3 – Migração e Desenvolvimento de Schistosoma mansoni no Hospedeiro Definitivo Henrique Leonel Lenzi, Arnon Dias Jurberg, Paulo Marcos Zech Coelho e Jane Arnt Lenzi

Altos níveis da Ca 2+, equivalente a 10 M, têm sido demonstrados nas glândulas pré-acetabulares das cercárias (Dresden & Edlin, 1974). O influxo cercariano de Ca 2+ é importante na liberação de proteinases (Fusco et al., 1991) assim como o Ca 2+ também estimula a remoção do glicocálix, em cooperação com as proteases liberadas pela glândula, limitando assim os possíveis danos à membrana da superfície tegumentar, que podem resultar de ataques pelo complemento (Ruppel et al., 1983). O Ca2+ cercariano pode exercer outros efeitos hipotéticos durante a penetração cutânea:

ligar-se a fosfolipídeos e prevenir danos à membrana; aumentar a perda da cauda durante a penetração;

danificar a membrana parasitária quando em altas concentrações;

prevenir a dispersão de antígenos do glicocálix e delongar sua apresentação a células apresentadoras de antígenos;

estimular a coagulação sanguínea, que pode selar capilares rotos durante a migração parasitária.

Todavia, permanece uma questão não respondida: qual a função da alta concentração de Ca2+ nas cercárias? (Modha et al., 1998).

Fatores que Interferem na Penetração Cercariana

A penetração cercariana pode ocorrer entre 7°C e 45°C, com uma média de penetração boa entre 16°C e 35°C e ótima entre 27°C e 28°C (De Witt, 1965; Stirewalt & Fregeau, 1965). A idade das cercárias pós- eliminação dos caramujos é também um fator de grande importância, sendo ótima de uma a três horas, perdendo levemente a capacidade de penetração nas seguintes cinco horas, sem, contudo, perder a capacidade de maturação (Olivier, 1966; Stirewalt & Fregeau, 1965). O período de eliminação pelos caramujos (patency of snail infection), entre 41 e 46 dias, é consistente com a diminuição da capacidade cercariana, refletindo algum tipo de crise na fisiologia do caramujo (Stirewalt & Fregeau, 1965). A relação da concentração cercariana por unidade de pele é assunto de controvérsia. Invasão maciça de cercárias faz com que elas fiquem mais gregárias, tendendo a alterar o tipo de penetração e aumentando a intensidade do comportamento invasivo (Griffiths, 1953; Stirewalt & Fregeau, 1965). As seguintes situações ideais são sugeridas para se obter uma boa infecção cercariana: manter a água desclorada a 27°C, um período entre a liberação cercariana dos moluscos e a penetração na pele de no máximo três horas e um tempo de exposição de 60 minutos (Barbosa et al., 1978; Campbell & Cuckler, 1961; De Witt, 1965; Olivier, 1966).

 

Transformação de cercárias em

esquistossômulos

Entre uma e três horas após a penetração das cercárias na pele do hospedeiro mamífero, um aumento na temperatura e na osmolaridade inicia uma série de adaptações bioquímicas e morfológicas específicas, que rapidamente preparam os parasitos para sobreviverem ao novo ambiente (Cousin, Stirewalt & Dorsey, 1986; Stirewalt, 1974). Em apenas uma hora, a maior parte do glicocálix é perdida. O tegumento se converte de uma estrutura trilaminada para uma estrutura heptalaminada (nova membrana heptalaminar) (Stirewalt, 1974), bem como ocorre desvio do metabolismo oxidativo para anaerobiose facultativa, com excreção de ácido lático (Coles, 1972). O parasito passa a não mais tolerar a água fresca (Hockley & McLaren, 1973; McLaren, 1980; Stirewalt, 1974).

As cercárias, ao desprenderem seu glicocálix, formam e eliminam microvilos da sua superfície (McLaren, 1980), adquirindo a capacidade de ligar concanavalina A e aglutinina de germe de trigo (Murrel et al., 1978). Três tipos de microvilos podem ser reconhecidos:

curtos com extremidade apical bulbosa;

longos e estreitos, com bulbo terminal;

longos, com aspecto de rosário.

Além dos microvilos, pequenas bolhas esféricas aparecem na superfície larval (McLaren, 1980).

As glândulas pré e pós-acetabulares contribuem para a remoção do glicocálix (McKerrow, 1989; McKerrow & Doenhoff, 1988; Stirewalt, 1974). Os microvilos são formados e eliminados da superfície dos esquistossômulos entre 20 e 90 minutos após a penetração na pele, e têm a função de aumentar a área da superfície da membrana plasmática, possibilitando maior absorção ou secreção de material (Hockley & McLaren, 1973; McLaren, 1980).

Poucas dessas mudanças estão associadas à alteração na expressão gênica, exceto para um aparente aumento na síntese protéica. Nas primeiras 24 horas, a regulação da proteína de choque térmico 70 (HSP = Heat Shock Protein 70) parece responder apropriadamente ao choque térmico, advindo do aumento diferencial entre a temperatura da água e a temperatura corporal do hospedeiro. Picos nos níveis de mRNA de HSP 70 estão presentes no novo esquistossômulo transformado. Porém, cercárias e esquistossômulos transformados falham ao produzir muitas proteínas, apesar da disponibilidade de mRNAs correspondentes. Isso sugere que ocorra um bloqueio pós-transcripcional à tradução nesses estágios larvais, que é revertido posteriormente, possibilitando a expressão dos mRNAs disponíveis (Blanton & Licate, 1992).

Do ponto de vista morfológico, esquistossômulos recuperados 24 horas após a infecção apresentam poucas alterações, ao passo que, 48 horas após, se inicia o processo de alongamento e começa a ocorrer regressão dos espinhos tegumentares na parte central do seu corpo, os quais ficam menores e mais dispersos, mantendo-se, contudo, nas extremidades anterior e posterior (Crabtree & Wilson, 1980). Em torno de 72 horas após a infecção, a região central do corpo torna-se quase totalmente despida de espinhos, o tegumento fica repleto de pequenas covas ou reentrâncias e, quando contraído, apresenta a parte central corrugada (Crabtree & Wilson, 1980). Após 40 horas de infecção, as glândulas acetabulares e seus ductos, previamente identificáveis no órgão anterior, desaparecem, o que caracteriza a completa transformação das cercárias em esquistossômulos. A ausência integral dessas glândulas e de seus ductos após esse período implica a manutenção mecânica da migração ou sua manutenção por uma fonte alternativa de secreção lítica. Desse modo, as proeminentes espículas da cabeça possivelmente sejam úteis no friccionamento da membrana basal, embora numerosos grânulos osmiofílicos ainda estejam presentes na glândula da cabeça. Ocasionalmente, tais grânulos são observados entre as células basais da epiderme rompida. Entretanto, não há evidências de que essas secreções causem alguma modificação morfológica das fibras de colágeno da derme e dos fibroblastos localizados logo abaixo dos parasitos. Portanto, embora na penetração as secreções da glândula da cabeça passem para dentro do tegumento na região anterior, seu significado funcional ainda é incerto. Tais secreções possivelmente estão envolvidas no reparo e na reorganização do tegumento anterior, que é danificado durante a penetração, ou na modificação das membranas, que ocorre durante a transformação de cercária em esquistossômulo (Crabtree & Wilson, 1985).

A membrana plasmática heptalaminada tegumentar absorve uma variedade de proteínas do hospedeiro, mascarando o estado de estranheza dos esquistossomos perante o reconhecimento imunológico. Essas proteínas incluem antígenos eritrocíticos (glicolipídeos na forma de antígenos de grupos sanguíneos A, B, H e Lewis) (Goldring et al., 1976), imunoglobulinas (Kemp et al., 1976, 1977; Torpier, Capron & Ouaissi, 1979; Yong & Das, 1983), antígenos principais de histocompatibilidade da classe I (MHC – classe I) (Clegg, Smithers & Terry, 1971; Silva et al., 2003) e β(2)microglobulina (β m) (Torpier, Capron & Ouaissi, 1979), α 22-macroglobulina (Damian, Greene & Hubbard, 1973; Kemp et al., 1976), fator de decaimento de C3 (Horta, Ramalho-Pinto & Fátima, 1991), componentes do complemento (Santoro et al., 1980; Tarleton & Kemp, 1981) e moléculas Fc (Loukas et al., 2001).

A saída dos esquistossômulos da derme pode ocorrer pelo sistema venoso (vênulas), mais raramente por capilares venosos dilatados ou por linfáticos ou por ambos os sistemas vasculares (Abboud, Hanna & Ragab, 1971; Miller & Wilson, 1978; Pinto & Almeida, 1945; Standen, 1953, 1971; Stirewalt, 1959). O sistema venoso funciona como a principal rota de evasão dos esquistossômulos da pele para os pulmões e somente uma pequena proporção deles usa a via linfática (Miller & Wilson, 1978; Wheater & Wilson, 1979). Estímulos mecânicos ou líticos, provavelmente provenientes da glândula da cabeça – que ainda persiste nessa fase – possuem um importante papel na saída da pele. A musculatura apical possivelmente está envolvida no acesso à luz desses vasos. A parede das vênulas e a membrana basal da epiderme são importantes barreiras contra a migração do parasito (Wilson & Lawson, 1980). Bioquimicamente, tais membranas são ricas em colágeno IV, laminina, entactina/nidogênio e perlecan (Haake & Holbrook, 1999; Storm & Elder, 2006).

 

Invasão vascular: sítios preferenciais e possíveis

mecanismos

Os mecanismos pelos quais os esquistossômulos localizam os vasos sanguíneos da pele ainda não foram totalmente elucidados (Wilson, 1987; Wilson & Lawson, 1980). A existência de um gradiente de concentração de glicose, entre os tecidos dérmicos e os capilares sanguíneos, possivelmente influencia a orientação dos esquistossômulos (Grabe & Haas, 2004), que, com 72 horas de infecção, já podem ser observados adjacentes às vênulas ou bem próximos a elas (Crabtree & Wilson, 1985). O tecido adiposo subcutâneo, por exemplo, possui concentração média de glicose de 2,5 mM, enquanto o plasma venoso possui média de 4,7 mM (Tiessen, Rhemrev-Boom & Korf, 2002). A concentração de glicose nos tecidos dérmicos, no entanto, varia, a depender de diversos fatores, mas parece existir um gradiente de concentração entre a mistura de tecidos encontrada pelos esquistossômulos migrantes (células com concentração muito baixa de glicose e fluido intersticial com concentração mais alta) e os capilares sanguíneos (Tirone & Brunicardi, 2001; Zierler, 1999). A quimiorientação dos esquistossômulos em gradientes de glicose, portanto, é muito sensível e específica (Grabe & Haas, 2004), possuindo provavelmente um importante papel adaptativo para evitar a invasão de arteríolas, que portam concentrações maiores de glicose do que as vênulas (cerca de 3%-4% maior), e estimular a entrada em vasos venosos do tecido conjuntivo, cuja concentração de glicose é grosseiramente equivalente à do plasma (Tiessen, Rhemrev-Boom & Korf, 2002). Além disso, peptídeos contendo arginina, como a bradicinina e a fibronectina, também podem contribuir para a localização de vasos sanguíneos (Duncan et al., 2000; Pertilla, Sano & Peltola, 1990; Scicli et al., 1982).

Tal quimiorientação em gradientes de glicose, portanto, direcionaria os esquistossômulos para os vasos sanguíneos, já que o sangue rico em glicose (4-5 mM) pode gerar gradientes de concentração nos tecidos circundantes aos vasos. Da mesma forma, os gradientes de L-arginina podem também possuir um papel importante na localização dos vasos, já que a concentração de L-arginina aumenta de 13 μM, na superfície da pele (Haas et al., 2002), para 40-140 μM, no sangue, ou 100-1.000 μM, nas células endoteliais (Harrison, 1997). Os esquistossômulos poderiam, então, se orientar particularmente para as vênulas, pois o sangue venoso possui um maior conteúdo de arginina do que o sangue arterial (Kowalski, Wu & Watford, 1997).

Nessas regiões onde os esquistossômulos penetram nos vasos sanguíneos, os tecidos conjuntivos da derme e da hipoderme se mostram extremamente hemorrágicos. O infiltrado inflamatório na derme apresentase organizado em discretos focos, embora não haja evidências de danos nos esquistossômulos pela resposta leucocitária do hospedeiro nesse estágio. A área apical lisa desses vermes apresenta configuração bastante variada: protuberâncias geralmente invertidas em esquistossômulos da derme e da epiderme podem ocasionalmente ficar direcionadas para a parede endotelial das vênulas. Alguns esquistossômulos desencadeiam reações de coagulação, podendo ser parcialmente rodeados por fibrina e plaquetas em diferentes estágios de desgranulação sem necessariamente ocorrerem modificações na membrana basal das vênulas, ou podem causar a completa ruptura da parede endotelial, mobilizando uma série de plaquetas, que se emaranham por entre a fibrina e fragmentos tumefeitos do endotélio. Numerosos grânulos osmiofílicos pequenos, provavelmente da glândula da cabeça, estão presentes nos canais citoplasmáticos que se estendem na área apical anterior. Contudo, somente poucos desses grânulos podem ser realmente observados no tegumento dessa região (Crabtree & Wilson, 1985).

Já com 96 horas de penetração, a distribuição dos esquistossômulos e a aparência da derme e da hipoderme continuam essencialmente similares ao período anterior. Diversos focos inflamatórios, com um espaço central vazio, podem, no entanto, ser observados na derme e na hipoderme. Esses focos, por sua vez, não exibem correlação espacial com os poucos esquistossômulos restantes. A derme ainda se mostra extremamente hemorrágica nesse estágio. Pelo período de 120 horas, os poucos esquistossômulos ainda dentro da pele ficam largamente distribuídos na derme e na hipoderme. A pele encontra-se muito menos hemorrágica e a atividade fibroblástica dentro dos focos inflamatórios indica a ocorrência de cicatrização. Diversas células plasmáticas e monócitos ficam evidentes no tecido conjuntivo da derme e da hipoderme (Wheater & Wilson, 1979).

Ao fim da fase de migração pela pele, não há evidências de destruição dos esquistossômulos por alguma resposta inflamatória tecidual do hospedeiro, mesmo que esta esteja evidente. Tal resposta inflamatória pode ser provocada por algum dano lítico tecidual produzido durante a penetração ou por alguma hemorragia causada pela entrada dos vermes nos vasos sanguíneos. A resposta inflamatória na pele do hospedeiro poderia, portanto, facilitar a migração subseqüente dos esquistossômulos em direção aos vasos sanguíneos (Miller & Wilson, 1978). Em bolsa de hamsters cronicamente infectados (Crabtree & Wilson, 1984) observaram infiltrado predominantemente macrofágico e neutrofílico, próximo aos esquistossômulos, nas primeiras 48 horas após a infecção. Às 78 horas, eosinófilos predominaram sobre neutrófilos. Às vezes, material elétron-denso era visto entre os eosinófilos aderentes e a superfície tegumentar dos esquistossômulos. A resposta cutânea inflamatória a infecções secundárias parece decorrer da combinação de reação não específica a danos mecânicos provocados pelos parasitos invasores e reação secundária imunologicamente mediada (Bentley, Carlisle & Phillips, 1981).

 

Migração pelos linfonodos A via linfática de saída dos esquistossômulos da derme constitui uma rota alternativa de evasão, utilizada por aproximadamente 1,25%-15% dos esquistossômulos, em murinos (Gui et al., 1995; Riengrojpitak, Anderson & Wilson, 1998; Wilson, Coulson & Dixon, 1986), e por menos de 1%, em babuínos (Papio anubis) (Pearce & McLaren, 1986). Trabalhos utilizando bolsas de hamsters sugerem que a via linfática tem importância secundária na evasão dos esquistossômulos da pele (Miller & Wilson, 1978). A menor importância dos vasos linfáticos na evasão das larvas a partir da pele pode ser determinada pelo número menor desse tipo de vasos quando comparado com o grande número de vasos sanguíneos presentes na derme. Assim, a localização de um vaso sanguíneo seria, por si só, favorecida pela sua ampla distribuição anatômica. Além disso, a vasodilatação ocasionada a partir de uma reação inflamatória persistente na derme – observada geralmente a partir de 24 horas após a infecção – também aumentaria a probabilidade de penetração em vasos sanguíneos (Wheater & Wilson, 1979).

Os esquistossômulos atingem os linfonodos regionais da pele a partir do segundo dia de infecção, ali permanecendo pelos próximos cinco ou seis dias, não sendo mais identificados no 11 o dia (Gui et al., 1995; Lozzi et al., 1996; Wheater & Wilson, 1979). Um acúmulo significativo de esquistossômulos ocorre em linfonodos axilares de camundongos, infectados pela pele abdominal, entre os dias três e seis, com pico no quarto dia (Georgi, Wade & Dean, 1987). Os esquistossômulos, através de linfáticos aferentes, são lançados nos seios marginais subcapsulares e, para atingirem os seios medulares e vasos hilares eferentes, ultrapassam uma malha de trabéculas ao nível da cortical (Miller & Wilson, 1978; Wheater & Wilson, 1979). Sua chegada nos seios marginais e no parênquima dos linfonodos não resulta em qualquer redistribuição perceptível de células apresentadoras de antígeno ou em agregação celular em volta das larvas retidas (Riengrojpitak; Anderson & Wilson, 1998). Esquistossômulos podem, eventualmente, penetrar no sistema vascular sanguíneo através de veias dos cordões medulares (Faust, Jones & Hoffman, 1934; Koppisch, 1937; Lozzi et al., 1996). O peso dos linfonodos aumenta durante os primeiros seis dias de infecção (Gui et al., 1995).

Em observações ultra-estruturais realizadas em experimentos com cercárias atenuadas pela exposição a 200 Gy de irradição gama, a chegada dos esquistossômulos em linfonodos ocorre também via vasos linfáticos aferentes. Os esquistossômulos, inicialmente, se localizam nos seios subcapsulares a partir do quinto dia pós-exposição. Depois, migram em direção às áreas paracorticais (linfócitos T) e, finalmente, à região medular. As larvas localizadas nas regiões periféricas dos linfonodos estão intimamente associadas com uma mistura de linfócitos e células acessórias, como células dendríticas e macrófagos com capacidade de apresentar antígenos. Tais células exibem vesículas endossomais em seu citoplasma, algumas contendo restos celulares ingeridos. Parasitos localizados mais profundamente no paracórtex do linfonodo, por sua vez, são encontrados na proximidade de linfócitos. No entanto, ao contrário da região periférica, tais parasitos parecem exercer um efeito destrutivo nas células circundandes, provavelmente devido ao seu tamanho e forte musculatura. A região adjacente à superfície dos parasitos se encontra envolta por células deformadas e rompidas, e detritos celulares vesiculares estão dispersos no espaço intersticial. Em nenhum momento foi evidenciada lesão interna ou tegumentar nos esquistossômulos atenuados (Riengrojpitak, Anderson & Wilson, 1998).

 

Migração pelos pulmões

Após acessarem o sistema circulatório, seja venoso ou linfático, os esquistossômulos são carregados pelo fluxo sanguíneo venoso para o lado direito do coração, sendo então distribuídos, assincronicamente, para os pulmões, via artéria pulmonar. O número de esquistossômulos dentro dos capilares pulmonares aumenta significativamente entre o segundo e o sétimo dias após a infecção, o que gera diminutas hemorragias (Pinto & Almeida, 1948). O pico de permanência dos parasitos varia de acordo com o modelo experimental utilizado: no quinto dia após a infecção, em hamsters e ratos; no sexto dia, em camundongos. Daí em diante, o número de esquistossômulos nos pulmões começa a declinar de modo quase exponencial, até o 18° dia em ratos, até o 20° dia em hamsters e até o 22° dia em camundongos, quando não são mais recuperados esquistossômulos no pulmão (Miller & Wilson, 1980; Wheater & Wilson, 1979). O pico de esquistossômulos pulmonares variou com o inóculo cercariano, sendo mais precoce (no quinto dia) com 440 cercárias (60,2% de recuperação) e, entre o sétimo e o oitavo dias, com 65 cercárias (58,2% de recuperação) (Barbosa et al., 1978).

No modelo camundongo, esquistossômulos, ainda que em menor número, podem ser recuperados após períodos mais longos de infecção, como 67 e 46 dias, em infecções com 65 e 440 cercárias, respectivamente (Barbosa et al., 1978). A longa permanência de esquistossômulos em pulmões foi também referida por outros autores (Clegg, 1965; Faust, Jones & Hoffman, 1934; Olveda, Olds & Mahmaoud, 1981; Wilks, 1967; Yolles, Moore & Meleney, 1949). No babuíno (Papio anubis), a fase pulmonar é mais rápida que no camundongo e, no 12° dia, poucos parasitos ainda permanecem nos pulmões. Isso demonstra que os pulmões daquele primata dificultam menos a migração de esquistossômulos que os pulmões de camundongo (Wilson et al., 1990). O aumento do número de esquistossômulos, em camundongos, dentro dos capilares pulmonares, entre os dias dois e sete após a infecção, indica a efetividade da vasculatura pulmonar como barreira física para a migração. Ali, os esquistossômulos, para poderem lidar com o diminuto calibre dos capilares, alongam o corpo consideravelmente, embora uma pequena percentagem deles possa evitar a rede capilar pulmonar utilizando anastomoses arteriovenosas (Wheater & Wilson, 1979).

Nos capilares pulmonares, os esquistossômulos perdem a camada intersticial fibrosa subtegumentar e parte da musculatura anterior, por desintegração e desaparecimento. O tegumento continua crivado de pequenas covas ou reentrâncias e, dependendo do grau de extensão corporal, exibe pregas e sulcos. Quando o corpo se encontra completamente distendido, isto é, quando atinge o menor diâmetro, os sulcos ou depressões ficam menos proeminentes, aparecendo como constrições anelares. Pelo quarto dia pós-infecção, a porção média do corpo se apresenta virtualmente sem espinhos (Crabtree & Wilson, 1980). Os esquistossômulos da pele, no terceiro dia, medem 170 μm de maior comprimento, com a média do raio (no comprimento máximo) de 10 4 μ m, volume de 5,31 x 10

μm3 4 2 e área da superfície do cilindro de 1,0682 x 10 μ m, enquanto os esquistossômulos pulmonares, no oitavo dia de infecção, atingem 400 μm de comprimento máximo, com raio de 6,5 μm (no comprimento máximo), volume de 5,31 x 104 3 μ m e área da superfície de 1,6328 x 104 2 μ m (Crabtree & Wilson, 1980; Wilson et al., 1978). Portanto, mesmo em um estado metabólico semiquiescente (Cousin, Stirewalt & Dorsey, 1986), os esquistossômulos pulmonares chegam a ultrapassar, em até quatro vezes, o comprimento dos esquistossômulos da pele, e o seu diâmetro pode chegar a apenas oito μm, que equivale, aproximadamente, ao tamanho dos menores capilares pulmonares, pelos quais devem rastejar para atravessá-los (Basch & Samuelson, 1990). Dessa forma, o alongamento corporal facilita uma rápida migração através dos capilares sanguíneos (Crabtree & Wilson, 1985; Wilson et al., 1978). A passagem dos esquistossômulos pelos pulmões é, portanto, delongada temporariamente, até que atinjam as dimensões apropriadas para a migração intravascular (Crabtree & Wilson, 1985).

Durante a fase intrapulmonar, há também uma íntima aposição entre o endotélio e as membranas tegumentares do parasito, o que possibilita a transferência, a partir do endotélio, para a superfície dos esquistossômulos, de antígenos da Classe I do Complexo Principal da Histocompatibilidade, não originados de tecido hematopoético (Crabtree & Wilson, 1985; Sher et al., 1984). Em estudo ultra-estrutural em pulmões de camundongos com sete dias de infecção, os organismos intravasculares apresentavam um diâmetro médio transversal de 20 μm. Os esquistossômulos se encontravam livres dentro da luz vascular, circundados por plasma e células sanguíneas circulantes. O revestimento endotelial adjacente estava intacto, apresentando, às vezes, reentrâncias provocadas pela pressão de espinhos tegumentares de esquistossômulos adjacentes (Bruce et al., 1974). A densidade de esquistossômulos no pulmão declina a partir do sétimo dia e a relativa escassez de esquistossômulos dentro de vasos pulmonares maiores provavelmente reflete a sua rápida migração desses vasos (Wheater & Wilson, 1979). A migração através da circulação pulmonar ocorre na ausência de resposta perceptível por parte do hospedeiro (Wheater & Wilson, 1979). É geralmente admitido que, enquanto nos pulmões, esquistossômulos não se alimentam de sangue. Porém, uma percentagem variável de 4% a 20% de esquistossômulos exibiu, entre sete e dez dias de infecção, digestão de sangue, e houve dois esquistossômulos que chegaram até a atingir o quarto estágio de desenvolvimento (= parte posterior do ceco reconectada, sem ultrapassar o comprimento do ceco bifurcado) (Barbosa et al., 1978). Esse fenômeno foi também evidenciado em pequeno número de esquistossômulos pulmonares, entre os dias oito e 14 da infecção, baseado na detecção de grânulos marrons pálidos, amarelados ou escuros, correspondendo, aparentemente, a pigmentos derivados de hemoglobina (Bruce et al., 1974). Eventualmente, fêmeas maduras escapam da circulação mesentérica e se alojam em vasos pulmonares, tendo um destino

incerto (Figura 4).

Figura 4 – Fêmea(s) adulta(s) de Schistosoma mansoni no interior

de vaso pulmonar de camundongo Swiss Webster, sem estar

circundada(s) por reação inflamatória, exibindo pigmento

esquistossomótico no lúmen intestinal (Hematoxilia-Eosina)

 

Vias de migração dos pulmões para o sistema

porta-hepático

O desenvolvimento dos esquistossômulos completa-se nos vasos intra-hepáticos, onde se acumulam lentamente, havendo um evidente assincronismo no desenvolvimento dos vários exemplares, podendo ser encontrados vermes jovens ao lado de espécimes adultos, durante vários dias, entre o quarto e o 23o dias (Coelho, 1970; Faust, Jones & Hoffman, 1934). O acúmulo de parasitos no fígado segue um padrão sigmóide no camundongo, atingindo um platô ao redor do 20° dia de infecção, momento em que 37% dos parasitos que atingem a maturidade ali aportam (Miller & Wilson, 1980).

O trajeto que os esquistossômulos seguem do pulmão até as veias do sistema porta-hepático tem sido motivo de longas controvérsias. Três vias (ou modelos de migração) pulmão-fígado foram postuladas:

intravascular direta, sem recirculação (modelo vascular passivo) (Miyagawa, 1912; Miyagawa & Takemoto, 1921). Os esquistossômulos, após saírem dos capilares arteriais e atingirem o compartimento venoso do pulmão, seriam transportados passivamente através do coração para a aorta, e daí para o sistema porta-hepático através das artérias hepáticas ou mesentéricas. Alguns autores propuseram uma variante para esta hipótese, rotulada por nós de intravascular direta, com recirculação (Faust, Jones & Hoffman, 1934; Miller & Wilson, 1980; Wilson, Coulson & Dixon, 1986; Wheater & Wilson, 1979), largamente aceita e bem documentada pela literatura. Segundo esses autores, antes de os esquistossômulos entrarem, ao acaso, em artérias que derivam no sistema porta-hepático, eles transitariam através da circulação pulmonar-sistêmica. Essa concepção implica também que os esquistossômulos sejam seqüestrados dentro do sistema porta-hepático ao perderem a habilidade para ultrapassar o leito capilar, no caso, os sinusóides hepáticos (Miller & Wilson, 1980). Essa via será mais detalhada posteriormente;

intravascular reversa (modelo vascular ativo) (Kruger et al., 1969). Essa hipótese propõe que, após os esquistossômulos atingirem os pulmões, eles mudariam de direção e migrariam, contra a corrente sanguínea, através da artéria pulmonar, ventrículo e átrio direitos, veia cava posterior e penetrariam no fígado pelas veias hepáticas;

transdiafragmática (modelo transdiafragmático) (Bruce et al., 1974; Narabayashi, 1914; Pereira et al., 1972; Wilks, 1967). Através dessa via, os esquistossômulos escapariam dos capilares pulmonares para os alvéolos, migrariam, através do tecido pulmonar, para caírem na cavidade

pleural e atravessariam o diafragma e a cápsula hepática, atingindo, eventualmente, os vasos portais intra-hepáticos.

Parece que todas as vias (ou modelos) podem, na prática, ser utilizadas pelo parasito, embora a via intravascular direta ou passiva, com recirculação, seja a preferencial e a melhor comprovada (Georgi, Wade & Dean, 1987; Miller & Wilson, 1980; Wheater & Wilson, 1979; Wilson, Coulson & Dixon, 1986). Estudos histológicos favorecem inteiramente a migração intravascular (Wheater & Wilson, 1979). A saída dos parasitos do pulmão através do sistema venoso pulmonar tem sido demonstrada por vários estudos com camundongos e coelhos (Faust, Jones & Hoffman, 1934; Faust & Meleney, 1924; Koppisch, 1937; Miyagawa & Takemoto, 1921; Tang, Tang & Tang, 1973; Yolles, Moore & Meleney, 1949). Pelas veias pulmonares, os vermes são arrastados até as câmaras esquerdas cardíacas e daí são bombeados para a aorta. Da aorta podem ingressar no sistema hepático portal por duas vias principais: a artéria hepática (ramo do tronco celíaco, juntamente com a esplênica e a gástrica esquerda), as artérias mesentéricas (superior e inferior) e outras artérias que suprem o trato gastrointestinal (Wheater & Wilson, 1979). Em ratos em repouso, até 3% do rendimento cardíaco são direcionados para a artéria hepática e 13%, para artérias do intestino (Blahitka & Rakusan, 1977). Portanto, um verme individual tem até 16% de chance de atingir o sistema portal hepático após sair do ventrículo esquerdo. Como corolário, tem 84% ou mais de chance de ser distribuído no restante da circulação sistêmica. Tal esquistossômulo, portanto, deve realizar vários circuitos nas circulações pulmonar e sistêmica antes de conseguir, aleatoriamente, ingressar nos vasos que o levarão para o sistema portal hepático. Esse esquema de migração supõe que os esquistossômulos sejam capazes de migrar através do leito capilar sistêmico para retornar à circulação venosa, pulmões e lado esquerdo do coração para posterior redistribuição. Ele também presume que os tratos portais do fígado atuem como barreira para subseqüente distribuição dos vermes (Wheater & Wilson, 1979). A ocorrência de uma fase de migração sistêmica explica a pobre correlação temporal observada entre o declínio no número de esquistossômulos presentes nos pulmões e a chegada de esquistossômulos no fígado (Wheater & Wilson, 1979; Yolles, Moore & Meleney, 1949). De fato, o acúmulo de esquistossômulos nos rins, cérebro, músculo cardíaco, capilares do diafragma, aparelho geniturinário e carcaça, em geral, durante o período do pico migratório entre os pulmões e o sistema porta-hepático, com subseqüente decréscimo no número de parasitos nesses órgãos, reforça a idéia de que os esquistossômulos recirculam em vasos sistêmicos e pulmonares (Georgi, Wade & Dean, 1987; Wheater & Wilson, 1979). A detecção de lesões ectópicas em esquistossomose humana é uma evidência indireta da ocorrência da fase sistêmica da migração (Faust, 1948; Kane & Most, 1948). É possível que esquistossômulos fiquem seqüestrados em algum ponto da circulação e falhem em retornar para os pulmões para serem redistribuídos (Wheater & Wilson, 1979). É importante destacar que esquistossômulos, a partir do 10o dia de infecção, foram observados dentro de vênulas mesentéricas (Wheater & Wilson, 1979).

Foi estimado o tempo de trânsito que os esquistossômulos dispendem nos diversos circuitos circulatórios após deixarem o ventrículo esquerdo: capilares intestinais (t = 6,5h); carcaça, rins, 1/2

cérebro, órgão menores (t = 16h); pulmões (t = 30-35h) (Wilson, 1/2 1/2 Coulson & Dixon, 1986). Após a penetração cutânea, cada esquistossômulo tem a probabilidade (P) de 0,33 de amadurecer no sistema porta-hepático de um camundongo normal. Se a probabilidade (P) de ingressar em uma artéria esplâncnica é de 0,32 e de ser retido no fígado é de 0,72-0,86, então a probabilidade (P) de um parasito tornar-se parte da população hepática em cada circuito da vasculatura é de 0,23-0,27 (Wilson & Coulson, 1986). Baseado nisso, somente duas ou no máximo três passagens de esquistossômulos ao redor da circulação pulmonar-sistêmica são suficientes para gerar a população de vermes adultos (Wilson, Coulson & Dixon, 1986). Considerando um tempo de trânsito de 35h + 16h (Wilson & Coulson, 1986), três passagens ou ciclos levariam de seis a sete dias para serem efetivados (Wilson, Coulson & Dixon, 1986).

Como explicar a parada dos esquistossômulos nos vasos portais? Os altos níveis de nutrientes nesses vasos e estreiteza dos sinusóides hepáticos podem, ambos, contribuir para esse evento (Khammo et al., 2002; Wilson et al., 1978). Através de microscopia in vivo, foi constatado que todos os esquistossômulos hepáticos tinham pigmento em seu ceco e alojavam-se em vênulas interlobulares portais, cujos diâmetros mediam 40-175 μm (os vasos com 40 μm estavam a 30-50 μm distantes do bordo hepático). Nesses vasos, os vermes estavam ou presos à parede vascular pela ventosa ventral, ou encravados nos vasos, ou intermitentemente livres na corrente sanguínea, e nunca entravam nos sinusóides (Bloch, 1980).

Em Calomys callosus (Rodentia: Cricetidae), em cortes histológicos, foram vistos vermes juvenis em vênulas portais a partir do primeiro dia do estudo (20o o o dia). Entre o 22 e o 23 dias, os vermes juvenis passaram a agrupar-se na veia porta intra-hepática, mostrando início de acasalamento. Vermes adultos acasalados foram observados no 26o dia. Os primeiros ovos embrionados começaram a aparecer em vênulas intra-hepáticas, na submucosa do intestino delgado e grosso, no 31 o de infecção. Ovos de quarto estágio e maduros, com miracídio, foram observados pela primeira vez no 34o dia, no fígado, e no 45o dia, no intestino. No pâncreas, ovos embrionados foram vistos pela primeira vez no 32o dia, em vênulas intralobulares, e ovos maduros apareceram no 37o dia (Lenzi JA, 1998). Em camundongos o Swiss Webster , no 25 dia de infecção, surgiram, pela primeira vez, pares acasalados de vermes adultos em veias portais do hilo hepático. No 30 o dia pós-infecção, ovos imaturos foram evidenciados em vênulas intra-hepáticas. Um dia depois, ovos imaturos apareceram em vasos submucosos do intestino e, no 33 o dia, foram também detectados em vênulas pancreáticas intralobulares. Ovos maduros foram vistos pela primeira vez, em fígado, no 35o o , e em pâncreas e intestino, no 36

dia (Lenzi JA, 1998).

Por microscopia in vivo, em camundongo, foi observado que vermes isolados ou acasalados, localizados na veia porta e em vários ramos da veia mesentérica superior, moviam-se de modo ondulante contra o fluxo (migração contracorrente). Assim que os vermes adentravam nas veias e vênulas que tinham diâmetros equivalentes aos seus, eles se alongavam suficientemente para penetrar em vênulas murais do intestino, localizadas próximas à junção do mesentério (Bloch, 1980). Os vermes não parecem ficar alojados no mesmo lugar, mas vagueiam por vários sítios justaintestinais, mesmo acasalados, depositando ovos principalmente entre o 20o cm a partir do piloro e a primeira metade do intestino grosso (Pellegrino & Coelho, 1978; Valadares et al., 1981). Quando todo o ciclo de vida de S. mansoni foi realizado em condições assépticas, camundongos livres de germes infectados apresentaram muito mais ovos no fígado e no intestino, aos 61o o e 84 dias de infecção, que camundongos convencionais (Bezerra et al., 1985).

Por que os esquistossomos acabam residindo nos vasos sanguíneos do fígado? Parece que a tolerância imunológica induzida nesse sítio traz vantagens para os parasitos (Modha et al., 1998). De fato, estudos têm demonstrado que a injeção intraportal de células despedaçadas de um doador antes de um enxerto de pele prolonga significativamente a sobrevida do enxerto no recipiente (Dumont, 1978). A administração de ovos de esquistossomo em veia portal também induziu tolerância, avaliada pela reação de hipersensibilidade em pata de camundongo e na formação de granulomas. Células de Kupffer parecem estar envolvidas nesse mecanismo (Cuison et al., 1995).

A capacidade de migração de esquistossômulos em diferentes estágios de maturação foi avaliada em esquistossômulos recuperados da pele (larvas de uma hora de idade), de pulmões (cinco dias) e do fígado (11 dias) de hamsters experimentalmente infectados com cepa LE de S. mansoni, proveniente de Belo Horizonte, Minas Gerais. Os esquistossômulos foram injetados intraperitonealmente em camundongos, com número variando de 120 (pele), 200 (pulmões) a até 300 (fígado) organismos por animal. Os animais foram sacrificados quando as larvas derivadas de hamsters atingiram 35 dias. As percentagens de larvas encontradas vivas dentro do sistema porta-hepático dos camundongos foram de 43,1 (pele), 32,5 (pulmões) e 15,4 (fígado), indicando que a capacidade migratória de esquistossômulos decresce com a idade das larvas (Coelho et al., 1976a). Outro estudo, confirmando os dados anteriores, utilizou camundongos albinos inoculados pela via subcutânea ou intraperitoneal com esquistossômulos retirados dos pulmões (quatro dias após a exposição cercariana) ou do fígado (dez e 20 dias) e avaliou a capacidade de migração das larvas no período de dois a três meses após a inoculação. A migração ocorreu com larvas de quatro e de dez dias, em ambas as vias de inoculação. Com larvas de 20 dias, somente um animal em dez apresentou vermes adultos no sistema porta (apenas um par de vermes) quando a inoculação ocorreu por via subcutânea, não sendo identificado nenhum verme naqueles inoculados por via intraperitoneal (Pereira et al., 1972). Em hamsters infectados intraperitonealmente com 40, 80 e 160 cercárias (cepa LE) foi observado que o comprimento das fêmeas diminui significativamente (p<0,05) em função da densidade populacional dos parasitos (Coelho et al., 1976b).

O percentual de recuperação total de vermes adultos em C. callosus, em dois experimentos, variou de 14,3 a 38,6% (45 dias); 15,7 a 20% (90 dias) e 4,3 a 20% (160 dias). A recuperação, em Swiss Webster, variou de 24,3 a 73,8% (45 dias); 11,4 a 24,3% (90 dias) e 8,6 a 27,1% (160 dias) (Lenzi JA, 1998). O percentual de recuperação variou, conforme outros autores e outros modelos: em camundongo, 63,4% (infecção com 65 cercárias – 53 dias de infecção) e 49,7 % (com 440 cercárias – 42 dias de infecção) (Barbosa et al., 1978), 20% (Brenner, 1962; Clegg, 1965; Standen, 1949), 22,3% (Pellegrino & Katz, 1969), 28,3 a 39,9% (Saoud, 1966), 34,3% (Grimaldo & Kershaw, 1961), 24,4 a 48,2% (Smithers & Terry, 1965) e 36,9 a 39,5% (Warren & Peters, 1967); em Nectomys squamipes, 10% (Rodrigues-Silva, 1989), 65,5% (Antunes, 1971) e 21,5% (Borda, 1972). A proporção macho para fêmea apresentou um declínio, no transcurso da infecção, em ambos os grupos de animais, indo, em C. callosus, de 2,3:1 (45 dias), para 1,3:1 (90 dias) e 1:1 (160 dias). Em Swiss Webster, variou de 1,8:1 (45 dias), para 1,7:1 (90 dias) e 1,2:1 (160 dias) (Lenzi, 1998).

 

Sítios de atrito e de eliminação do parasito

Durante todas as fases de migração, os parasitos estão sujeitos a inúmeras influências ambientais, provenientes do seu hospedeiro. A resposta imunológica está intimamente envolvida com sua eliminação, bem como o desenvolvimento de diversas modificações patológicas que acompanham a infecção e, de alguma forma ainda não compreendida, o amadurecimento e a fecundidade dos esquistossomos. Tanto a mortalidade, quanto a reabsorção de esquistossômulos migrantes, ou ainda a possível eliminação desses para fora do organismo hospedeiro podem ser acompanhadas indiretamente pelo decréscimo exponencial do número de focos autorradiográficos nos órgãos que não o fígado (Coulson & Wilson, 1988; Dean et al., 1987; Georgi, Wade & Dean, 1987). Tal ausência de evidência direta a respeito do destino exato dos equistossômulos é conhecida como ‘atrito’ (do inglês attrition) (Georgi, Wade & Dean, 1986). Os sítios de atrito e de eliminação parecem variar, conforme o animal seja imune ou não-imune. Todavia, como os dados de literatura sobre este assunto são divergentes e, às vezes, até contraditórios (Dean et al., 1987), há que se salientar apenas os aspectos mais relevantes e mais bem comprovados.

Em animais não-imunes, 90% ou mais dos parasitos penetrantes na pele atingem, eventualmente, os pulmões (Mangold & Dean, 1983). No entanto, o fato de que o número de esquistossômulos detectados no fígado, no 21o dia de infecção, costuma ser consideravelmente menor do que o que aparece nos pulmões no 6o dia e o número que desaparece do pulmão entre os dias seis e 21, sugere que a maior parte do atrito de uma infecção inicial ocorre em algum ponto após a chegada dos parasitos ao pulmão (Dean et al., 1984). Esses dados indicam que a pele não é o sítio principal de eliminação, em camundongos primoinfectados (Dean et al., 1984; Georgi, Dean & Mangold, 1983). Um aumento da resistência inata à infecção foi parcialmente atribuído a uma maior densidade da derme em camundongos idosos (Lewert & Mandlowitz, 1963), embora alguns autores discordem da influência do estado da matriz extracelular da derme como um fator determinante do número de parasitos que se evadem da pele (Clegg & Smithers, 1968). Porém, o estado da matriz extracelular deve interferir na migração do parasito, pois tanto as cercárias como os esquistossômulos secretam, entre várias enzimas, uma serina protease capaz de fragmentar queratina, colágeno dos tipos IV e VIII, proteoglicano, fibronectina, laminina e elastina (Newport et al., 1987).

A penetração cercariana na pele pode ser alterada por outros fatores, tais como: a produção de eicosanóides pelas próprias cercárias e pela pele; os níveis de ácidos graxos na superfície da pele; a relação da produção dermo-epidérmica de eicosanóides (Fusco et al., 1988) e a distribuição e densidade de células de Langerhans na pele (Gebara et al., 1986). Em animais imunes, costuma ocorrer retardo da migração dos parasitos da pele para os pulmões, maior retenção nos pulmões e desaparecimento de larvas em algum ponto após a chegada aos pulmões e antes do aparecimento no fígado (Dean et al., 1987). Em relação à pele como sítio de atrito, os dados da literatura mostram diferenças significativas, atribuídas a condições experimentais peculiares, aos esquemas de imunização, ao hospedeiro e às cepas ou isolados de S. mansoni utilizados (ver revisão em Dean et al., 1987). Alguns autores admitem que, ao nível da pele, animais infectados apresentem duas fases distintas de atrito, uma precoce e outra tardia, sendo a primeira dependente da oviposição (Smithers & Gammage, 1980). De qualquer forma, a pele é uma barreira à migração subseqüente: o parasito necessita ‘negociar’ a sua passagem. Para o hospedeiro, contudo, a pele é a primeira oportunidade para o reconhecimento do invasor pelo sistema imunológico (Mountford & Trottein, 2004). Discute-se ainda a possibilidade de eliminação de esquistossômulos vivos através da árvore traqueobronqueal e do aparelho gastrointestinal, e, mais raramente, dos glomérulos e túbulos renais (Bruce et al., 1974; Coulson & Wilson, 1988; Dean et al., 1987; Georgi, Wade & Dean, 1987).

No entanto, a passagem de ovos para a luz intestinal é fornecida por produtos de eosinófilos e/ou macrófagos periovulares que destroem as fibras da matriz extracelular e corroem a membrana basal do epitélio, criando túneis ou passagens, na mucosa, que permitem a ejeção passiva dos ovos pelos movimentos intestinais peristálticos (Lenzi, Lenzi & Sobral, 1987). Camundongos infectados por S. mansoni, com imunidade comprometida (exemplo: depletados de células CD4+), falham ao eliminar ovos para as fezes (Fallon et al., 2000), bem como pacientes HIV+, com baixos níveis de células CD4 circulantes, apresentam diminuição na excreção de ovos nas fezes (Karanja et al., 1997). A formação de canais colaterais porto-sistêmicos extrahepáticos ou o aumento no diâmetro de conexões porto-sistêmicas intra-hepáticas decorrentes da infecção (McHugh, Coulson & Wilson, 1987) podem explicar o encontro freqüente de vermes acasalados em vasos pulmonares em animais com três, quatro e cinco meses de infecção (Awadalla, Sheikh & Farag, 1978).

 

Fase hepática

A chegada dos esquistossômulos no sistema porta-hepático intestinal dá início a mais uma série de eventos decisivos para o desenvolvimento completo dos vermes e, conseqüentemente, para o sucesso reprodutivo da espécie. Uma dramática redução no comprimento máximo dos esquistossômulos – de modo que as suas dimensões não sejam significativamente diferentes daquelas dos esquistossômulos na pele (Wilson et al., 1978) –, bem como a comparativa estreiteza dos sinusóides hepáticos, é determinante para a sua retenção gradual nos ramos venosos mais delgados (Miller & Wilson, 1980), entre o 7o o e o 20 dias após a infecção em camundongo (Wheater & Wilson, 1979). Nesse momento, diversos vermes jovens são encontrados ao lado de espécimes adultos (Coelho, 1970; Faust, Jones & Hoffman, 1934; Khammo et al., 2002). No camundongo, o acúmulo de parasitos no fígado segue um padrão sigmóide, como já visto na seção ‘Vias de Migração dos Pulmões para o Sistema Porta-Hepático’. Nesse órgão, o crescimento dos vermes é disparado por um mecanismo ainda desconhecido, possivelmente devido a altos níveis de nutrientes no sangue porta-hepático (Khammo et al., 2002; Wilson et al., 1978). Vários conjuntos de dados sugerem que essa aceleração do crescimento se inicia nos esquistossômulos mais avançados, entre os dias 10 e 11 de infecção (Lawson & Wilson, 1980). De fato, o fígado, modernamente, é considerado um órgão com um rico componente neuroendócrino, além de imunotolerante, compondo um ambiente epigenético peculiar para os parasitos (Bowen et al., 2004; Macky, 2002; Roskams et al., 2004).

O desenvolvimento dos esquistossômulos completa-se nos vasos intra-hepáticos do sistema porta. Já com 168 horas, alguns exemplares jovens apresentam sangue ingerido, bem como aumento de seu volume corporal (Pinto & Almeida, 1948). Os vermes se alimentam encarando a direção do fluxo sangüíneo (Bloch, 1980). Novos espinhos e papilas sensoriais são formados, enquanto a abertura da boca se desenvolve com a formação da ventosa oral (Crabtree & Wilson, 1980). Por sua vez, a presença dos parasitos nas vênulas interfere no fluxo sanguíneo, não apenas nos vasos ocupados, mas também nos sinusóides adjacentes. Os vasos se dilatam, apresentando marginação leucocitária, deposição de pigmentos sanguíneos nas células de Kupffer e estase, o que resulta em necrose dos hepatócitos circundantes (Bloch, 1980). Na terceira semana após a infecção, os esquistossômulos migram para as veias mesentéricas, onde geralmente ocorre o acasalamento (Armstrong, 1965; Pinto & Almeida, 1948). Em babuínos, o acúmulo de parasitos no fígado ocorre pelo nono dia de infecção (Wilson et al., 1990), enquanto em camundongos, vermes acasalados nas veias mesentéricas podem ser observados a partir do 27o dia de infecção, enquanto a oviposição tem início entre o 30o o e o 34 dias. Os primeiros ovos maduros começam a surgir, no fígado e no intestino, entre o 34o o e o 36 dias (Brenner, 1956; Lenzi JA, 1998; Prata, 1957).