2 – Filogenia, Co-Evolução, Aspectos Morfológicos e Biológicos das Diferentes Fases de Desenvolvimento do Schistosoma mansoni José Roberto Machado e Silva, Renata Heisler Neves Delir Corrêa Gomes

O corpo cercariano é ocupado em grande parte por grandes glândulas unicelulares em forma de frascos (segmentos 4 a 10), situadas anteriores ou posteriores ao acetábulo (ventosa ventral). Essa ventosa, maior do que a oral, tem forma de taça e se localiza na parte ventral do corpo cercariano (segmento 8). Os músculos longitudinais se estendem para o exterior. Poucas fibras circulares ocupam a borda externa da ventosa ventral. O seu centro contém, aparentemente, uma fileira desorganizada de fibras musculares ancorada à parede do corpo, de cada lado, por três pares de feixes de fibras musculares (Mair et al., 2003). A ventosa ventral tem importante papel durante a penetração da cercária no hospedeiro, visto que, alternadamente com a ventosa oral, ela se fixa à pele do hospedeiro onde foi depositado o muco secretado pelas glândulas (Dorsey et al., 2002). Os fundos e os ductos são abarrotados com corpos secretores produzidos no esporocisto. As quatro glândulas pré-acetabulares unicelulares, situadas no segmento 7, contêm uma variedade de enzimas proteolíticas (Dorsey et al., 2002). Nos seis pares de glândulas pós- acetabulares, os fundos e os ductos contêm grandes corpos secretores cujo conteúdo é de uma mistura de mucossubstâncias que facilitam a adesão da cercária à pele do hospedeiro.

Logo após os fundos da glândula pós-acetabular (entre os segmentos 9 e 10), na área ventral, há uma massa de células, as células germinativas. Essas células têm a forma de haste, com núcleo heterocromático e citoplasma rico em ribossomos, mitocôndrias, aparelho de Golgi e retículo endoplasmático granular. Nesse segmento aparecem células de suporte do tipo II, com núcleo eucromático, citoplasma com moderado número de mitocôndrias e pouco retículo endoplasmático granular. Essas células se diferenciam das do tipo I (presentes nos segmentos 4 e 5) por apresentar uma membrana nuclear menos densa.

O sistema de osmorregulação é mais complexo do que nos miracídios. Os túbulos coletores têm um lúmen cercado por células alongadas com núcleo bem definido e citoplasma relativamente homogêneo, com poucas vesículas e mitocôndrias. Os túbulos que essas células formam se prolongam do par anterior das células em flama até o cone muscular da ventosa oral (segmento 4), a vesícula excretora (segmento 10) e a cauda bifurcada (segmento 13). No corpo, pequenos túbulos das células em flama se conectam com células secundárias para formar um par de túbulos principais com paredes grossas. Cada túbulo principal se divide nos túbulos dorsal e ventral. Os ramos ventrais se curvam e entram na vesícula, paralelos entre si. Os ramos dorsais não entram na vesícula e se dirigem para trás e entram na cauda, terminando em células em flama. Na zona pré-vesicular tem uma célula com um grande núcleo monocromático com esparsa quantidade de cromatina densa (Dorsey et al., 2002).

Cada célula em flama (solenócito) tem uma forma irregular com um grande núcleo lobado, heterocromático, retículo endoplasmático granular, complexo de Golgi, mitocôndrias, vesículas de tamanhos variáveis e um proeminente feixe de cílios longos que se projetam para o lúmen da primeira célula tubular. Aparentemente, existem seis pares de células em flama, dos quais cinco situados no corpo e um na cauda. O tecido que compõe a vesícula excretora parece ser composto de células individuais com núcleo heterocromático e poucas mitocôndrias. A parte anterior dessa vesícula é rodeada por feixes musculares, enquanto nas áreas central e posterior há redução na musculatura dorsal (Dorsey et al., 2002). A organização da musculatura próxima à vesícula é diferente de outras áreas do corpo. Os músculos longitudinais parecem estar separados em feixes musculares unidos por cordões de fibras musculares.

A cauda da cercária é um órgão locomotor temporário que consiste em duas partes, o talo e a cauda bifurcada. Os quartos anteriores do talo apresentam musculatura circular e longitudinal, morfologicamente similares ao corpo. Deste, entretanto, diferencia-se na musculatura longitudinal por conter uma área sem miofilamentos visíveis (área afibrilar) e outra que contém densas fileiras paralelas de miofilamentos (área fibrilar) (Dorsey et al., 2002). Nas proximidades da metade do talo (segmento 11), a musculatura é estriada, não sendo conhecida a sua função na larva.

No parênquima da cauda são encontrados apenas miócitos, neurônios, células osmorreguladoras e células de suporte. A cauda bifurcada contém musculatura longitudinal, com miofibras circulares e transversas cuja atividade permite que as furcas atuem como remos durante a natação das cercárias (Mair et al., 2003). As células de suporte da cauda se diferenciam pelo tamanho, organização e localização. No terço anterior da cauda, as células grandes têm um núcleo heterocromático, citoplasma muito denso devido à presença de numerosos ribossomos. As células pequenas estão situadas na região média do talo (segmento 11) e são completamente envolvidas por células musculares. O citoplasma é denso e tem poucas mitocôndrias e retículo endoplasmático rugoso. Ao que parece, a função dessas células é impedir que as células musculares entrem em colapso, assim como ajudar a manter a posição correta dos ductos osmorreguladores no parênquima da cauda (Dorsey et al., 2002).

A luz induz a eliminação de cercárias, ocorrendo preferencialmente nas horas mais claras do dia (Rey, 2001). Estudos feitos em laboratório com B. glabrata infectada com a cepa BH (Belo Horizonte, Minas Gerais) de S. mansoni evidenciam que existe um ritmo circadiano na dinâmica de eliminação com acrofase (pico de eliminação em torno de 15 horas) (Bogéa et al., 1996). Esses autores verificaram que apenas 5% das cercárias eram eliminadas no período noturno. Observações feitas em B. glabrata de Guadaloupe indicam a ocorrência de duas acrofases, uma diurna (por volta das 11 horas) e outra vespertina (por volta das 16 horas) (Théron, 1984). Para este autor, a diferença intraespecífica na cronobiologia da cercária está relacionada com as características ecológicas do foco de transmissão. O modelo de acrofase diurna caracteriza populações de esquistossoma originárias de focos urbanos, com o homem desempenhando maior papel na transmissão. A tardia está relacionada com focos silvestres, onde os roedores atuam como os principais hospedeiros. Para o município de Sumidouro (Rio de Janeiro), a acrofase de uma amostra humana é matutina (em torno das 11 horas) e a de roedor (Nectomys squamipes) é tardia (16 horas). Embora diminua à noite, a amostra murina elimina cercárias até às 24 horas (Machado-Silva, 1981).

A utilização de roedores como animais sentinelas é um recurso para avaliar a dinâmica de transmissão de cercárias de S. mansoni. Camundongos expostos a um foco em Sabará (Minas Gerias) apresentaram 26,4% de infecção na parte matutina (9h-11h30m), 88,9% no período vespertino (15h-17h30m) e 65,5% entre 23h10m e 0h10m. No período matutino (9h30m-11h30m), predomina a infecção unissexual (Pellegrino & Maria, 1966). Espécimes de N. squamipes, criados em cativeiro, foram colocados em um foco em Sumidouro e se infectaram no período diurno (10h-14h) e crepuscular (17h-21h) (D’Andrea et al., 2002). A maior disponibilidade de formas infectantes, coincidente com o hábito do hospedeiro em freqüentar o foco, otimiza o contato entre ambos (Bogéa et al., 1996).

O padrão de eliminação de cercárias é um fenômeno geneticamente determinado. Experimentos realizados com cruzamentos entre S. mansoni e S. rodhaini mostraram que os híbridos preservam o modelo cronobiológico dos pais, isto é, diurno (S. mansoni) ou noturno (S. rodhaini) (Théron, 1989). O ritmo circadiano é também mantido entre cepas cronobiológicas (diurna e vespertina), simpátricas, de S. mansoni (Théron, Mouahid & Moné, 1997).

Os receptores sensoriais (papilas) do corpo cercariano, quando corados por nitrato de prata, apresentam um padrão útil para

estudos taxonômicos em cepas de Schistosoma sp. (Figura 3 C, visualizada anteriormente). Nas africanas, as papilas laterais apresentam disposição triangular, ao passo que, nas americanas, a disposição é linear (Bayssade-Dufour, 1977). As cepas humanas africanas apresentam o índice cercariano (média das distâncias entre a primeira e a segunda papilas laterais pré-acetabulares e entre a primeira e a segunda papilas dorsais pré-acetabulares) menor (1,0) do que o das americanas (1,4) (Bayssade-Dufour, 1979). Esse índice sofre variações de acordo com o hospedeiro e o número de passagens do S. mansoni em laboratório (Cassone, Albaret & Jourdane, 1981).

Embora o sexo já esteja definido desde a formação do miracídio, assim como essa fase, a cercária também não apresenta órgãos genitais característicos de cada sexo. Mesmo assim, a distinção entre os sexos tem sido apontada por distintas abordagens genotípicas e fenotípicas. A análise da heterocromatina do cromossomo W das fêmeas é feita pela reação de polimerase em cadeia (PCR) (Spotila et al., 1987; Gasser, Marahan & Mitchell, 1991; Grevelding, 1995; Grevelding, Sommer & Kunz, 1997; Boissier, Durand & Moné, 2001) e por citologia. As cercárias fêmeas apresentam apenas uma célula sexual e os machos, duas (Raghunathan & Bruckner, 1975).

Com base no estudo das papilas argentofílicas, os machos apresentam homogeneidade do número de papilas dorsais e ventrais do corpo e da cauda, número total de papilas ventrais do corpo, maior presença de papilas nos quadrantes inferiores direito e esquerdo da superfície ventral e menor distância entre as papilas cefálicas laterais (Pino & Morales, 1990; Pino et al., 1988). O mesmo tipo de análise foi realizado entre cepas isoladas de humanos e roedores no município de Sumidouro (Rio de Janeiro). Os machos apresentaram maior índice cercariano do que as fêmeas e se diferenciavam pelo número médio de papilas dorsais e papilas mediais ventrais no quadrante direito (cepa de humanos) e número médio de papilas dorsais medianas no quadrante esquerdo (cepa de roedor) (Freire et al., 2002).

A associação da morfometria com análise computadorizada e análise discriminante permite a distinção específica entre representantes do grupo S. mansoni. Cercárias com corpo cercariano médio de 122,7 μm e 217,2 μm de cauda são classificadas como S. mansoni, ao passo que 130,2 μm (corpo) e 232,9 μm (cauda) correspondem a S. rodhaini (Touassem, Cabaret & Combes, 1992). Em geral, as fêmeas apresentam maiores dimensões no corpo, no talo e na cauda bifurcada, enquanto os machos são maiores nas medidas das ventosas (Machado-Silva et al., 2000).

Há um acúmulo de informações que sugerem diferenças comportamentais entre os sexos das cercárias. À temperatura de 20-23°C, a proporção macho/fêmea é 1:1,2, enquanto a 27-29°C a proporção é de 2:1 (Souza, 1995). As fêmeas apresentam melhor desempenho do que os machos quanto ao desenvolvimento em moluscos de maior tamanho, à produção de cercárias e a uma longevidade maior. Os machos apresentam maior infectividade. Esses achados são interpretados como o desenvolvimento de estratégias adaptativas diferentes entre os sexos (Boissier, Morand & Moné, 1999).

Cercárias recém-eliminadas nadam ativamente, com movimentos característicos, acionados, sobretudo, pela movimentação da cauda (Cunha, 1970). O deslocamento que é feito com a cauda na frente se deve aos movimentos ativos para cima e passivos para baixo, que levam as cercárias para a superfície da água, onde permanecem até o esgotamento de suas reservas de glicogênio (Curwen & Wilson, 2003). Por apresentarem um sistema digestivo não funcional e não se alimentarem no ambiente, a longevidade da cercária se torna limitada. À medida que aumenta a temperatura, a longevidade diminui (Lawson & Wilson, 1980). Nas primeiras oito horas de vida, acima de 90% das cercárias permanecem vivas com atividade; entretanto, a partir dessa idade perdem a capacidade de fixação (Whitfield et al., 2003).

Diversos estudos realizados com modelos in vivo (camundongos) e in vitro (pele humana ou com cultura de ceratinócitos humanos) verificaram os mecanismos de localização do hospedeiro, fixação e invasão das cercárias (Curwen & Wilson, 2003; Whitfield et al., 2003a; Lawson & Wilson, 1983; McKerrow Salter, 2002; McKerrow, 2003; Whitfield et al., 2003b).

As cercárias, no ambiente, respondem a diversos estímulos. Turbulência e escuridão aumentam o período de natação, enquanto os produtos químicos da pele são os mais estimulantes, pois causam constante natação e mudança de direção nas cercárias (Curwen & Wilson, 2003). Não há evidências de movimento em direção ao hospedeiro (taxia), sendo aceito que a cercária responde a gradientes térmicos (termotaxia) (McKerrow, 2003). É consensual que a maior atividade de natação da cercária (cinese) aumenta a probabilidade de encontro com o hospedeiro (Curwen & Wilson, 2003; McKerrow, 2003).

A partir do contato com o hospedeiro, a cercária precisa se fixar, invadir e migrar para a pele do hospedeiro, em uma série de eventos que envolvem a resposta a sinais químicos do hospedeiro e alterações morfológicas da larva. Estabelecido o contato, a cercária se contrai e se fixa, fortemente, à pele pelas ventosas, adotando uma posição paralela à superfície da pele. Essa fixação é estimulada por L-arginina e assegurada por ceramidas e acilgliceróis (Haas et al., 2002; Haas et al., 1997). A invasão da pele do mamífero é decorrente da intensa ação vibratória da cauda e secreções das glândulas pré e pós-acetabulares, após a estimulação por ácidos graxos como o ácido linolênico. Recentemente, foi demonstrado que a secreção das glândulas pós-acetabulares (mucossubstâncias) é estimulada por lipídios da pele (Haas et al., 1997). Os autores de tais estudos mostraram também a secreção das glândulas pré-acetabulares (que contêm proteases) por dois mecanismos, combinados ou não com o processo de invasão ou com dano tecidual. Na vigência de invasão e dano tecidual, apenas os ácidos graxos estimulam a secreção. Quando esses fatores estão ausentes, possivelmente o estímulo é fosfatidilcolina.

As contrações e alongamentos das cercárias provocam o contato dos espinhos do tegumento com a pele do hospedeiro, o que pode levar a uma abrasão e alargamento da cavidade de penetração da cercária (McLaren, 1980). No processo de invasão, que não ultrapassa 15 minutos, a cercária perde a cauda e o corpo cercariano inicia a migração pela pele do hospedeiro (Cunha, 1970). No entanto, estudos com pele humana demonstraram que após a invasão a cauda continua presente, o que foi denominado perda atrasada da cauda (Whitfield et al., 2003a).

Esquistossômulo

A transição de vida livre para uma vida parasitária com diferentes temperaturas, concentração de açúcar e osmolaridade induz a mudanças bioquímicas e morfológicas nas cercárias. A transformação de cercárias para esquistossômulo é representada

por respiração anaeróbica, perda da cauda (Figura 4), eliminação progressiva do glicocálix, esvaziamento das glândulas secretoras e reorganização do tegumento, com acúmulo de uma proteína transportadora de glicose (SGTP4) na rede de cítons (corpos membranosos) subtegumentares (Skelly & Shoemaker, 2000). Uma das conseqüências da ausência do glicocálix é o aumento da permeabilidade do esquistossômulo à água (McLaren, 1980).

Figura 4 – Esquistossômulo de Schistosoma mansoni

 

A partir da penetração no hospedeiro vertebrado, o tegumento se torna especializado para absorção e secreção e para atuar como o sítio das ações imunológicas do hospedeiro. Os estudos ultraestruturais dos esquistossômulos recuperados 30 minutos após passagem pela pele ou mantidos in vitro ainda apresentam membrana externa trilaminada, porém com menor espessura. As células subtegumentares contêm pequenos corpos laminares que são transportados para o tegumento por conexões citoplasmáticas. Nos espécimes com 60 minutos, os corpos membranosos se fundem para formar grandes vacúolos com membrana externa heptalaminada. Com três horas, a maior parte da membrana externa é heptalaminada e o tegumento contém grandes vacúolos, corpos alongados e pequenos corpos membranosos. No esquistossômulo de 24 horas, a principal modificação é a formação de pregas e cavidades na superfície (McLaren, 1980; Hockley & McLaren, 1973).

A marcação da superfície do esquistossômulo por auto-radiografia mostra, pelo menos, 12 glicoproteínas que não são identificadas em cercárias (Brusca & Brusca, 1990). A transformação torna o tubo digestivo funcional, diferente da cercária, onde não é funcional. Estudo recente em esquistossômulos identificou vesículas, no tubo digestivo, que poderiam ser grandes lisossomos (Carneiro-Santos et al., 2001). Essas organelas ricas em fosfatase ácida também estão presentes nas células musculares, com papel não esclarecido na fisiologia do esquistossômulo (Al-Adhami et al., 2003).

Diversos autores procuraram estabelecer os fatores envolvidos na morfogênese do tegumento durante a transição de cercária para esquistossômulo (Gilbert et al., 1972; Stirewalt, 1974; Ramalho-Pinto et al., 1975; Haas, 1984). Admite-se que a invasão da pele, por si só, não seja o fator determinante, pois a transformação acontece sem penetração (Skelly & Shoemaker, 2000). Esses autores avaliaram o padrão de distribuição de SGTP4 em esquistossômulos mantidos em cultura, com diferentes osmolaridades ou incubados com ácidos graxos. Os ácidos linolênico e capróico, que estimulam a invasão das cercárias e a perda da cauda, não foram fatores indutores de morfogênese. A introdução de glicose no meio e a elevação da temperatura aumentaram o percentual de esquistossômulos do estágio 3 (com SGTP4 nos cítons superficiais), o que sugere um efeito sinérgico entre esses fatores. No esquistossômulo recémtransformado, ao fim de três horas esse transportador está uniformemente distribuído no tegumento (Skelly & Shoemaker, 2000).

Após a invasão da pele e transformação em esquistossômulo, o parasito necessita se deslocar da epiderme em direção à derme e sair por via sanguínea ou linfática. Não parece haver contestações de que esse deslocamento requer que os esquistossômulos vençam barreiras. Entretanto, os autores divergem com relação às barreiras, o tempo necessário para vencê-las e como as secreções glandulares, principalmente a elastase cercariana (protease cercariana) da glândula pré-acetabular, destroem essas barreiras (Curwen & Wilson, 2003; McKerrow, 2003). Isso se deve, em parte, ao uso de diferentes abordagens de estudo: pele humana, pele de roedores e cultivo in vitro. Como consenso, admite-se que a penetração do parasito na epiderme envolva a degradação de moléculas de adesão extracelular, como as proteínas da família caderina (Curwen & Wilson, 2003; McKerrow, 2003). Em pele de rato recémnato, 7% da população migram em 15 minutos, aumentando para 41% em 60 minutos (McKerrow, 2003). Para alguns autores, a atividade proteolítica só cessa após o esquistossômulo atingir o espaço vascular. O conteúdo glandular da glândula cefálica permanece em esquistossômulos com mais de 40 horas e, naqueles de três dias, permanece a elastase cercariana (McKerrow & Salter, 2002; McKerrow, 2003). Outros experimentos revelam que as glândulas acetabulares e as cefálicas já estão vazias nos esquistossômulos com 40 horas de idade, questionando a participação dessas secreções no processo invasivo da derme (Curwen & Wilson, 2003).

Estudos recentes in vitro identificaram fatores sinalizadores da migração dos esquistossômulos. Após a penetração, os esquistossômulos migram lateralmente dentro de túneis paralelos à superfície da epiderme e se deslocam para as camadas mais profundas da pele. Os esquistossômulos apresentam fotoorientação negativa (Grabe & Haas, 2004a), respondem a gradientes químicos do soro humano (L-arginina e D-glicose) e peptídeos no soro e células endoteliais (fibronectina e bradicinina). Os esquistossômulos ajustam o eixo do corpo com lado ventral voltado para a maior concentração de L-arginina e D-glicose (Grabe & Haas, 2004b). Os autores desses estudos comentam que a concentração de glicose aumenta, progressivamente, da pele até o sangue, assim como a concentração de arginina, que é maior nas camadas epidérmicas mais profundas.

Após saírem da pele, os esquistossômulos invadem um vaso sanguíneo, passam pela pequena circulação e chegam aos pulmões, ao que parece, por volta de quatro a cinco dias após a infecção, de acordo com o hospedeiro empregado: hamster, rato ou camundongo. A cinética de migração do esquistossômulo em pele de coelho, através de auto-radiografia, demonstra que, no primeiro dia, os esquistossômulos ainda estão concentrados na pele. A partir do segundo dia, a concentração na pele diminui progressivamente, com acúmulo no pulmão por volta do sexto dia de infecção (Pinto et al., 1990). Nessa fase, os esquistossômulos são maiores, com cerca de 400 μm de comprimento e mais estreitos do que os encontrados na pele, com as extremidades (anterior e posterior) cobertas por espinhos. As principais mudanças no tegumento são a superfície pregueada e escavada, ao passo que a membrana tegumentar externa continua heptalaminada (McLaren, 1980; Hockley & McLaren, 1973).

Os espécimes coletados no pulmão, com cerca de 14 dias de idade já apresentam o ceco preenchido por pigmento, resultante da digestão de hemoglobina. A área da superfície do tegumento é quatro vezes maior do que no esquistossômulo de sete dias (Hockley & McLaren, 1973). A permanência dos esquistossômulos por dois a três dias nos pulmões, com mudanças nas dimensões e grande atividade, podem ser pré-requisitos para a sua migração, através da rede vascular pulmonar, em direção ao fígado (Rey, 2001). Os primeiros esquistossômulos chegam ao fígado em torno de uma semana, após a infecção. Porém, nessa migração ocorre um acentuado assincronismo (Barbosa et al., 1978), possivelmente relacionado a diferenças na capacidade dos esquistossômulos para entrar em artérias que os conduzam ao sistema porta-hepático (Rey, 2001).

A transição da forma pulmonar para a hepática envolve significativas mudanças morfológicas e fisiológicas nos esquistossômulos. Com base nas características morfológicas do tubo digestivo, foram definidos seis estágios evolutivos (esquistograma):

(forma pulmonar): ceco em desenvolvimento com pouco pigmento;

(formação do tubo digestivo): ceco bifurcado sem ultrapassar a ventosa ventral;

ceco bifurcado que ultrapassa a ventosa ventral e se une mais abaixo, formando um ceco único;

ceco único menor do que o ceco bifurcado;

ceco único maior do que o bifurcado, porém não ultrapassa três vezes o tamanho do ceco bifurcado;

ceco único três vezes maior do que o ceco bifurcado (Barbosa et al., 1978). A ingestão de hemácias e a divisão celular começam nos espécimes com 15 dias (estágio dois), recuperados do fígado (Clegg, 1965).

A topografia da superfície dos esquistossômulos também passa por mudanças. No estágio dois, a superfície é pregueada e estriada, sem evidências de depressões como as encontradas nas formas pulmonares. O tegumento tem uma espessura de cerca de 2 μ, sem diferenças entre as formas com duas ou três semanas de idade (McLaren, 1980).

Transição esquistossômulo-vermes adultos

Após chegarem ao fígado, as formas imaturas rapidamente dão início a organogênese, que é bem caracterizada a partir do terceiro estágio (21 dias). O sistema reprodutor se diferencia da grande maioria dos trematódeos digenéicos, pois não tem órgão copulador (cirro) e mais de um testículo. Os machos, ainda não totalmente desenvolvidos, apresentam dois pequenos lobos testiculares e uma curvatura dorsoventral do corpo, o canal ginecóforo, parcialmente desenvolvido. Nas fêmeas, o útero é rudimentar, o tegumento é composto de estrias largas, profundas, bem organizadas, com típico aspecto escavado.

Com quatro semanas ocorre a gametogênese. Os machos apresentam oito lóbulos testiculares, com espermatozóides visíveis nos dois ou três lobos anteriores. Os espermatozóides apresentam uma extremidade cefálica bulbar (8 x 2 μm) e um flagelo de 20 μm de comprimento. Por microscopia eletrônica de transmissão, verifica-se que os espermatozóides não têm um acrossoma e possuem poucas mitocôndrias, indiferenciadas, que se acumulam na parte anterior da cabeça. O flagelo começa no corpo basal, posterior e ligeiramente lateral ao núcleo, com o complexo axial do tipo 9 + 0 (Kitajima, Paraense & Corrêa, 1975).

A superfície do corpo é mais lisa, com o surgimento de organelas sensoriais, e na face dorsal aparecem protuberâncias (tubérculos) com espinhos. O tegumento tem 4 μm, um grande número de corpos membranosos e poucas mitocôndrias (McLaren, 1980). Nas fêmeas já há um pequeno ovário e o oótipo começa a se desenvolver.

Na quinta semana, os machos não mais apresentam modificações importantes no sistema reprodutor, isto é, canal ginecóforo e número definitivo de lobos testiculares. A superfície mais externa do tegumento que interage com o hospedeiro é formada por duas camadas lipídicas justapostas, enquanto a superfície basal interna é limitada por uma única membrana de camada dupla. A membrana externa tem aspecto heptalaminado e com invaginações. O tegumento conecta-se às células subtegumentares (cítons) por conexões citoplasmáticas ligadas por microtúbulos. Os cítons contêm núcleo, mitocôndrias, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, corpos membranosos e corpos discóides (vesículas multilamelares), onde se fundem com a superfície mais externa.

O canal ginecóforo se forma quando as extremidades laterais do corpo dobram-se entre si, da direita para a esquerda ou vice-versa

(Figura 5 A). A superfície dorsal é coberta por numerosos tubérculos com espinhos, enquanto a superfície entre os tubérculos é

composta por estrias rasas e planas (Figura 5 D).

Nas fêmeas aparece a proteína da casca do ovo, e os folículos ovarianos se desenvolvem ao longo do corpo, posteriores ao ovário. O aprimoramento de equipamentos de alta resolução tem permitido o estudo detalhado das características dos vermes adultos em espécimes vivos ou fixados. Para esse tipo de estudo, são feitas microscopia de campo claro, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de varredura laser confocal e microscopia eletrônica de transmissão. Os vermes são fixados (por exemplo, em AFA – ácido acético, formalina e álcool), corados (carmim clorídrico alcoólico ou hematoxilina) e montados em lâminas histológicas. Esta preparação é utilizada na microscopia de campo claro e no confocal, que fornece imagens seriadas dos espécimes. Assim, as técnicas se complementam e a lâmina pode ser depositada em coleções helmintológicas, para servir em estudos posteriores.

Figura 5 – Fotomicrografia por microscopia eletrônica de varredura

do tegumento de Schistosoma mansoni (A, D) e interior do canal

ginecóforo (B, C)

 

A morfologia dos vermes adultos foi estudada há quase cem anos, no Brasil (Pirajá da Silva, 1908). Os vermes machos apresentam o corpo esbranquiçado com comprimento médio de 10 mm. Na região anterior estão presentes a ventosa oral e a ventral (acetábulo),

maior e mais proeminente (Figura 6 D) do que a ventosa oral. A superfície entre as ventosas oral e ventral não apresenta tubérculos,

espinhos e papilas sensoriais (Figura 6 A). A ventosa oral ovalada apresenta três regiões bem distintas: uma inferior, mais larga, e outra posterior, ambas cobertas por espinhos, afilados, de tamanhos variados, e, ao fundo, a cavidade oral.

Figura 6 – Fotomicrografia por microscopia eletrônica de varredura

(A, C) e microscopia de varredura laser confocal (B, D) da região

anterior de vermes adultos machos de Schistosoma mansoni:

ventosa oral (VO), tubo digestivo (TD) e ventosa ventral (VV)

 

A musculatura das ventosas é composta por músculos não somáticos. A contração dos músculos situados em posição meridional serve para abrir a ventosa, enquanto a contração das fibras equatoriais com os músculos radiais, situados entre as faces interna e externa, fecha a ventosa (Mair et al., 1998).

A borda superior da ventosa oral é composta por numerosos

espinhos afilados e uma área isenta de espinhos (Figura 6 C). A borda inferior apresenta espinhos e papilas sensoriais (não ciliadas), situadas em um local sem espinhos, onde o tegumento é poroso. A extremidade do acetábulo é constituída por duas áreas com espinhos e uma terceira porosa, sem espinhos, onde são evidenciadas algumas papilas sensoriais. Essas papilas estão dispostas entre as duas fileiras de espinhos (Machado-Silva, Lanfredi & Gomes, 1997).

À semelhança de outros trematódeos, o sistema digestivo dos vermes adultos se inicia com a boca localizada no fundo da ventosa

oral, seguida por um esôfago curto (Figura 6 B), que se bifurca à altura do acetábulo. Os dois cecos intestinais percorrem as margens laterais do corpo e no nível médio se unem em um ceco único, que termina em fundo de saco. A ventosa oral é, portanto, utilizada para a ingestão de alimentos e eliminação de materiais residuais do metabolismo. Morfologicamente, o sincício intestinal parece com uma estrutura metabolicamente ativa, com uma grande área superficial que é indicativa de função de absorção. A membrana é trilaminada, semelhante às células intestinais (Hockley, 1973).

O tubo digestivo é o sítio dos principais antígenos circulantes (anódico e catódico), produzidos pelos vermes. Em vermes marcados com anticorpos monoclonais contra os antígenos circulantes, por microscopia confocal, se verificou intensa marcação no ceco ramificado (Borges et al., 1994). No tubo digestivo são também encontradas peptidases que digerem as proteínas das hemácias do hospedeiro (Caffrey et al., 2004).

O sistema reprodutor é composto por seis a dez lóbulos testiculares, embora possam ser encontrados valores inferiores (três) e superiores (treze), situados logo abaixo da ventosa ventral. De cada lóbulo testicular sai um vaso eferente que se reúne em um canal deferente, desembocando na vesícula seminal, de onde sai o canal

seminal (Figuras 7B, 7C) para o poro genital, pequeno e

arredondado, situado no início do canal ginecóforo (Figura 7A). Entretanto, por microscopia de varredura laser confocal, verificou-se

uma intercomunicação entre os lóbulos testiculares (Figura 7C), sem a participação do vaso eferente (Machado-Silva, et al., 1998). O poro genital fica do lado oposto ao que contém maior número de tubérculos da região dorsal.

Figura 7 – Fotomicrografia por microscopia de varredura laser

confocal da região anterior de vermes adultos machos de

Schistosoma mansoni, com destaque para o sistema reprodutor:

poro genital (PG), canal ginecóforo (CG), lobos testiculares (LT) e

vesícula seminal (VS)

 

O canal ginecóforo alberga uma fêmea (Figura 9), ou excepcionalmente mais de uma ou mais um outro verme macho, caso o hospedeiro seja infectado apenas por espécimes do sexo masculino. O início do canal é caracterizado por apresentar poucos tubérculos, ausência de espinhos e tegumento poroso na área adjacente ao poro genital, mas sem receptores sensoriais. O interior do canal é constituído por espinhos mais afilados e outros pequenos, não pontiagudos, e papilas sensoriais, distribuídos

desigualmente no interior do canal (Figuras 5B, 5C, vistas anteriormente). A região distal do canal apresenta papilas sensoriais

ciliadas ou não (Figura 8 A). A extremidade distal da região posterior do corpo não apresenta tubérculos nem espinhos, mas uma concavidade no tegumento, onde está localizado o poro excretor

(Figura 8 B).

Figura 8 – Fotomicrografia por microscopia eletrônica de varredura

da extremidade posterior de vermes adultos machos de

Schistosoma mansoni, com detalhes do canal ginecóforo (A) e o

poro excretor (PE)

Figura 9 – Vermes adultos acasalados de Schistosoma mansoni

corados por carmim clorídrico

 

O estudo detalhado do sistema excretor de vermes adultos não é possível com o emprego de microscopia de luz (Kastner et al., 1975). Essa dificuldade tem sido ultrapassada com o emprego de marcadores fluorescentes e anticorpos monoclonais, que permitem estudar detalhadamente o sistema excretor (Borges et al., 1994; Sato, Kusel & Thornhill, 2002; Wippersteg et al., 2003). O sistema protonefridial, semelhante ao descrito em cercárias, consiste de células em flama, de onde parte um conjunto de ramificações, que se unem em dois túbulos coletores limitados pelo epitélio. Após o final do tubo digestivo, os túbulos são visíveis e se unem em uma vesícula excretora, que se abre para o exterior pelo poro excretor ou nefridioporo, na extremidade distal do corpo (Machado-Silva, et al., 1998). O sistema de excreção tem algumas funções já conhecidas: ultrafiltração do fluido saindo do organismo para o meio externo e excreção ou absorção de diferentes matérias solúveis por transporte ativo. Admite-se que o papel das células em flama seja manter a pressão hidrostática, para assegurar a força propulsiva para a ultrafiltração (Bogers et al., 1994).

Estudos mais recentes indicam que o sistema excretor desempenha importante papel na relação parasito-hospedeiro, devido à identificação de moléculas de sinalização, como as fosfatases e as proteases, nesse sistema. Por intermédio de microscopia confocal, observou-se que a protease cisteína ER60 estava no epitélio excretor, sugerindo que possa estar envolvida com a invasão tecidual, degradação de macromoléculas ou processo de evasão da resposta imune (Wippersteg et al., 2003).

As fêmeas apresentam comprimento médio de 14 mm, duas pequenas ventosas, corpo filiforme; é mais escura do que os machos, com coloração castanho-escura devido à maior taxa de ingestão e quebra de hemoglobina em hemozoína (Oliveira et al., 2000). A topografia da superfície do corpo é mais simples do que a dos machos. A superfície inteira é escavada, com poucos espinhos presentes, principalmente, na extremidade posterior (McLaren, 1980).

O sistema reprodutor feminino é formado por um único ovário

oblongo, na metade anterior do corpo (Figuras 10A, 10B, 10D). Por microscopia de campo claro, em lâminas montadas e coradas, o ovário contém células com diferentes dimensões. O estudo mais detalhado por microscopia laser confocal evidencia que as diferenças se devem à existência de ovócitos ou oócitos em diferentes estágios de maturação. Na parte mais estreita do ovário, os ovócitos são indiferenciados, com maturação progressiva à

medida que se aproximam da saída pelo oviduto (Figura 10 D). O oviduto possui um esfíncter denominado ovicaptor, que controla a passagem dos ovócitos – assim denominados por não terem completado a meiose – produzidos no ovário. Antes de se dirigir ao oótipo, o oviduto sofre um alargamento e forma o receptáculo seminal (espermateca), onde são armazenados os espermatozóides

(Figura 10 B).

As glândulas vitelogênicas ocupam os dois terços posteriores do corpo. As células vitelínicas de cada folículo apresentam diferentes estágios de desenvolvimento, desde pequenas células sem glóbulos da casca até outras com grandes glóbulos, com material precursor da casca do ovo. As células apresentam também diferenças na localização no interior dos folículos: as imaturas ficam na periferia e as maduras, na área central, de onde passam para o viteloduto ou ducto vitelínico (Fried & Graczyk, 1997). A maturação das células vitelínicas é classificada em quatro estágios:

o núcleo é grande em relação ao tamanho da célula, com um grande nucléolo e grupos de ribossomos, complexo de Golgi e mitocôndrias;

aumenta o volume citoplasmático, o tamanho e o número de ribossomos e o retículo endoplasmático torna-se proeminente;

continua aumentando o volume do citoplasma em relação ao núcleo e ficam evidentes os glóbulos vitelínicos e o complexo de Golgi. As gotículas vitelínicas e os glóbulos variam em tamanho;

o núcleo tem heterocromatina dispersa e grande nucléolo, com poros nucleares presentes na membrana nuclear. Existe uma quantidade abundante de grandes gotículas vitelínicas ao redor da periferia da célula, com evidência de gotículas de lipídeos, ribossomos e complexo de Golgi. É nessa fase que as células maduras se deslocam para o oviduto e chegam ao oótipo (Fried & Graczyk, 1997).

Figura 10 – Sistema reprodutor de vermes fêmeas de Schistosoma

mansoni: contraste de interferência diferencial (A, C) do ovo (O), do

ovário (OV), do oviduto (OVT) e do viteloduto (VT). Microscopia de

varredura laser confocal (B, D) do ovário (OV), do receptáculo

seminal (RS) e dos ovócitos (OVC)

 

O viteloduto também se dirige para a região anterior do corpo

(Figura 10 C), onde se une ao oviduto nas proximidades do oótipo, região denominada viteloduto-oviduto ciliado (LoVerde & Chen, 1991). O oótipo é uma câmara constituída por epitélio celular cuboidal, musculatura circular e longitudinal, cuja contração determina a forma da casca do ovo. Por microscopia de varredura de confocal a laser identificamse ovos típicos, com espinho lateral, e

outros em processo de formação da casca (Figuras 1A, 1B). O oótipo é circundado por um grupo de células glandulares unicelulares, a glândula de Mehlis (Erasmus, 1973). O lume da região posterior do oótipo recebe a secreção da glândula através de longos ductos, cuja membrana plasmática é conectada à membrana plasmática das células do oótipo por desmossomas septados (Erasmus, 1973). A glândula de Mehlis (também erroneamente conhecida como glândula da casca, por atribuírem a ela a produção da casca do ovo) tem outras funções, como a formação de uma membrana em volta do ovócito, onde se deposita a substância formadora da casca (produzida, na verdade, pelas glândulas vitelogênicas), e o estímulo às células vitelínicas para produzirem a substância formadora da casca do ovo. A estabilização da casca do ovo se dá por um processo conhecido por tanificação, no qual a enzima profenolase promove a catalisação e posteriormente a oxidação do processo. Supõe-se também que a glândula de Mehlis forneça material que serve como molde para as gotículas da casca do ovo, durante a modelagem da cápsula (Fried & Graczyk, 1997). Estudos por citoquímica revelaram que na região do oótipo encontram-se partículas de glicogênio, secreções das glândulas de Mehlis e secreções produzidas pelo oótipo distal. Ao que parece, as glicoproteínas secretadas pelo oótipo distal funcionam como um agente lubrificante para a passagem do ovo no útero (Moczon, Swiderski & Huggel, 1992). A junção entre o oótipo e o útero é caracterizada pela presença de um esfíncter muscular (Erasmus, 1973). O útero é um canal com aspecto irregular, muscular, com uma camada citoplasmática externa, contendo uma variedade de corpos e mitocôndrias (Erasmus, 1973). Geralmente, o canal uterino contém um só ovo que alcança o exterior, através do poro genital situado abaixo da ventosa ventral.

Apesar de não se conhecer a causa, os vermes machos e fêmeas apresentam anormalidades no sistema genital. Além da distribuição normal dos lóbulos testiculares, diversos autores encontraram em suas pesquisas uma série de localização atípica, denominada testículos supranumerários (Najim, 1951; Travassos, 1953; Coles & Thurston, 1970; Soliman, Mansour & El-Assal, 1984; Machado-Silva et al., 1994, 1995; Neves et al., 1998). Outra anormalidade observada foi a ausência de lóbulos testiculares (agenesia testicular) em espécimes com aspecto normal do canal ginecóforo, do tegumento e dos tubérculos. Nas fêmeas se encontrou ovário atrofiado, 17 ovos uterinos com embrião em desenvolvimento e sistema digestivo com aspecto vacuolizado (Neves et al., 2003). O sistema reprodutivo dos vermes adultos pode apresentar modificações estruturais, provocadas pelo cultivo in vitro (Basch & Basch, 1982) por drogas não esquistossomicidas, destinadas a diminuir as taxas de colesterol do hospedeiro (Araújo et al., 2002) e a induzir diabetes melito (Hulstijn et al., 2003).

Estudo comparativo entre fêmeas maduras e de infecção unissexual demonstra que essas últimas são menores, com alterações no ovário, representadas principalmente pela incapacidade do complexo de Golgi para produzir grânulos corticais. Apesar das células da glândula de Mehlis apresentarem material secretor, os ductos da glândula não eliminam o seu conteúdo no oótipo, como nos vermes sexualmente maduros. Glândulas vitelínicas apresentam agrupamentos de células indiferenciadas, enquanto os ductos vitelínicos e o útero não têm nenhuma alteração morfológica, em comparação com as fêmeas acasaladas (Erasmus, 1973).

Após o acasalamento, as fêmeas sofrem modificações ultraestruturais e metabólicas, tais como a diferenciação celular com produção de células vitelínicas maduras, aumento da taxa de captação de tirosina, timidina e aumento do acúmulo de cálcio (Erasmus, 1986). O acasalamento é fundamental para a manutenção da maturidade sexual das fêmeas, incluindo-se a produção de ovos.

As relações fisiológicas existentes entre helmintos e hospedeiros são complexas e ainda não perfeitamente entendidas. Os vermes adultos completam o ciclo biológico em diversos hospedeiros: humanos, babuínos, hamsters, camundongos, ratos e coelhos, com os quais são estabelecidas interações que provocam diferenças nas características morfológicas, fisiológicas e comportamentais do helminto. Tais modificações podem ser evidenciadas quando o helminto se desenvolve em um hospedeiro não permissivo, como o rato albino, onde os vermes são atrofiados, há retardo e desenvolvimento incompleto do tegumento com os tubérculos não apresentando espinhos (Senft, Gibler & Knopf, 1978). Quando esses espécimes são transplantados para um hospedeiro permissivo (hamster), aumentam de tamanho e se localizam nas veias mesentéricas. Nos vermes transplantados de camundongos para ratos, os espécimes regridem em tamanho, permanecem no fígado e produzem ovos com desenvolvimento incompleto (Cioli, Knopf & Senft, 1977). Esses estudos evidenciaram que as condições fisiológicas e reprodutivas dos vermes são influenciadas pelo hospedeiro.