsky et al., 1988). Os lipídeos da superfície da pele, que apresentam ação estimulatória sobre cercárias, são ácidos graxos livres, insaturados, de cadeia média, principalmente ácidos linolênico e linoléico (Stirewalt, 1982).

Peculiaridades da Pele de Diversos Hospedeiros, Tempo dos Eventos na Migração Cutânea e a Perda da Cauda

A duração do ato de penetração das cercárias na pele varia de hospedeiro para hospedeiro: no homem e em cães jovens costuma ser de 15 minutos aproximadamente (Faust, Jones & Hoffman, 1934; Pinto & Almeida, 1945), mas pode variar de 3,1 a 17 minutos na pele humana (Stirewalt & Hackey, 1956) e de 0,7 a 19 minutos na pele de outros animais (camundongo, rato, macaco, hamster), a depender do sítio de infecção e da idade do animal (Stirewalt & Hackey, 1956). Já em culturas de células humanas (Barlett et al., 2000), o tempo o qual a adesão/penetração na pele foi máxima gira em torno de cinco minutos após a exposição às cercárias. Mesmo num determinado animal, como, por exemplo, no camundongo, a taxa de migração variou em diferentes tipos de pele, sendo mais lenta na pele da cauda. A derme da pele abdominal e da orelha foi invadida quase imediatamente por algumas cercárias migrantes, a primeira em até três minutos após a aplicação das cercárias. Na derme da pele da cauda, as primeiras cercárias migrantes foram encontradas somente após uma hora. A invasão efetiva de veias ou vênulas ocorreu no período de dois dias na pele abdominal, três dias na pele da orelha e cinco dias na pele da cauda. Nenhum parasito foi encontrado na pele abdominal e da orelha após quatro e cinco dias, respectivamente. Porém, eles permaneceram na pele da cauda pelo menos por 11 dias (Stirewalt, 1959). Virtualmente, nenhum parasito abandona a pele antes de 48 horas no camundongo, hamster ou rato, com tempo médio de saída estimado em 88, 65 e 70 horas, respectivamente (Miller & Wilson, 1978). Uma vez na derme, são necessárias mais dez horas para localizar uma vênula dérmica e 8,5 horas para penetrar a parede vascular e sair da pele (Curwen & Wilson, 2003).

A penetração, portanto, ocorre de forma bastante singular e é extremamente rápida, sendo antecedida por uma breve fase de adesão, na qual há a participação de secreções mucosas das glândulas pós- acetabulares. Tais glândulas compreendem três pares de células localizadas na região distal do segmento corporal da cercária, que enviam processos para a extremidade anterior, formando um sistema de ductos (Dorsey et al., 2002). Ainda durante a penetração, as cercárias de S. mansoni surpreendentemente podem reter suas caudas (Khammo et al., 2002; Whitfied et al., 2003), o que contraria o consenso atual de que as cercárias perderiam suas caudas no início da penetração (McKerrow & Salter, 2002; Sturrock, 1993; Wilson, 1987). Tal lugar-comum provavelmente se originou a partir da utilização de níveis implausivelmente elevados de densidades cercarianas (Gordon & Griffiths, 1951; Griffiths, 1953), induzindo à suposição de que o achado das caudas fosse apenas um artefato das condições experimentais não-fisiológicas (Whitfied et al., 2003). Nesses experimentos, trabalhando com pele humana, num preparado com câmaras de Franz (Franz cells) (Barlett, et al., 2000), ou com culturas de queratinócitos humanos, os pesquisadores observaram, por microscopia eletrônica de varredura, que aproximadamente 88% das cercárias penetrantes podem reter suas caudas durante a penetração, soltando-as só mais tardiamente, num fenômeno que foi rotulado de perda tardia da cauda [delayed tail loss (DTL)].

Desde a década de 1950, no entanto, o fenômeno da perda tardia das caudas, encontradas nos túneis criados pelas cercárias, já fora demonstrado em camundongos a partir de densidades não-excepcionais (Stirewalt, 1959). Um fato bastante interessante é que tal perda é facilmente induzida, in vitro, por estímulos mecânicos (Brink, McLaren & Smithers, 1977) e por estímulos químicos, como o uso de linoleato (Hara et al., 1993). A retenção das caudas, com seus espinhos no tegumento, teria a função de facilitar a movimentação cercariana para o interior da pele, através dos túneis de penetração, evitando movimentos retrógrados (Whitfied et al., 2003).

Nesse contexto, a perda tardia da cauda da cercária de S. mansoni poderia significar uma possível adaptação ao hospedeiro vertebrado, que favoreceria a mistura de antígenos larvais com a pele do animal infectado, acentuando a efetividade do ramo antilarvar da imunidade concomitante. A mistura de antígenos, portanto, incluiria os antígenos internos, como a paramiosina, e os antígenos de superfície da cauda. A paramiosina é uma proteína estrutural da musculatura da cauda (Gobert, 1998), o que poderia ajudar a explicar a presença de anticorpos antiparamiosina nas imunogloblulinas humanas produzidas em resposta a uma infecção esquistossomótica. A paramiosina, assim, pode ser considerada uma candidata para uma possível vacina contra a esquistossomose (Gobert, 1998). Mesmo que as caudas sejam tão somente liberadas na zona epidérmica da pele, os antígenos ainda seriam acessíveis para o sistema imunológico, visto que células de Langerhans (células dendríticas imaturas) podem atuar como células apresentadoras de antígeno, estimulando linfócitos T em linfonodos drenadores da pele.

A perda da cauda serve, junto com o aumento da temperatura, como um estímulo para alterações de permeabilidade que ocorrem na transformação de cercária para esquistossômulo (Colley & Wikel, 1974; Howells et al., 1974; Ramalho-Pinto et al., 1974). Porém, a perda da cauda não é essencial para que isso ocorra (Ramalho-Pinto, et al., 1974). Foi demonstrado que esquistossômulos que retiveram a cauda, após penetração cutânea in vitro, sobreviveram e cresceram em cultura (Clegg, 1965; Clegg & Smithers, 1971). A perda da cauda decorre de trauma mecânico, provocado por movimentos contra a resistência do corpo fixo, e não da secreção proteolítica das glândulas acetabulares (Howells et al., 1974).

Recentemente, as causas e implicações da imunidade concomitante passaram a ser examinadas sob uma perspectiva evolutiva (Brown, 2001), segundo a qual uma possível vantagem para os vermes adultos (e, presumivelmente, para as cercárias que se tornarão adultas) seria a manipulação da resposta imunológica de seus hospedeiros, prevenindo as futuras infecções por outras cercárias e assim desfavorecendo a competição para a cópula ou por microambientes preferenciais no hospedeiro.

A duração do período de permanência das larvas infectantes na pele do hospedeiro vertebrado, bem como a duração do ato de penetração dependem, portanto, de alguns fatores, como a espécie de esquistossomo e sua cepa, além da espécie de hospedeiro suscetível, como foi mostrado no início deste tópico.

Aspectos Anatômicos da Penetração Cercariana

Uma vez na vizinhança da pele quente, as cercárias prendem-se nos pêlos, enovelando-se nas hastes pilosas em direção à superfície da pele, ou aderem diretamente à própria superfície cutânea, onde são estimuladas, por lipídeos da pele, a penetrar (Stirewalt, 1982). A penetração envolve a orientação das cercárias para um sítio de entrada na pele, aderência firme pela região da ventosa oral, grande atividade muscular e copiosa secreção glandular (Stirewalt & Hackey, 1956). De fato, elas aderem pela ventosa oral numa gota de muco secretada pelas glândulas pós-acetabulares e passam, depois, a rastejar sobre a superfície da pele, trazendo a ventosa ventral para frente a fim de substituir a ventosa oral posicionada sobre o muco secretado. Nesse rastejamento, elas aparentemente passam a perceber sítios de entrada, constituídos por irregularidades tais como extremidades frouxas nas escamas epidérmicas, pregas ou sulcos, ângulos dos pêlos ou sítios de entrada (túneis) provocados por cercárias que penetraram anteriormente (Stirewalt, 1971). Um dos mecanismos de orientação parece estar baseado em uma modificação da orientação fotopositiva durante o estágio de vida livre cercariano para um estado de fotoorientação negativa durante a fase de migração para as camadas mais profundas da pele (Grabe & Haas, 2004). Na principal via de penetração (Gordon & Griffiths, 1951; Stirewalt & Dorsey, 1974; Wheater & Wilson, 1979), as cercárias atravessam o

estrato córneo em posição perpendicular à superfície (Figura 3), liberando os conteúdos das suas glândulas de penetração, e ingressam no estrato de Malpighi (constituído pelos estratos espinhoso e basal), seja por um folículo piloso ou em qualquer outro ponto da pele (Pinto & Almeida, 1945). Uma função dessas secreções é amaciar o estrato córneo para facilitar a passagem do parasito. Tais secreções se espalham lateralmente por entre os interstícios do estrato córneo, embora não permeiem da mesma maneira os queratonócitos vivos (Riengrojpitak, Anderson & Wilson, 1998).

Figura 3 – Etapas iniciais da invasão cercariana (até duas horas) em

pele de camundongo Swiss Webster: (A)Penetração horizontal sob

o estrato córneo, com manutenção da cauda (PAS-Azul de Alciano

pH 2.5); (B)Presença de duas cercárias, uma delas atingindo a

membrana basal da epiderme, ainda com a cauda, e a outra

localizada parcialmente na derme superficial (Hematoxilina-Eosina);

(C) Cercária atingindo membrana basal epidérmica (Hematoxilina-

Eosina); (D) Duas cercárias intra-epidérmicas, cortadas

transversalmente, com parte da face inferior tocando na membrana

basal epidérmica (PAS-Azul de Alciano pH 2.5)

 

A superfície da epiderme é constituída pelo estrato córneo, que consiste de várias camadas de queratinócitos sem núcleo e com um citoplasma contendo agregados de citoqueratina associados à filagrina. O complexo queratina-filagrina deposita-se sobre a parte interna da membrana plasmática, formando uma estrutura cornificada, chamada de envelope celular. Em adição ao complexo queratina-filagrina, o envelope celular contém mais três proteínas: involucrina e pequenas proteínas ricas em prolina e loricrina. Essas proteínas são interligadas por transglutaminases. Um envelope lipídico externo, formado por lipídeos extrudados dos corpos lamelares, contribui para a montagem de um envelope celular composto (Kierszenbaum, 2002). Em um ambiente aquático, a camada córnea perde a maioria de sua função como barreira, devido à hidratação dos espaços intercelulares. As cercárias movem-se, portanto, facilmente entre tais células, sem requerer qualquer atividade de degradação.

Ao atingirem o estrato espinhoso da parte média da epiderme, no entanto, tais vermes têm que sobrepujar as interações célula-célula específicas (desmossomos, compostos por caderinas não clássicas: desmocolina, desmogleína) pelo rompimento da camada celular (acantólise), formando diversos túneis facilmente observáveis numa movimentação lateral. Nesse momento, uma potente protease, denominada elastase cercariana, é identificada nas secreções da glândula acetabular (Salter et al., 2000). Uma vez que se aproximam da membrana basal da derme-epiderme, a velocidade de penetração das cercárias é retardada. Para entrar na derme, esses parasitos devem degradar as proteínas fibrilares da matriz da membrana basal (laminina, nidogênio, colágeno IV, perlecan), possivelmente mediante atividade proteolítica das glândulas acetabulares. Nesse estágio da penetração, possivelmente devido à sua localização distal, as cercárias não parecem atrair infiltrados leucocitários, exceto no ponto de entrada, onde ocorre a agregação de neutrófilos e macrófagos. Por sua vez, uma considerável intumescência da pele, adjacente aos parasitos, se torna aparente após 24 horas de penetração (Riengrojpitak, Anderson & Wilson, 1998).

A quimiorientação em direção a L-arginina livre e D-glicose pode ser um mecanismo adicional que apóie a migração em direção às camadas mais profundas da pele (Grabe & Haas, 2004). De fato, há um aumento da concentração de glicose na superfície da pele humana, de 0,6-1,7 mM (Spier & Schwarz, 1963) para 2,2-5,0 mM, na epiderme (Kansky, 1966), e 4,4-6,0 mM, no sangue. A concentração de resíduos de arginina epidérmicos também aumenta em direção às camadas mais profundas (Senshu et al., 1995).

A junção dermo-epidérmica ou zona da membrana basal (ZMB) é alcançada entre 30 e 150 minutos, ficando os vermes separados da derme por uma fina membrana basal, que constitui uma importante

barreira à migração subseqüente dos parasitos (Figura 3). Assim, o rompimento dessa barreira necessita do esforço concentrado das cercárias (Bruce et al., 1970). Nesse período, ocorre o extensivo rompimento e lise das células epidérmicas e a distensão e a interrupção da membrana basal logo abaixo dos parasitos, enquanto a área apical dos vermes retrai-se, mostrando-se ligeiramente subterminal. Espinhos proeminentes estendem-se pela membrana basal, por vezes indistinta. Os sulcos tegumentares e as papilas sensoriais não-ciliadas da região anterior, no entanto, permanecem evidentes, embora as papilas posteriores se mostrem freqüentemente danificadas. O tegumento apical contém numerosos grânulos secretórios, que parecem originar-se da glândula da cabeça (Crabtree & Wilson, 1985). Ainda nessa localização, um infiltrado de células MHC II+ + , Mac-1 é atraído para a derme subjacente, embora as cercárias não sejam cercadas por leucócitos na epiderme. Em alguns casos, os leucócitos dermais podem ser encontrados distantes dos parasitos, embora também possam estar localizados na proximidade, criando uma rede de células em interação (Riengrojpitak, Anderson & Wilson, 1998).

Em peles de camundongos, a maioria das cercárias migra horizontalmente entre o estrato espinhoso e a membrana basal da epiderme para um folículo piloso, onde ocorre a passagem pela membrana basal da glândula sebácea (Stirewalt, 1959, 1982; Wheater & Wilson, 1979). Acredita-se que essa trajetória é preferencial devido a uma menor resistência contra a migração (Wheater & Wilson, 1979). No entanto, a penetração na derme diretamente pela membrana basal é uma rota alternativa, já que algumas cercárias são encontradas logo abaixo da epiderme 24 horas após a infecção (Stirewalt, 1959; Wheater & Wilson, 1979). Nessa fase, a sobrevivência parece ser totalmente dependente da informação sobre a posição das camadas mais internas da pele (a direção da migração subseqüente) e a superfície da pele, que deve ser evitada (Grabe & Haas, 2004). As cercárias mantêm os seus lados ventrais em direção às altas concentrações de L-arginina, respondendo ainda mais sensivelmente quando esse aminoácido está ligado a peptídeos (Grabe & Haas, 2004). Além disso, a orientação do corpo em direção a concentrações crescentes de glicose também sugere a existência de um mecanismo de navegação seguro pela pele do hospedeiro (Grabe & Haas, 2004). Na pele da cauda de camundongo pode ocorrer, entre o 7o o e o 11

dias após a infecção, o retorno de parasitos para a epiderme, alguns voltando ao longo de folículos pilosos e outros se localizando em diferentes níveis de profundidade da derme, podendo ser encontrados necróticos e envoltos por reação celular (Stirewalt, 1959).

Uma vez na derme, os esquistossômulos seguem pela bainha de tecido conectivo perifolicular ou partem da derme papilar para os tecidos mais profundos, na procura de vasos venosos ou linfáticos, por onde abandonam a área exposta (Stirewalt, 1959). Alguns esquistossômulos retornam para a superfície, como já comentado, e outros perdem-se, como nômades, na junção dermo-hipodérmica, na hipoderme, ficando imersos entre células adiposas, e outros se afastam até fáscia intermuscular (Standen, 1953; Stirewalt, 1959).

Estudo ultra-estrutural da penetração cercariana na pele de camundongo revelou que a migração através das camadas intermédia e basal envolvia dano a desmossomos, membrana plasmática, citoplasma e organelas de células adjacentes aos esquistossômulos. Os núcleos pareciam inicialmente refratários aos efeitos dos esquistossômulos e mostravam alterações degenerativas somente após o citoplasma estar quase completamente dissolvido. Antes da membrana basal da epiderme ser completamente desintegrada, fibras colagênicas e fibrócitos subjacentes apresentaram alterações degenerativas, sugerindo que a secreção lítica se difundia através da membrana, atuando nos constituintes do tecido conectivo e facilitando a passagem do parasito (Bruce et al., 1970).

Participação de Enzimas Proteolíticas

Durante o processo de penetração, as dez glândulas (aproximadamente 30% do volume corporal) de cada cercária liberam seus conteúdos, com atividade lítica, contribuindo com os eventos mecânicos (Salter et al., 2000). A cercária tem três tipos de células glandulares, que contêm vesículas secretoras pré-formadas:

as glândulas acetabulares;

glândula da cabeça ou cefálica;

corpos celulares subtegumentares.

Cada uma delas exerce uma função na invasão do hospedeiro ou na transformação do parasito (Dorsey et al., 2002). Muitas proteases, com especificidades para vários substratos, têm sido identificadas nas glândulas pré e pós-acetabulares, sendo a mais importante uma serina-protease chamada elastase cercariana (Newport et al., 1988; Salter et al., 2000). Macromoléculas do hospedeiro, representando barreiras para a penetração cercariana, podem ser clivadas por atividades proteolíticas presentes nas secreções cercarianas. Essas moléculas incluem elastina (Gazzinelli & Pellegrino, 1964), condromucoproteína (Dresden & Asch, 1972), queratina (Tzeng et al., 1983), fibronectina, laminina e colágenos IV e VIII (McKerrow et al., 1985). Os conteúdos das glândulas acetabulares se exaurem entre uma e duas horas após o início da penetração cercariana (Brink, McLaren & Smithers, 1977; Cousin, Stirewalt & Dorsey, 1981) e estão completamente ausentes em 40 horas (Crabtree & Wilson, 1985). Portanto, a degeneração das glândulas acetabulares ocorre antes da entrada na derme e muito antes da invasão vascular (McKerrow & Salter, 2002). Então, perguntam Curwen & Wilson (2003), como o parasito rompe a barreira da membrana basal, cruza a derme e penetra a parede de uma vênula? Forte evidência morfológica aponta para a glândula cefálica como fonte de qualquer atividade hidrolítica expressa pelas cercárias (Crabtree & Wilson, 1985). Essa glândula é visível em esquistossômulos com três dias ou mais de idade e suas densas secreções granulares são liberadas da região apical esquistossomular quando pressionada contra a membrana basal e a parede de vênula (Curwen & Wilson, 2003). Em adição, a cápsula muscular da cabeça do esquistossômulo permanece até que a larva tenha pelo menos cinco dias de idade, ajudando, potencialmente, a região apical espinhosa a atuar como um aríete, provocando rompimento mecânico da parede do vaso. Como os músculos capsulares da cabeça são rapidamente perdidos durante a migração pulmonar, sua retenção durante a migração cutânea implica que tanto a musculatura como a área apical são funcionalmente importantes para o sucesso da invasão vascular (Crabtree & Wilson, 1985). A caracterização das secreções da glândula cefálica contribuirá para uma melhor intelecção do fenômeno migratório dos esquistossômulos, principalmente após a passagem pela barreira epidérmica.