4.4 Participação de citocinas no determinismo de resistência ou susceptibilidade à infecção experimental por Trypanosoma cruzi

4.4 Participação de citocinas no determinismo de

resistência ou susceptibilidade à infecção

experimental por Trypanosoma cruzi

Gislâine A. Martins; Júlio C. S. Aliberti; João S. Silva

Neste capítulo discutiremos o papel de algumas citocinas e quimiocinas e de alguns dos possíveis mecanismos que influenciam no determinismo da resistência e/ou susceptibilidade em camundongos infectados por Trypanosoma cruzi. Durante a fase inicial da infecção por esse parasita, os índices parasitêmicos e a mortalidade do hospedeiro dependem intrinsecamente da cepa de T. cruzi e das características genéticas do animal infectado, incluindo os genes do sistema principal de histocompatibilidade (Wrightsman et al., 1982). Algumas cepas de parasitas são capazes de matar todos os animais infectados enquanto outras são quase avirulentas, induzindo baixa parasitemia e ausência de mortalidade. Certas linhagens de camundongos são resistentes à infecção enquanto outras são altamente suscetíveis e morrem durante ou logo após a fase aguda (Andrade et al., 1985; Silva et al., 1992).

A resposta imune protetora e/ou auto-imunidade desenvolvida durante a infecção pelo T. cruzi e o tipo de célula T auxiliar (Th) a ser expandido são certamente influenciados pelas citocinas presentes no ambiente durante o processo de diferenciação celular. Citocinas como IFN-γ, IL-4, IL-10 e IL-12, IL-13, IL-14 e IL-18 podem dirigir a diferenciação de subpopulações de células T com conseqüente ativação preferencial de linfócitos Th1 ou Th2. Estas subpopulações de células T foram definidas com base em seu padrão de secreção de citocinas (Mosmann et al., 1986), assunto recentemente revisto por Mosmann & Sad (1996). Com o desenvolvimento do padrão de resposta Th1 há um predomínio da secreção de IL-2 e IFN-γ, induzindo preferencialmente ativação de macrófagos e resposta mediada por células (Cher & Mosmann, 1987; Stout & Bottomly, 1989), enquanto o desenvolvimento de Th2 leva à síntese preferencial de IL-4, IL-5 e IL-10 favorecendo a resposta mediada por anticorpos (Coffmann et al., 1988). IFN-γ inibe a proliferação de células Th2 (Gajewski & Fitch, 1988) e IL-4 inibe a expressão de receptores de IL-2 e produção de IFN-γ (Peleman et al., 1989; Martinez et al., 1990). Por sua vez, IL-10 inibe a síntese de citocinas por Th1 (Fiorentino et al., 1989). O balanço entre estas citocinas determina o padrão de resposta celular a ser gerada, ditando as classes de anticorpos a serem produzidas e a resposta eferente a ser desenvolvida.

4.4.1 O Papel de IFN-γ

O IFN-γ é uma das citocinas mais estreitamente implicadas na resistência à infecção pelo T. cruzi e desempenha papel central em induzir a ativação de macrófagos e a inibição da replicação intracelular dos parasitas (Nogueira & Cohn, 1978; Silva et al., 1991; Gazzinelli et al., 1992), e quando administrado in vivo em camundongos aumenta a resistência à infecção, levando à diminuição de parasitemia e ao aumento da sobrevida (Reed, 1988). A importância de IFN-γ no controle da infecção por T. cruzi foi definitivamente estabelecida por experimentos nos quais a neutralização por meio de tratamento in vivo com anticorpos monoclonais (Cardillo et al., 1996) ou a deleção gênica (Martins et al., 1999) de IFN-γ aumentou drasticamente a susceptibilidade à infecção. Resultados obtidos mais recentemente em nosso laboratório demonstram que além de ser necessário para a eliminação dos parasitas, através da indução da produção de óxido nítrico (NO), o IFN-γ participa ainda da modulação da expressão das moléculas Fas e Fas-L, expressas em níveis significativamente elevados nas células esplênicas após a infecção. Em seguida, baseados em uma série de experimentos realizados com animais geneticamente deficientes de IFN-γ, sugerimos que essa citocina está indiretamente implicada no controle da resposta imune, através da indução de NO e expressão de Fas e Fas-L e, conseqüente indução de apoptose nos linfócitos dos animais na fase aguda da infecção com T. cruzi (Martins et al., 1999). Contudo, experimentos recentes mostraram que camundongos resistentes e susceptíveis secretam quantidades semelhantes de IFN-y quando infectados por T. cruzi. Esse achado sugere que outras citocinas secretadas durante a infecção poderiam inibir os efeitos de IFN-γ.

4.4.2 O Papel de TGF-β e IL-10

Citocinas que sabidamente inibem os efeitos de IFN-γ em macrófagos são TGF-β e IL-10 (Ding et al., 1990). Investigando a possibilidade dessas citocinas participarem do controle da resposta ao T. cruzi, mostramos a presença de TGF-β biologicamente ativo e de IL-10 em sobrenadantes de esplenócitos de animais infectados. A presença de tais citocinas coincidiu com o aumento da produção de IFN-γ e com o início do aparecimento de parasitemia patente nos animais. Experimentos in vitro mostraram que tanto TGF-β como IL-10 são capazes de inibir o efeito tripanocida de macrófagos ativados por IFN-γ (Silva et al., 1991, 1992). Adicionalmente, concluímos que TGF-β e IL-10 atuam in vivo durante a infecção com T. cruzi, pois o tratamento dos animais infectados com TGF-β recombinante ou com anticorpo anti IL-10 resultou em aumento e diminuição de parasitemia e mortalidade, respectivamente (Silva et al., 1991; Reed et al., 1994). Por outro lado, o tratamento com anticorpo anti IFN-γ determinou aumento da mensagem para IL-10, sugerindo que a produção de IL-10 e de IFN-γ em camundongos infectados é regulada por um mecanismo de feed-back negativo (Reed et al., 1994).

Uma série de experimentos foi realizada com o intuito de determinar a cinética de produção e o papel das citocinas sintetizadas logo após o primeiro contato dos parasitas com as células-alvos. Os resultados demonstraram que o tratamento com anticorpo anti IFN-γ foi mais eficaz em determinar o aumento de parasitemia quando realizado mais próximo do dia de infecção dos animais. O inóculo de anticorpo anti IFN-γ no 11º dia após à infecção, ou mais tarde, foi completamente ineficaz em determinar o aumento de parasitemia ou mortalidade dos animais. Isto é, neste período ainda que produzido em grande quantidade, IFN-γ já não é mais efetivo em controlar a infecção, possivelmente pela presença de TGF-β e IL-10. Com o objetivo de entender a regulação da resposta anti T. cruzi logo no início da infecção, incubamos esplenócitos normais com tripomastigotas vivos e verificamos que animais resistentes e susceptíveis produziram quantidades similares de IFN-γ. Entretanto, animais resistentes produziram quantidades significativamente menores de IL-10 que os susceptíveis. Este dado sugere que a susceptibilidade pode estar relacionada à maior produção de IL-10.

Investigamos em seguida quais células envolvidas na resposta imune inata eram responsáveis pela produção de IFN-γ. Verificamos que tripomastigotas vivos foram capazes de induzir a produção de IFN-γ tanto em células esplênicas de camundongos eutímicos como de atímicos, o que demonstrou que a produção de IFN-γ é independente de células T. Como a depleção de células NK bloqueou a produção de IFN-γ, sugerimos que estas seriam as principais responsáveis pela produção desta citocina após o estímulo inicial com T. cruzi, num período da infecção no qual ainda não há resposta imune específica. Nestes experimentos mostramos também que sobrenadantes de esplenócitos aderentes cultivados com T. cruzi foram capazes de induzir a produção de IFN-γ por esplenócitos normais, sugerindo que as células produtoras desta citocina não necessitam contato direto com o parasita, mas sim com algum fator presente no sobrenadante, o qual é produzido após a interação macrófagos-tripomastigotas (Cardillo et al., 1996).

Em seguida, mostramos que macrófagos cultivados com tripomastigotas vivos, mas não epimastigotas ou parasitas mortos, secretam IL-12, que por sua vez foi capaz de induzir a produção de IFN-γ por esplenócitos normais. Nesses ensaios, a adição de anticorpo monoclonal neutralizante anti IL-12 aos sobrenadantes bloqueou completamente a capacidade de induzir a síntese de IFN-γ. O papel da IL-12 durante o curso da infecção in vivo, foi melhor entendido quando camundongos infectados e tratados com anticorpo anti IL-12 apresentaram aumento de parasitemia e mortalidade. Estes resultados levaram-nos a sugerir que IL-12, produzida por macrófagos quando da interação com T. cruzi, participa conferindo resistência ao hospedeiro, levando a uma diminuição da parasitemia e à mortalidade durante a fase aguda da infecção por T. cruzi (Aliberti et al., 1996). De fato, o tratamento com IL-12 recombinante levou a uma diminuição da parasitemia dos animais (Hunter & Araujo, 1996).

4.4.3 A Participação das Quimiocinas

Quimiocinas são mediadores inflamatórios amplamente implicados na modulação dos fenômenos que levam ao acúmulo de populações específicas de leucócitos em processos inflamatórios agudos e crônicos em uma série de doenças. Em termos gerais, as quimiocinas podem ser liberadas por diferentes tipos celulares depois da ativação e desempenham atividade quimiotática potente tanto in vivo como in vitro. Além da grande implicação na migração dos leucócitos, as quimiocinas podem participar, ainda, de outros eventos extremamente importantes para o estabelecimento da resposta imune, como proliferação de linfócitos T e diferenciação dos padrões Th1 e Th2, entre outros. Estudando a possível participação das quimiocinas na resposta imune contra o T. cruzi, experimentos realizados em nosso laboratório demonstraram que macrófagos inflamatórios obtidos da cavidade peritoneal de camundongos produzem as β-quimiocinas JE/MCP-1, MIP-α, MIP-β e RANTES quando cultivados in vitro com tripomastigotas vivos de T. cruzi. Adicionalmente, essas quimiocinas foram diretamentes implicadas na indução da produção de NO e inibição do crescimento dos parasitas nesse sistema (Aliberti et al., 1999). Em concordância com esses resultados, Villalta et al. (1998) demonstraram que também em macrófagos humanos, a atividade tripanocida via produção de NO pode ser induzida in vitro pelas quimiocinas RANTES, MIP-α e MIP-β, sugerindo portanto que as quimiocinas devem estar amplamente implicadas na resposta imune contra o T. cruzi. Nesse contexto, cabe ressaltar que a produção dessas quimiocinas poderia estar envolvida também nos mecanismos mediadores de processos patológicos agudos e crônicos como a ocorrência de miocardite freqüentemente observada após a infecção com T. cruzi.

4.4.4 O Papel do Óxido Nítrico e TNF-α

A atividade tripanocida dos macrófagos ativados foi inicialmente atribuida à geração de peróxido de hidrogênio (Nogueira & Cohn, 1978; Reed et al., 1987). Entretanto, a quantidade de peróxido de hidrogênio liberada por macrófagos durante a infecção de camundongos susceptíveis pode ser mais alta que a observada em animais resistentes (Russo et al., 1989) e tratamentos capazes de exaurir ou eliminar os metabólitos do burst respiratório de macrófagos ativados não inibiram a atividade tripanocida destas células. Mesmo macrófagos incapazes de ativar o burst respiratório matam parasitas intracelulares com a mesma eficiência que macrófagos normais (Gazzinelli et al., 1992). Esses dados sugeriram que a atividade tripanocida de macrófagos é independente da geração de peróxido de hidrogênio. Adicionalmente, as citocinas que facilitam a replicação dos parasitas (IL-10 e TGF-β) também inibem a indução da enzima óxido nítrico sintase (NOSi). Ao contrário, IFN-γ tem atividade tripanocida e ativa a NOSi. Realmente, o bloqueio dessa enzima por inibidores específicos abole completamente a atividade tripanocida de macrófagos ativados, demonstrando que o NO efetivamente controla a replicação intracelular do T. cruzi (Vespa et al., 1994).

Resultados obtidos em nosso laboratório demonstraram que células esplênicas de camundongos na fase aguda da infecção secretam altas quantidades de NO, sendo essa produção mais rápida nos animais resistentes. Camundongos infectados e tratados com inibidores da NOSi tornam-se mais susceptíveis à infecção, apresentando maiores parasitemias e mortalidade, sugerindo que o NO também é importante para controlar a replicação dos parasitas in vivo. De fato, tripomastigotas são altamente susceptíveis à morte induzida por NO, visto que quando incubados com uma droga doadora de NO como SNAP (S-nitrosoacetil-penicilamina), mas não com seu análogo penicilamina, morrem de maneira, dose e tempo dependente. Assim, sugerimos que formas amastigotas ou tripomastigotas de T. cruzi são mortas no interior de macrófagos por um mecanismo dependente de NO (Vespa et al., 1994).

Em outros experimentos avaliamos o papel de TNF-α em induzir a produção de NO em células isoladas ou em animais infectados. Verificamos que a adição de TNF-α sobre macrófagos infectados, tratados ou não com IFN-γ não induziu qualquer atividade tripanocida, nem potenciou o efeito de IFN-γ. Contudo, a adição de anticorpo anti TNF-α às culturas de macrófagos infectados e estimulados com IFN-γ promoveu uma diminuição significante da produção de NO e um aumento da replicação dos parasitas intracelulares. Verificamos, ainda, que TNF-α é produzido por macrófagos na presença de tripomastigotas vivos e que a adição de IFN-γ exógeno potenciou essa produção em pelo menos dez vezes. Esses resultados permitiram sugerir que tripomastigotas de T. cruzi induzem liberação de TNF-α por macrófagos que, na presença de IFN-γ, atuam de maneira autócrina, promovendo a produção de NO. Desta forma, juntos IFN-γ e TNF-α desempenham importante papel no controle da quantidade de parasitas circulantes em animais infectados por T. cruzi. Além de IFN-γ e TNF-α, a produção de NO pelos macrófagos infectados com T. cruzi pode ser modulada também pelo fator ativador de plaquetas ou PAF (do inglês platelet-activating factor), como demonstrado por experimentos realizados recentemente em nosso laboratório. Os resultados desses experimentos indicam que a atividade indutora de produção de NO exercida por PAF nos macrófagos infectados in vitro também é dependente de TNF-α, ilustrando assim a importância de TNF-α na indução dos mecanismos tripanocidas. Com efeito, o tratamento de camundongos infectados com anticorpo anti TNF-α provoca aumento de parasitemia e mortalidade e conseqüente diminuição da produção de NO, confirmando os resultados obtidos in vitro (Silva et al., 1995).

4.4.5 Óxido Nítrico e Hiporresponsividade

Apesar da importância do NO como mecanismo microbicida na fase aguda da infecção experimental com T. cruzi ser patente, tem sido demonstrado que o NO também induz imunossupressão nessa fase da infecção (Abrahamsohn & Coffmann, 1995). De fato, tratamentos in vivo que levam à diminuição da produção de NO, como os tratamentos com os anticorpos monoclonais anti TNF-α ou anti IFN-γ ou com o inibidor da enzima NOSi, foram capazes de restaurar, ao menos parcialmente, a resposta proliferativa de células esplênicas de animais infectados ante a mitógenos. Ainda esses tratamentos promoveram aumento da viabilidade celular observada nestas células após cultura por 24 horas (Martins et al., 1998). O efeito imunossupressor do NO foi anteriormente demonstrado em outras infecções causadas por protozoários como T. brucei (Sternberg & McGuidan, 1992; Schleifer & Mansfield, 1993), Toxoplasma gondii (Candolfi et al., 1995), e Plasmodium vinkei (Rockett et al., 1994), ou por bactérias, como Listeria monocytogenes (Gregory et al., 1993). Nessas infecções, a resposta proliferativa pode ser parcial ou totalmente restaurada pelo tratamento in vivo ou in vitro com inibidores da NOSi.

Os mecanismos pelos quais o NO exerce função imunossupressora ainda não são claros, entretanto, foi demonstrado que o NO pode inibir a apresentação de antígenos por macrófagos regulando negativamente a expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (Sicher et al., 1994). Adicionalmente, alguns trabalhos demonstram que o NO pode alterar o funcionamento de complexos enzimáticos imprescindíveis para o metabolismo celular (Granger & Lehninger, 1982; Kilbourn et al., 1984), inibir a duplicação de DNA (Lepoivre et al., 1990) ou causar danos diretos no DNA (Nguyen et al., 1992) sugerindo que o NO não só pode inibir a replicação mas também pode induzir a morte celular. De fato, o NO tem sido identificado como indutor de apoptose em macrófagos ativados in vitro com LPS e IFN-γ (Albina et al., 1993; Sarih et al., 1993), em células tumorais (Granger & Lehninger, 1982), células das ilhotas pancreáticas (Kaneto et al., 1995), timócitos (Fehsel et al., 1995) e em clones de células T antígeno-específicas (Stefani et al., 1994), entre outros. Por outro lado, o NO também pode bloquear a indução de apoptose em determinadas circunstâncias.

Resultados obtidos em nosso laboratório têm demonstrado que em animais agudamente infectados pelo T. cruzi, um dos possíveis mecanismos pelo qual o NO poderia participar mediando imunossupressão seria através da indução de apoptose. Inicialmente demonstramos que durante a fase aguda da infecção por T. cruzi há um aumento da porcentagem de células em apoptose no baço dos animais infectados por T. cruzi. Nesses animais os maiores índices de apoptose foram encontrados justamente quando os índices parasitêmicos e de produção de NO estavam elevados. Esses primeiros achados possibilitaram a formulação da hipótese de que o NO produzido em índices elevados durante a fase aguda da infecção experimental por T. cruzi poderia participar na modulação da indução de apoptose. Tal possibilidade foi posteriormente confirmada quando experimentos in vitro demonstraram que, após 48 horas de cultivo, a porcentagem de apoptose em esplenócitos obtidos de animais agudamente infectados por T. cruzi poderia ser reduzida se fossem adicionados às culturas inibidores da enzima NOSi ou anticorpos monoclonais anti TNF-α ou anti IFN-γ. Quando os animais infectados receberam esses mesmos tratamentos in vivo, a porcentagem de apoptose nas células esplênicas foi menor que a dos controles infectados e tratados com salina ou anticorpo controle (Martins et al. 1998).

Em conjunto, os resultados apresentados (ver sumário na Figura 3.), além de demonstrarem o papel fundamental de citocinas na indução dos mecanismos efetores da morte dos parasitas, também documentam a importância desses mediadores na regulação de tais mecanismos. Nossos resultados comprovam a importância do NO como agente tripanocida e simultaneamente sugerem um mecanismo pelo qual o NO participaria na indução de imunossupressão durante a fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi. Tais achados contribuem para um melhor entendimento da relação hospedeiro-parasita na infecção por T. cruzi e podem abrir perspectivas para futuras intervenções imunoterápicas em pacientes chagásicos.