Capítulo 17 - Coleta e processamento de órgãos e tecidos para avaliação da infecção

Capítulo 17 - Coleta e processamento

de órgãos e tecidos para avaliação da

infecção

 

Andréa Pereira de Souza; Suzana Côrte-Real Faria; Claudia M. L. M. Coutinho; Maria de Nazaré C. Soeiro; Claude Pirmez

O estudo dos tecidos dos animais infectados é um campo extremamente amplo e passível de diferentes aplicações. As primeiras grandes descobertas a respeito da doença de Chagas aguardaram as análises histopatológicas meticulosas dos dez primeiros casos letais que Carlos Chagas diagnosticou e enviou a Gaspar Vianna, publicadas em 1911; desde então lesões em modelos experimentais correspondentes às lesões humanas têm sido muito estudadas (ver Capítulo 9).

As principais aplicações são no estudo histopatológico clássico de cortes parafinados corados para observação em microscopia óptica, no estudo citopatológico por microscopia eletrônica e no estudo imunopatológico por técnicas especiais de imunocitoquímica. Descreveremos aqui os protocolos mais comumente utilizados.

O cuidado especial que se deve ter é quanto ao manuseio do animal infectado pois, além do sangue ser potencialmente infectivo para o pesquisador e o técnico, os demais líquidos corporais e os tecidos também podem conter parasitas viáveis que contaminam as soluções de lavagem nas quais se processam os tecidos até sua fixação. Portanto, todas as normas de segurança devem ser seguidas à risca (ver Capítulo 8).

A análise macroscópica do animal e dos órgãos coletados deve ser cuidadosa. O mau estado geral do animal caracteriza-se por apatia, perda de peso e pêlos, gengivite ulcerada, palidez das mucosas, dispnéia e edema generalizado. A autópsia revela edema do tecido subcutâneo e derrame líquido, claro e transparente, nas cavidades pericárdica, pleural e abdominal (ascite). Pode-se analisar estes líquidos quanto à presença de formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi, após concentração por microhematócrito ou por hemocultura. A pesagem e observação do volume dos órgãos, sobretudo baço e coração, revelam sua congestão e, ao corte, as cavidades átrio-ventriculares podem apresentar nítidos sinais de dilatação e presença ocasional de trombos.

 

17.1 Coleta e processamento de órgãos para

microscopia óptica

17.1.1 Coleta para histologia convencional em parafina

Material

• equipamento de proteção para o trabalho com T. cruzi (ver

Capítulo 8)

• câmara de anestesia com clorofórmio ou éter (vidro com

tampa larga e algodão no fundo)

• placa de cortiça (para a fixação do animal)

• solução salina fisiológica para lavagem dos órgãos

• álcool a 70%

• placa de Petri com solução salina para a lavagem

• pipetas Pasteur para troca da salina de lavagem

• recipientes de descarte de líquidos e de carcaças com as

devidas soluções desinfectantes

• solução fixadora (formalina 10% ou fixador de Millonig-

Rosman)

• tesoura de ponta afiada

• pinças anatômica e dente de rato

• pinça de relojoeiro

• recipiente para a fixação do material

Procedimento

• colocar o camundongo na câmara de anestesia;

Obs: para o sacrifício dos animais existe uma tendência

crescente à substituição da anestesia por éter ou clorofórmio

pela decaptação ou asfixia com CO , que parecem ser mais 2

indolores.

• fixá-lo na placa de cortiça, em cruz (cuidado com as agulhas

usadas para fixar os animais: os acidentes de laboratório mais

freqüentes ocorrem pela manipulação inadequada de agulhas);

• aplicar jatos de álcool a 70% no corpo do animal antes de

dissecá-lo;

• abrir primeiramente a pele do animal e em seguida o peritônio

(uma pinça para cada revestimento);

• retirar os órgãos evitando seu pinçamento ou esmagamento;

• lavar os órgãos com solução salina, pois excesso de sangue e

de muco na sua superfície formam um filme protetor, impedindo

uma penetração adequada do fixador;

• recortar o órgão em fatias delgadas para que o fixador penetre

rápida e homogeneamente. A espessura depende muito do

material a ser processado, bem como do fixador de escolha

(poder de penetração e velocidade de difusão deste);

Obs: o cérebro deve ser fixado por inteiro e somente depois

clivado. Por outro lado, as peças devem ser pequenas (1 a 2

mm de espessura) sempre que se empregue um fixador pouco

penetrante (ex. ácido ósmico), mas podem ter de 0,5 a 1 cm

quando se utilizam fixadores com maior poder penetração (ex.

formol, Bouin, Zenker). O importante é assegurar-se que o

fixador atue de maneira uniforme sobre toda a peça, sendo

aconselhável evitar-se que a peça fique apoiada no fundo do

frasco (colocar uma camada de cerca de 1 cm de algodão no

fundo do frasco, ou mantê-la suspensa no frasco amarrando

com um fio). O tempo mínimo de fixação varia muito conforme a

peça e o tipo de fixador, e não há limite máximo para fixação; o

tecido pode permanecer por tempo indeterminado até seu

processamento. O material deve ser colocado em um recipiente

que permita que o volume do líquido fixador seja de dez a vinte

vezes maior que o do espécime.

• para se calcular o índice cardíaco, o coração deve ser pesado

e fixado in totum. O índice pode ser calculado a partir da

relação percentual entre o peso do coração e o peso do animal

[(peso do coração/peso corporal) x 100].

17.1.2 Coleta para histoquímica em cortes congelados obtidos em criostato

Material

• tubos de criopreservação ou formas para congelamento

Obs: existem no mercado formas de vários tamanhos,

descartáveis; pode-se também preparar forminhas cilíndricas de

papel laminado usando como forma a extremidade arredondada

de uma pipeta ou de um tubo de ensaio, a depender do

diâmetro do órgão ou tecido a ser congelado, e adaptá-las

dentro de tubos de congelamento; outra opção é a embalagem

plástica de comprimidos.

• material de dissecção idêntico ao usado para coleta para

histopatologia convencional; todo o material que receberá os

órgãos a ser congelados (placas de Petri, salina, etc.) deverá

estar em banho de gelo

• crioprotetor (optimal cutting temperature compound - OCT)

• cuba (garrafa térmica) com nitrogênio (N ) líquido ou com gelo 2

seco

Procedimento

• remover o órgão inteiro como descrito no item 17.1.1 e lavar

em salina gelada, drenar o excesso de salina e clivar o órgão

em fragmentos de 2 a 3 mm de espessura (a largura vai

depender da forma);

Obs: órgãos pequenos como timo não precisam ser clivados;

emblocar em posição anatômica com a face externa para baixo;

órgãos maiores como baço e fígado devem ser cortados

transversalmente e emblocados com a face do corte voltada

para baixo; órgãos de tamanho médio como coração ou rim

devem ser cortados longitudinalmente (partir em duas metades)

e emblocados em posição anatômica, com a face externa

voltada para baixo.

• colocar o pedaço do tecido no molde apropriado com a face

de corte voltada para baixo e cobrir com crioprotetor (OCT,

Ames Co., Elkhart, Indiana);

• tampar o tubo e congelar em N líquido; 2

• cortar em criostato. Para iniciar os cortes deve-se esperar que

a temperatura do tecido equilibre com a temperatura do

criostato (-25 a -30ºC), caso contrário, será difícil a obtenção de

cortes finos;

Obs: o tecido pode ser estocado a longo prazo em freezer a

-70ºC ou em N líquido, ou a curto prazo em freezer a -20ºC. 2

Usar gelo seco ou N líquido para transportar o tecido do 2

freezer para o criostato, para evitar descongelamento.

Terminados os cortes, cobrir a face exposta do tecido

emblocado com uma gota de OCT, congelar, e guardar. Esse

procedimento evita o ressecamento do tecido no freezer ou N2

líquido.

17.1.3. Processamento dos tecidos para microscopia óptica

17.1.3.1. Processamento de tecidos para histopatologia convencional por microscopia óptica

a. Desidratação e diafanização

Material

• tecidos fixados em formalina ou fixador de Millonig

• cestinhas para conter o material identificado

• álcool em concentrações crescentes (70, 80, 90% e absoluto)

• agente diafanizador: xilol e benzeno são mais freqüentemente

utilizados

Procedimento

• após a fixação, remover o excesso de líquido fixador; para

isso é necessário lavar em água corrente por um período de 30

min a 1h;

• passar os tecidos em soluções alcoólicas de concentrações

crescentes, até o álcool absoluto, onde a água é totalmente

removida. São seis banhos sucessivos de 1h cada, nas

seguintes soluções: álcool 70, 80, 90%, álcool absoluto I, II e III;

• para diafanização, passar o material na solução diafanizadora

absoluta (xilol), pois o álcool, como a água, não é miscível com

a parafina, havendo assim, a necessidade de ser substituído

por um reagente solvente da parafina. São mais três banhos

sucessivos de 1h cada nas seguintes soluções: xilol I, II e III.

b. Infiltração e inclusão em parafina

Material

• parafina filtrada

• formas para a inclusão

• bico de Bunsen

• freezer para colocar o material incluído na forma

• estufa na faixa de 56 a 58ºC para derreter a parafina

• pinça

Procedimento

• transferir o material do agente diafanizador para a parafina

derretida, mantida suficientemente aquecida. A parafina com o

ponto de fusão entre 56 e 58º é a desejada para os trabalhos

de rotina. A parafina de inclusão deve ser nova e aquecida em

torno de 5º acima do seu ponto de fusão. Para infiltração do

material por parafina usam-se dois banhos sucessivos de 1h

cada nas soluções parafina I e parafina II;

• a inclusão consiste em colocar, através de pinça aquecida, os

tecidos previamente infiltrados, com a superfície clivada no

fundo da forma preenchida com parafina derretida (solução de

parafina III); Obs: se a parafina de inclusão não for da marca

Reagen, deve ser adicionada cera de abelha (aditivo). Outra

opção é o uso de pastilhas da Merck; neste caso não há

necessidade de adição de cera.

• depois da inclusão, as formas devem ser resfriadas no freezer

ou chapa refrigerada; logo após são obtidos blocos com

algumas pressões na forma.

c. Microtomia e montagem dos cortes na lâmina

Material

• micrótomo

• porta-bloco

• navalha bem amolada ou descartável

• banho-maria a 45ºC

• pinça

• cubas de gelo

• lâminas bem limpas e desengorduradas

• albumina 30%

• pincel com cerdas macias

Procedimento

• montar o bloco no porta-bloco antes de seccioná-lo. A face do

bloco a ser cortada deverá ser plana e conter bastante parafina

para que se possa desbastá-la até chegar o tecido;

• regular o micrótomo em 5 mm, pois as secções com essa

rotina são em geral satisfatórias;

• resfriar bem a superfície do bloco com um cubo de gelo antes

de ser cortado, para evitar cortes ressecados;

• operar o micrótomo com movimentos delicados, contínuos e

relativamente lentos, para se obter fitas de cortes uniformes;

• estender ou espalhar os cortes que se apresentam

ligeiramente enrugados em uma cuba em banho-maria.

Para espalhar os cortes na lâmina faz-se o seguinte procedimento:

• colocar um segmento da fita de cortes, com auxílio de um

pincel de cerdas macias, para flutuar na superfície da água

aquecida (10ºC abaixo do ponto de fusão da parafina);

• transferir ou "pescar" os cortes para as lâminas revestidas

com albumina, que tem propriedades adesivas e propicia uma

melhor fixação do corte na lâmina;

• colocar as lâminas em uma placa aquecida ou em estufa a

55ºC, para a secagem da água e coagulação do filme-adesivo;

• manter o material à temperatura ambiente, protegido da poeira

até a desparafinização.

d. Desparafinização e rehidratação

Material

• xilol absoluto

• álcool em diferentes concentrações (70, 80, 90% e absoluto)

• água destilada

Procedimento

• antes de corar os cortes, remover a parafina residual. Para

isso, usualmente se emprega-se o xilol como solvente. As

lâminas passam por banhos sucessivos de 3 min cada nas

seguintes soluções: xilol I, II e III;

• se a solução corante a ser usada for aquosa, os cortes são

hidratados por passagem seriada em soluções alcoólicas de

concentrações decrescentes. Durante a reidratação dos cortes

as lâminas não devem ser deixadas secas por completo. As

lâminas passam por banhos sucessivos de 3 min cada nas

seguintes soluções: álcool absoluto I, II e III, álcool 90% , 80%,

70% e água destilada.

e. Coloração por hematoxilina e eosina

Material

• hematoxilina de Harris

• eosina Y

• álcool clorídrico 1%

• água acética 1%

• álcool em diferentes concentrações (70, 80, 90% e absoluto)

• xilol absoluto

Procedimento

• a hematoxilina é aquosa, por isso deve-se mergulhar o

material na água para que ocorra a oxidação. A hematoxilina de

Harris cora regressivamente. O álcool clorídrico 1% serve para

diferenciar o corte, pois a hematoxilina de Harris supercora o

tecido. A água acética 1% serve para "segurar" a eosina no

tecido. A seqüência de coloração é a seguinte: hematoxilina (15

min) → álcool clorídrico 1% (três mergulhos) → água corrente

(até ficar violeta) → eosina (2,5 min) → água acética 1% (três

mergulhos);

• o material deve ser desidratado em álcool, pois este remove a

água e atua como um agente diferenciador em caso de excesso

de corante. São banhos sucessivos de 3 min cada nas

seguintes soluções: álcool 70, 80, 90%, álcool absoluto I, II e III;

• no clareamento, o xilol torna o tecido transparente. São

banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes soluções: Xilol

I, II e III.

f. Montagem dos cortes entre lâmina e lamínula

Material

• pinça

• bálsamo do Canadá

• lamínula (com o tamanho apropriado para o corte e bem limpa

em solução sulfocrômica)

Procedimento

• retirar, cuidadosamente, sem estragar o tecido, uma lâmina do

último banho de xilol, com o auxílio de uma pinça. Permitir um

escoamento do excesso do xilol;

• manter a lâmina em uma posição moderadamente inclinada,

colocar uma gota de bálsamo do Canadá próximo à borda do

corte;

• colocar a lamínula de tamanho apropriado, em um ângulo

próximo à borda da lâmina, e permitir que a mesma se deposite

sobre o corte. Deve-se tomar cuidado para evitar a formação de

bolhas de ar, presas entre a lâmina e lamínula. Caso isto

ocorra, as bolhas podem ser retiradas, aplicando-se uma

pressão leve sobre a lamínula, com o auxílio de uma pinça.

Caso as bolhas persistam, recolocar a lâmina no banho de xilol

e quando a lamínula for descolada, remontar o corte;

• após a montagem do corte entre a lâmina e a lamínula, a

lâmina deve ser levada ao microscópio óptico a fim de verificar

aparecimentos de "dentes", "microdentes", ressecamento e

artefatos. A depender dos defeitos encontrados, um novo corte

do bloco de parafina deverá ser feito.

17.1.3.2 Interpretação das lâminas

A análise histopatológica exige prática e conhecimento de histologia, a fim de que as características a serem observadas nos tecidos sejam bem destacadas. É essencial o conhecimento da histologia normal dos órgãos que serão estudados.

A atenção do observador se concentra em identificar:

• ninhos de parasitas (células com amastigotas em proliferação,

e a caracterização do tipo celular infectado)

• focos de infiltrados inflamatórios nos diferentes tecidos dos

órgãos em estudo: presença de células polimorfo- ou

mononucleares infiltrantes, sua distribuição topográfica na

histologia característica do órgão e a composição citológica do

infiltrado. O infiltrado pode ser focal, zonal, ou difuso e

acúmulos de macrófagos podem até chegar a formar nódulos

• edema

• congestão vascular

• neurite

• necrose focal

• fibrose, hipertrofia e atrofia

• destruição (degeneração) tissular

Após a análise e descrição qualitativa das características

histopatológicas encontradas nas lâminas, pode ser feita uma

análise quantitativa, tanto do parasitismo tissular como da

inflamação tissular. Nos dois casos pode-se analisar:

• a freqüência percentual de encontro de ninhos e/ou de focos

inflamatórios nos cortes de diferentes animais segundo o grupo

experimental estudado

• o número de ninhos de parasitas e/ou de focos inflamatórios

por unidade de área observada, expresso em números

absolutos ou relativos, de uma a quatro cruzes

• o número de células componentes dos ninhos ou dos

infiltrados

• as lesões fibrosas e inflamatórias podem ser graduadas numa

escala de cruzes:

+ suave e focal

++ moderadamente difusa e focal

+++ difusa severa

• as lesões inflamatórias podem também ser graduadas em

extensão de inflamação:

0 ausente

+ rara e fraca

+ ocasional e atenuada

++ freqüente e intensa

+++ freqüente e muito intensa 17.1.4 Processamento de Tecidos para Imunohistoquímica em Cortes Congelados

O congelamento de órgãos para análises por microscopia óptica é indicado quando se pretende realizar reações imunohistoquímicas, tanto enzimáticas como de fluorescência. A vantagem deste procedimento em reação às técnicas histoquímicas convencionais é a preservação das moléculas, uma vez que os tecidos não passam por agressões físicas (altas temperaturas) ou químicas (uso de fixadores). A seguir apresentaremos os protocolos de preparo de soluções e de realização destas técnicas.

17.1.4.1 Revestimento das lâminas

Material

• lâminas

• gaze

• papel alumínio

• soluções de revestimento: poli-L-lisina 0,005% em tampão

TRIS HCl 10 mM; ou gelatina 1% - alumen aquosa

Procedimento

• mergulhar overnight as lâminas em uma solução de éter:álcool

absoluto (1:1);

• secar bem com gaze;

• no caso de gelatina, mergulhar rapidamente as lâminas; no

caso de poli-l-lisina mergulhar por 15 min;

• escorrer e deixar secar na posição vertical, no suporte de

lâminas;

• embrulhar em papel alumínio para proteger contra poeira (de

dez em dez), identificar e datar por fora com cuidado para não

tocar na superfície da lâmina;

Obs: uma opção barata que também funciona é o uso de uma

solução com cola plástica (tipo "Polar"): misturar um frasco

pequeno de cola a 500 ml de água destilada, homogeneizando

bem a solução, e mergulhar rapidamente as lâminas nesta

solução, que pode ser usada várias vezes e deve ser guardada

em geladeira.

17.1.4.2 Imunoperoxidase indireta em cortes congelados Material

• tampão TRIS NaCl 0,05 M (salina tamponada com TBS), pH

7,6

• MgCl 10 mM (solução de uso) 2

• solução de AEC (amino-etil carbazol) 8 mg/ml (solução

substrato para peroxidase)

• solução de DAB (diamino benzidina) 6 mg/10ml de Tris 0,05M,

pH 7,6

• PBS pH 7,2

• TRIS-HCl 0,1M pH 9,5

• tampão acetato 0,1M pH 5,2

• solução de H O 3% 2 2

Procedimento para revelação com peroxidase

• obter corte no criostato e recolher em lâmina revestida;

• secar à temperatura ambiente;

• fixar em acetona 100% gelada por 10 min ou em PFA 2% em

PBS por 3 min;

• secar;

• hidratar (banho em PBS por 10 min);

• bloquear a peroxidase endógena com H O 3% em PBS por 2 2

20 min;

• bloquear com PBS-BSA 2,5% ou PBS-leite desnatado 10%

por 10 min;

• bloquear com PBS-soro normal de cabra 10% por 30 min a 1h;

• incubar com o primeiro anticorpo por 60 a 120 min;

• lavar em PBS três vezes por 5 min (em banho);

• incubar com o segundo anticorpo (conjugado com peroxidase)

por 60 min;

• lavar em PBS três vezes 5 min (em banho);

• revelar a peroxidase com AEC por 10 min ou DAB por 5 min;

• lavar rapidamente em água corrente para bloqueio da reação;

• fazer contracoloração com hematoxilina de Mayer por 1min;

• lavar em água corrente por 10 min;

• secar e montar em meio aquoso (gelatina) no caso de se usar

AEC, ou alcoólico no caso de DAB (neste caso, as lâminas

podem ser desidratadas, contracoradas e montadas em meio

convencional para histologia).

Obs: o protocolo de fixação deverá ser inicialmente testado

para cada tipo de tecido.

17.1.4.3 Imunocitoquímica com conjugados de fosfatase alcalina em cortes congelados

Material

• solução de lavagem: TBS pH 7,6

• TBS BSA 1% - adicionar 1g de BSA para cada 100 ml de TBS

• TBS leite desnatado 5% - adicionar 5 g de leite para cada 100

ml de TBS

• TBS soro normal 4% - adicionar 4 ml de soro para cada 100

ml de TBS

• soluções de (substrato para fosfatase alcalina): 5-bromo-4-

cloro-3-inodolil fosfato/cloreto de nitro-blue tetrazolio em TBS,

pH 9,5. O produto formado é azul, insolúvel em água

• meio de incubação para fosfatase alcalina: preparar as

soluções estoques de: X-fosfato 50x, NBT-estoque 50 x, MgCl2

100 mM e TRIS-HCl 0,2M

• meio de incubação para fosfatase alcalina (solução de uso): X-

fosfato 0,38 mM, NBT 0,41 mM, MgCl 10 mM, em TRIS-HCl 2

0,2 M pH 9,5.

Procedimento

O protocolo geral é o mesmo usado para reação de imunoperoxidase, mas obedece a alguns cuidados específicos:

• todas as etapas devem ser feitas com TBS (salina tamponada

com Tris) ao invés de PBS, para evitar artefatos pela presença

do fosfato do PBS;

• podem ser usados dois sistemas de revelação, um para azul,

com NBT e outro para vermelho, com fast red. 17.1.4.4 Montagem, contracoloração e contraste positivo para criocortes

Material

• meio de montagem: gelatina/glicerina

• hematoxilina de Mayer (solução estoque, para contracoloração

de tecidos)

Procedimento

• diluir 10x;

• incubar 30 min;

• lavar até retirar todo o corante da água.

 

17.2 Coleta e processamento de órgãos para

microscopia eletrônica de transmissão

17.2.1 Coleta para Fixação de Rotina

A coleta do material é uma etapa importante onde devem ser levados em consideração fatores como tempo de retirada do órgão do corpo do animal e manutenção do órgão em solução fisiológica a baixa temperatura, objetivando evitar a autólise do material. Em seguida, o espécime deve ser fixado em solução fixadora previamente escolhida e com metodologia adequada. As diferenças da fixação para microscopia eletrônica em relação à descrita para microscopia óptica (item 17.1.1) são basicamente duas: o tamanho do fragmento clivado e o tipo de fixador.

No anexo 17.2 descrevemos os métodos de preparo dos tampões e fixadores utilizados em microscopia eletrônica.

Na preparação dos tecidos biológicos para observação ultra-estrutural é necessário fixá-los por métodos químicos ou estabilizá-los por métodos físicos (congelamento rápido), para que as estruturas celulares permaneçam de modo o mais próximo ao real. Os órgãos podem ser fixados ainda fazendo parte do organismo (por perfusão) ou o mais rapidamente possível; após a colheita cirúrgica o tecido é cortado em pequenos fragmentos de 1 mm de espessura e colocado imediatamente em solução fixadora tamponada (por imersão). O processo de fixação envolve reações químicas entre os componentes celulares (principalmente proteínas) e o fixador e serve para estabilizar as estruturas celulares. Um par conjugado de ácido-base age como tampão quando este sistema tende a resistir a uma modificação de pH de uma solução, quando se adiciona na mesma [H]+ e [OH]-. Diferentes sistemas de tampões são utilizados em microscopia eletrônica com a finalidade de se manter em um determinado pH nas soluções de fixação, de lavagem, de reações enzimáticas, etc.

Material

• o mesmo utilizado para cortes em criostato

• glutaraldeído (GA) 2,5% em tampão cacodilato de sódio-HCl

0,1 M

• tetróxido de ósmio (OsO ) a 1% em tampão cacodilato de 4

sódio-HCl, 0,1M

Procedimento

• retirar do órgão e lavá-lo rapidamente com solução salina

fisiológica gelada;

• imergir o espécime na solução fixadora de GA a 2,5% em

tampão cacodilato de sódio a 0,1M, contendo ou não sacarose

a 3,5%, pH 7,2 a 4ºC, e se for necessário recortar em

fragmentos de no máximo 1 mm3. A fixação deve-se processar

no mínimo por 1h;

• lavar em solução de tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2 a 4ºC;

• lavar 3x em tampão para a retirada do excesso de fixador;

Obs: nessa etapa pode-se estocar o material para posterior

processamento.

• lavar o material por 2x em tampão;

• pós-fixar com solução de OsO a 1% em tampão cacodilato 4

0,1 M pH 7,2 por 1h em temperatura ambiente e no escuro;

• lavar 3x com o mesmo tampão.

17.2.2 Processamento de rotina

Após a fixação do material de modo apropriado para o processamento por microscopia eletrônica, procede-se à desidratação, infiltração e inclusão em resinas para rotina ou especiais para preservação de epitopos imunossensíveis.

A desidratação total do tecido é indispensável se a inclusão for feita em resinas não hidrossolúveis, porém deverá ser rápida e progressiva, a fim de ser preservada a estrutura celular. Utilizando-se resinas hidrossolúveis a desidratação não precisa ser total, estas resinas são polimerizadas mesmo com a presença de pequena quantidade de água na célula. Os solventes orgânicos mais utilizados são acetona, álcool e metanol.

A infiltração ocorre com uma gradual substituição do agente desidratante pela resina escolhida. Ela é realizada por diminuição gradual e contínua da concentração do solvente proporcionalmente ao aumento da concentração do meio de inclusão.

A inclusão consiste em uma completa impregnação do tecido com a resina, pura durante 4 h ou durante à noite. Após esse período o espécime é emblocado em formas ou cápsulas especiais com uma nova resina. Para que aconteça a polimerização com as resinas epoxi é necessário que esta ocorra a 60ºC. Com as resinas hidrossolúveis a polimerização ocorre a baixa temperatura sob luz ultravioleta (UV).

Material

• soluções dos agentes desidratantes (solventes orgânicos):

séries de acetona, etanol e metanol a 15, 30, 50, 70 e 90%

• resina Epoxi (Epon 812)

Procedimento

• coletar e fixar o material;

• desidratar com série crescente do agente desidratante (30, 50,

70 90 e 100%), durante 10 min cada etapa, sendo que a 100%

devem ser feitas três trocas de 10 min cada;

• retirar o agente desidratante substituindo por uma solução do

agente desidratante e resina (v/v). Os fragmentos devem ser

infiltrados nesta solução durante 18 h a 4ºC em frasco bem

fechado;

• incluir os espécimes com resina epoxi em cápsulas de gelatina

ou em formas próprias, a 60ºC, e deixar polimerizar em estufas

apropriadas durante 72 h;

• obter cortes ultrafinos em ultramicrótomo, pescar em grades

de cobre e acondicionar em placas de Petri pequenas;

• contrastar com solução de acetato de uranila 2% em água por

10 min em placas protegidas da luz e em solução de citrato de

chumbo por 3 min;

• observar o material em microscópio de transmissão e

fotografar;

• os negativos são revelados e as fotomicrografias são então

realizadas. A interpretação qualitativa dos cortes

(características do tecido a serem observadas) é feita em

fotomicrografias de alta qualidade.

17.2.3 Coleta e fixação de material para incluir em resina lowicryl

Material

• PBS e TBS

• tampão cacodilato de sódio-HCl, 0,2 M

• 4 % PFA

• 0,1-0,5 % GA

• 0,2-1 % ácido pícrico

Procedimento

• retirar do órgão e lavá-lo rapidamente com solução salina

fisiológica gelada;

• fixar em PFA 4% + glutaraldeído 0,1 a 0,5% + 0,2 a 1% ácido

pícrico em tampão cacodilato 0,1 M + sacarose 3,5 % por 1h a

4ºC.

17.2.4 Processamento de material para inclusão em lowicryl

Material

• solução de cloreto de amônia a 50 mM em TBS

• soluções dos agentes desidratantes (solventes orgânicos):

séries de etanol ou metanol a 15, 30, 50, 70 e 90%

• resina Lowicryl K4M

Obs: o Lowicryl é neurotóxico.

Procedimento

• lavar 3x por 10 min em tampão cacodilato 0,1 M + sacarose

3,5%;

• lavar 1x em TBS;

• incubar em cloreto de amônia 50 mM em TBS durante 30 min

a 4ºC para bloquear grupos aldeídicos reativos;

• lavar 4x em TBS;

• desidratar o material em séries crescentes de álcool (metanol

ou etanol) por 10 min em cada solução: 30, 50 (a 4ºC), 70 e

90% por 10 min a 20ºC. Quando o material estiver em

suspensão, deve-se cortar o sedimento em metanol 90% ou

etanol 90% a -20ºC;

• infiltrar o material com Lowicryl e agente desidratante nas

seguintes proporções:

metanol 90%/Lowicryl (1:1) (-20ºC) overnight

metanol 90%/Lowicryl (1:2) (-20ºC) overnight

Lowicryl puro por 48 h a -20ºC

• incluir em cápsulas de gelatina e deixar polimerizar por 5 dias

sob luz UV a -20ºC. Em seguida, colocar o material à

temperatura ambiente ainda sob luz UV por 2 dias;

• obter cortes ultrafinos e colocar sobre grades de níquel (sem

contrastar).

17.2.5 Protocolo de imunocitoquímica em cortes de lowicryl

Material

• TBS 0,1M

• cloreto de amônia 50 mM

• TBS/BSA 1%/Tween 1%

• anticorpo específico

• proteína A complexada a ouro coloidal

• acetato de uranila 2% em água

Procedimento

• lavar com TBS 0,1M;

• incubar com cloreto de amônia 50 mM por 30 min para inativar

grupamentos aldeídicos reativos;

• incubar 3x por 10 min em TBS/BSA 1%/Tween 1% (BSA para

bloquear sítios de ligação inespecífica);

• incubar com o primeiro anticorpo por 1h a 37ºC (determinar

previamente a concentração do anticorpo);

• lavar com TBS/BSA 1%/Tween 1% - 3x 10 min;

• incubar com a proteína A-ouro coloidal diluída 1:10 por 30 min

à temperatura ambiente (a concentração da proteína pode

variar);

• lavar com TBS/BSA 1%/ Tween 1% - 2x 5 min;

• lavar com H O - 3x 10 min; 2 ddd

• contrastar por 5 min com citrato de chumbo ou por 20 min com

acetato de uranila;

• lavar com H O e deixar secar; 2 ddd

• guardar as grades em ambiente seco com sílica gel.

17.2.6 Coleta do órgão, fixação, infiltração e obtenção de cortes congelados

Material

• o mesmo utilizado para cortes em criostato (conforme citado

anteriormente)

• suportes especiais para criocongelamento e

crioultramicrotomia

• 4% PFA em PBS

Procedimento

• logo após a abertura do animal, banhar o órgão em PFA para

fixação;

• retirar o órgão;

• fragmentar o órgão imerso em PFA a 4% (cortes de no

máximo 1 mm3);

• fixar os fragmentos PFA 4 % por 1h;

• infiltrar com sacarose a 4ºC, em banhos sucessivos de 1h

cada em soluções de concentração crescente de sacarose (0,5,

1,25, 1,5, 1,7, 1,9 e 2,3 M). Nesta última o material deve ficar

toda a noite sob agitação

• colocar o fragmento no suporte juntamente com uma gota de

sacarose 2,3 M;

• congelar em N líquido; 2

• cortar o fragmento congelado em crio-ultramicrótomo. Os

cortes são retirados direto da navalha, com o auxílio de uma

pinça especial com anel de borracha. Deixa-se secar o anel

com sacarose, recolhe-se os cortes que são então depositados

na grade e deixados para secar alguns minutos;

Obs: o método pode ser adaptado para o congelamento de

células isoladas para corte em crio-ultramicrótomo, incluindo-se

as células em gelatina antes da infiltração com sacarose, com o

seguinte protocolo:

• fixar as células em 0,5% GA + 2% PFA em PBS pH 7,4 ou 4%

PFA por 1h;

• lavar 3x em PBS (10 min/vez);

• emblocar em gelatina 2 a 10% em PBS a 37ºC por 30 min;

• centrifugar a 4ºC por 30 min;

• cortar em pequenos fragmentos;

• deixar por 2 h à temperatura ambiente em glicina 50 mM em

PBS para bloquear grupos aldeídos;

• impregnar em sacarose (crioprotetor): sacarose 0,6 a 2,3 M

em PBS pH 7,4 (mínimo de 3 a 6 h).

17.2.7 Processamento dos criocortes incluidos em sacarose para imunocitoquímica

Material

• soluções crescentes de sacarose e de polivinil pirolidina (PVP,

Sigma/Peso Molecular 10.000) em PBS pH 7,4

0,5% Sacarose + 20% PVP

1,25% Sacarose + 20% PVP

1,5% Sacarose + 20% PVP

1,7% Sacarose + 20% PVP

1,9% Sacarose + 20% PVP

2,3% Sacarose + 20% PVP

• soro fetal bovino (SFB)

• glicina 0,12%

• PBS-glicina 0,12%

• proteína A-ouro coloidal

• acetato de uranila 2% em água

Procedimento

As grades são transferidas para gotas de PBS sobre uma fita de parafilme. Todas as etapas são feitas a temperatura ambiente:

• incubar os cortes em PBS com 10% de SFB contendo 0,12%

de glicina (para reduzir as ligações inespecíficas de anticorpos);

• diluir o anticorpo em PBS contendo 5% de SFB e 0,12% de

glicina e incubar a amostra durante 30-60 min. Os anticorpos

devem ser centrifugados sempre por 1min antes do uso, com a

finalidade de remover agregados. Como controle, incubar os

cortes pelo mesmo período de tempo, sem o anticorpo, no

tampão (PBS/glicina);

• lavar 4x em PBS com 0,12% de glicina, num total de 15 min;

• diluir a proteína A complexada com ouro coloidal em PBS com

5% SFB + 0,12% de glicina (usar diluição 1:10). Após as

lavagens, incubar os controles e os cortes tratados com o

anticorpo, por 30 min, com a proteína A-ouro coloidal;

• lavar 6x em PBS com 0,12% de glicina num total de 20 min;

• lavar em água destilada 4x num total de 10 min. Esta etapa é

importante para remover os íons fosfatos antes da reação com

acetato de uranila;

• incubar em acetato de uranila a 3% pH 7,0-7,5 por 5 min;

• lavar em água destilada 2x num total de 1 min (as etapas 7 e 8

podem ser omitidas);

• contrastação final em metil celulose com 3% de acetato de

uranila aquosa (nove partes de metil celulose mais uma parte

de ouro). Esta solução fica em gelo e as grades são colocadas

nesta solução por 10 min;

• recolher a grade com uma alça, remover o excesso de metil

celulose e secar ao ar.

 

17.3 Coleta e processamento de tecidos para

hibridização

A hibridização é uma técnica que permite a detecção e/ou visualização de DNA ou RNA celular em cortes de tecidos, células em suspensão, preparações cromossomiais e ácidos nuclêicos imobilizados em suportes sólidos. Esta técnica baseia-se no fato que fragmentos de ácidos nuclêicos (DNA ou RNA) marcados com elementos isotópicos ou não isotópicos (sondas) irão hibridizar ácidos nuclêicos (DNA ou RNA) celulares sob condições apropriadas de temperatura, força iônica e pH, formando híbridos estáveis.

As primeiras hibridizações foram feitas com ácidos nuclêicos (extraídos e purificados) imobilizados em membranas de celuloses. Embora desta maneira seja possível identificar diferentes classes de DNA (Southern) ou RNA (Northern) pelo tamanho dos fragmentos hibridizados com as seqüências de sonda complementares (antisense), não há informações sobre a distribuição de seqüências específicas em células individuais. A hibridização in situ introduzida na década de 60 permite a demonstração morfológica do DNA e do RNA celular em cortes de tecidos, células em suspensão e preparações cromossomiais.

Uma das vantagens da hibridização in situ em relação à imunocitoquímica convencional é que na hibridização revela-se o verdadeiro sítio de síntese de uma determinada proteína enquanto por imunocitoquímica somente é possível revelar a presença do peptídeo. Hoje a hibridização representa um dos principais instrumentos de pesquisa nas mãos de morfologistas, principalmente nos diagnósticos patológicos. Ao contrário do DNA que é estável, o mRNA é extremamente lábil, sendo in vivo continuamente sintetizado e degradado. Devido a sua meia-vida extremamente curta, deve-se minimizar possíveis degradações com ribonucleases congelando ou fixando os tecidos imediatamente após sua excisão cirúrgica.

Cuidados para o trabalho com RNA

• toda vidraria e plásticos utilizados devem ser RNAse free.

Para isso as vidrarias e o material cirúrgico são esterilizados em

forno por 5 h a 200ºC e os plásticos e outros objetos não

esterelizáveis em forno devem ser incubados overnight com

H O tratada com DEPC (dietil pirocarboneto 0,1%, incubando 2

overnight). Ponteiras e tubos para microcentrífuga virgens

devem ser autoclavados;

• todas as soluções devem ser preparadas com água tratada

por DEPC e posteriormente autoclavadas. Durante todas a

etapas o operador deve utilizar luvas;

• os tubos de plástico que serão usados na extração devem ser

resistentes a fenol e clorofórmio.

Diferentes metodologias são descritas para a preparação do material a ser utilizado em hibridizações feitas em membranas ou in situ. A escolha do processamento a ser usado deve visar a boa preservação do material biológico que mantém detalhes da sua morfologia (no caso da hibridização in situ), além da retenção dos ácidos nuclêicosalvo com boa exposição das suas seqüências. Temos entre elas:

Hibridização in situ

• fixação do tecido, imediatamente após sua obtenção, com

paraformaldeído (PFA) 4% e em seguida imersão em solução

de sacarose. Após este tratamento, congelar o tecido em N2

líquido até corte em criostato. Os cortes devem ser aderidos a

lâminas revestidas com poli-L-lisina;

• congelamento dos tecidos em N líquido, imediatamente após 2

sua obtenção, corte do tecido em criostato, adesão dos cortes

em lâminas revestidas e fixação com PFA 4% (10 min). Após a

fixação os cortes podem ser estocados a -70ºC até a reação de

hibridização. Neste protocolo é possível processar

simultaneamente parte do material para extração total do ácido

nuclêico e hibridização em membranas de celulose, mas há

perda na manutenção da morfologia;

• obtenção do tecidos e fixação imediata em PFA 4%,

desidratação progressiva em etanol, incubação em xilol e

inclusão em parafina. Os cortes obtidos por microtomia devem

ser aderidos a lâminas revestidas;

• alguns autores sugerem que após a fixação, as preparações

podem ser estocadas indefinidamente em etanol 70% a 4ºC

permitindo o processamento de amostras de uma cinética

experimental ao mesmo tempo.

Fixadores

• pode-se utilizar PFA, PFA acrescido de glutaraldeído ou

solução de Bouin. A escolha irá depender diretamente do tipo

de tecido, do tipo e do tamanho da sonda;

• durante a fixação ocorre cross-linking entre as proteínas e

carboidratos das células e os aldeídos dos fixadores. Por isso,

dependendo do fixador escolhido, às vezes se faz necessário o

uso de diferentes tratamentos para facilitar o acesso da sonda

ao ácido nuclêico. Os tratamentos mais freqüentes empregam o

uso de enzimas (pronase, proteinase K), a acetilação de

grupamentos amino (reduzindo ligações eletrostáticas não

específicas), e o uso de detergentes (Triton X100).

Northern blot

• a extração dos ácidos nuclêicos de tecidos deve ser feita logo

após sua retirada ou, quando não for possível, o tecido deve ser

imediatamente congelado e estocado em N líquido ou a -70ºC 2

até sua extração;

• no caso de células cultivadas em monocamadas ou em

suspensão, lavar as células 3x com PBS (livre de cálcio e

magnésio) gelado, adicionando-se em seguida a solução

desnaturante e mantendo-as a 4ºC. A monocamada deve ser

removida do substrato com auxílio de um rubber policeman

virgem (RNAse free) e em seguida processada. Geralmente

utilizam-se 100 µl de solução D por 106 células ou 1,8 ml de

solução D (ver Anexo 17.3) para cada placa de cultura cujo

diâmetro é de 10 cm;

• após a extração e precipitação, os ácidos nuclêicos são

submetidos a uma eletroforese (geralmente gel de agarose) e

transferidos para membranas de celulose ou náilon;

• os ácidos nuclêicos podem então ser hibridizados (com uma

prévia etapa de bloqueio) e revelados, dando informações

quantitativas e qualitativas sobre sua expressão;

• o controle da viabilidade do RNA extraído pode ser feito pela

observação das bandas do rRNA de 28S, 18S e 5S que devem

estar nítidas e visíveis em géis corados por brometo de etídio;

Obs: a solução de extração (solução desnaturante) é em geral

uma combinação de agentes desnaturantes, detergentes e

inibidores de RNAses. Atualmente, é mais comum a utilização

de soluções comerciais tais como Trizol (Gibco-BRL) e Tri-

reagent (Molecular Research Center).

Escolha da sonda

Outra etapa importante das hibridizações se refere à escolha do tipo de sonda, sua marcação e sensibilidade do método utilizado para revelação do seu sinal. Em princípio tanto sondas de DNA ou RNA podem ser utilizadas para localizar seqüências de RNA ou DNA. Cada sonda tem vantagens e desvantagens e sua escolha vai depender da experiência pessoal em técnicas de biologia molecular, acesso e meios para clonagem das sondas e do tipo de seqüência a ser analisada.

As sondas podem ser de DNA fita dupla ou simples, de RNA e de oligonucleotídeos. As sondas de cDNA (DNA complementar à seqüência de um mRNA) de fita dupla são ainda as mais usadas, embora tenham a desvantagem de após serem desnaturadas poderem se realinhar competindo com a hibridização do ácido nuclêico em estudo. A difusão da sonda e sua especificidade tem relação direta com o seu tamanho. Em geral para hibridização in situ utilizam-se sondas de RNA de 50-200 nucleotídeos e sondas de DNA de 400-600 nucleotídeos. A concentração da sonda também é um fator muito variável mas recomenda-se para hibridizações in situ 0,5 ng/ml para sonda de RNA e 1 ng/ml para sonda de DNA.

As sondas podem ser marcadas por meios isotópicos e não isotópicos. Devido à sua alta sensibilidade ainda se utilizam os primeiros. A escolha do tipo de radioisótopo dependerá do nível de resolução necessário em cada investigação. Filmes de auto-radiografia podem ser suficientes para se detectar ácidos nuclêicos imobilizados em membranas ou em tecidos mas não em nível celular. Para este tipo de resolução são apropriados I125 32 35 , P e S. Entretanto, se for necessária uma resolução em nível celular deve-se escolher H3 35 ou Se as lâminas devem ser revestidas com uma emulsão fotográfica líquida seguida de revelação. Em Northern blots em geral utilizam-se sondas marcadas com P 32. Problemas devido à alta periculosidade, pouca estabilidade da sonda e longo tempo de revelação estimulam cada vez mais o uso de sondas não radioativas. A marcação das sondas por elementos não isotópicos incluem o sistema de biotina-avidina, sistema de fluorocromos e de sistemas enzimáticos.

Metodologia de hibridização

Deve-se levar em consideração alguns fatores durante a escolha da metodologia: a temperatura, a força iônica, a solução de bloqueio, a concentração de sonda e o tempo de hibridização.

A formamida (desestabilizador de dupla hélice) que permite uma diminuição da temperatura de hibridização (quanto mais alta a temperatura, maior é a tendência de desestabilizar os híbridos sonda-ácido nuclêico-alvo, o que pode contribui para um menor ruído) e o dextran sulfato (fator de exclusão de volume) são reagentes que, de um modo geral, sempre fazem parte de protocolos de hibridização.

As preparações são quase sempre incubadas em soluções de bloqueio, visando reduzir o background ou ruído. Estas soluções geralmente contêm ácidos nuclêicos não específicos (para DNA usa-se esperma de salmão, e para RNA o tRNA) e uma solução de bloqueio (solução de Denhardt) que contém Ficoll, PVP (poli-vinil-pirrolidina) e BSA (albumina bovina).

A temperatura ótima de hibridização é extremamente variada levando-se em conta o tipo de sonda, o tamanho, a natureza de nucleotídeos, etc. Em geral se recomenda 42ºC para sondas de DNA, 50-55ºC para RNA e 37ºC para oligonucleotídeos.

Como controles para teste da especificidade da hibridização destacamos tratamentos dos espécimes com RNAses ou DNAses, utilização de sondas não homólogas, utilização de sondas de RNA sense, ausência de sonda, etc.

A seguir descreveremos uma metodologia utilizada para análise de mRNA (utilizando sondas isotópicas de cDNA) imobilizadas em membranas de náilon (Lorent et al., 1994).

17.3.1 Northern Blot

Extração de RNA de tecidos

• obter o órgão e congelar e estocar em N líquido ou a -70ºC 2

caso não vá ser processado imediatamente;

• extrair com solução desnaturante (solução D) (em geral 1 g

tecido/10 ml de solução D) (ver Anexo 17.3);

• transferir para tubo de polipropileno e adicionar

seqüencialmente, misturando gentilmente por inversão, acetato

de sódio 2 M pH 4,0 (1/10 do volume), fenol saturado (1

volume) e clorofórmio + 4% álcool isoamílico (0,2 volume).

Agitar vigorosamente por 10 s e incubar no gelo por 15 min;

• separar a fase aquosa da orgânica, através de centrifugação a

39.000 g por 20 min a 4ºC;

• adicionar à fase aquosa contendo o RNA volume igual de

isopropanol e incubar por 1h a -20ºC para precipitar o RNA;

• coletar o RNA por centrifugação (3.300xg por 20 min a 4ºC);

• incubar o sedimento (rico em RNA) novamente com solução D

e precipitar com isopropanol sob as mesmas condições;

• centrifugar novamente, desprezar o sobrenadante e lavar o

sedimento por 3x com etanol 75%;

• secar o sedimento a temperatura ambiente e ressuspender em

formamida (100%) ou água tratada com DEPC, no menor

volume possível, estocando a -70ºC;

• calcular a concentração do RNA total por espectofotometria

(260 nm).

Obs: para quantificar o RNA no espectofotômetro, diluir 2 µl de

RNA em 600 µl de H 0+DEPC. No tubo controle negativo, 2

adicionar o mesmo volume somente de formamida (2 µl) à H 0 2

e em outro tubo acrescentar 2 µl de extrato total de DNA.

Quanto menor for a contaminação de proteínas e DNA na

preparação, mais próximo a 2 deve ser a relação entre 260/280

nm. A leitura de 280 nm é para proteínas e a de 260 nm para

ácidos nuclêicos. Cada DO significa 40 µg/ml de RNA. Com 260

este método obtémse aproximadamente de cada garrafa de

cultura de 90 mm cerca de 100/200 µg de RNA.

Eletroforese e transferência

• desnaturar o RNA a 70-100ºC por 10 min em solução A (ver

Anexo 17.3);

• utilizar 10 µg/ml do RNA total por slot. Não esquecer de

aplicar, também, um padrão de peso molecular. Géis de 1% de

agarose são apropriados para moléculas de RNA maiores do

que 1 kb e 1,4% para menores de 1 kb;

• preparar o gel de agarose com 6% formaldeído (ver Anexo

17.3) e realizar a corrida por 5 h a 60V em uma vez tampão

MOPS (ver Anexo 17.3);

• fazer gráfico com os valores do log do tamanho das 10

espécies de RNA (padrão) contra a distância migrada e utilizar

a curva resultante para cálculo do tamanho das espécies de

RNA detectadas pela hibridização após a transferência do gel

para a membrana de náilon;

• após a eletroforese, transferir o RNA, por capilaridade, para

uma membrana de náilon (Amersham, UK) em tampão 10X

SSPE (ver anexo 17.3);

• fixar o RNA à membrana tratando-o por 20 min a 80ºC,

seguido por UV-cross-linking por 45 s (Stratalinker 1800,

Stratagene, Heidelberg, Alemanha) ou por 3 min em

transiluminador de UV;

• guardar a membrana a -20ºC até a etapa de hibridização.

Obs 1: a cuba de eletroforese deve ser limpa com detergente,

lavada com água, seca com etanol e incubada com um volume

de H O a 3% por 10 min à temperatura ambiente. Em seguida 2 2

lavar abundantemente com H O-DEPC. Deve-se também pré-2 2

incubar a cuba (com os pentes) com H O-DEPC, overnight 2 2

antes da eletroforese Obs 2: como os vapores de formol são

tóxicos, as soluções contendo este fixador devem ser

manuseadas em capelas de exaustão, utilizando-se luvas. O

brometo de etídeo é mutagênico e tóxico e somente deve ser

manuseado com luvas e as suas soluções devem ser

adequadamente descontaminadas.

Marcação da sonda

Para marcação isotópica ou não isotópica da sonda utilizar protocolo indicado pelo fabricante.

Hibridização

• incubar as membranas em solução de pre-hibridização (ver

anexo 17.3) por 7 h a 42ºC e em seguida overnight nesta

mesma solução acrescentando 10% dextran sulfato e a sonda

marcada já desnaturada (2x106 cpm/ml);

• recuperar a solução e guardar a -20ºC (para ser utilizada para

nova hibridização);

• lavar a membrana por três vezes rapidamente com SSPE

0,3X/0,5 % SDS, lavar por 1h a 60ºC com SSPE 0,3X/ 0,5 %

SDS (200 ml);

• após as lavagens, checar o sinal com um contador Geiger

(caso seja sonda isotópica) e expor a membrana um filme de

raio X com intensificador a -70ºC;

• após revelação, o filme pode ser analisado por um programa

de densitometria.

Obs 1: a temperatura e o conteúdo da soluções de hibridização

e de pós-hibridização variam (dependendo da natureza da

sonda, tamanho, natureza de suas bases); desta forma as

condições de estringência devem ser determinadas para cada

tipo de sonda e ácido nuclêico a ser estudado. A solução citada

acima foi utilizada para ensaios de revelação de mRNA para

proteína sérica α2macroglobulina utilizando sonda isotópica de

cDNA (50bp) Obs 2: para reutilizar a membrana de náilon para

outras hibridizações, ela deve ser previamente incubada com

uma solução com 0,5% de SDS 40 mM Tris pH 7,8 por 15 min a

80ºC e em seguida mantida a -20ºC.

 

Anexo 17.1 - Soluções para imunohistoquímica

1. Soluções fixadoras

Formalina a 10% em PBS

Fixador de Milloning-Rosman

Fosfato de sódio anidro dibásico 18,4 g Ácido fosfórico (H3PO4) ou difosfórico 1,68 g Água destilada 900 ml Formaldeído Merck 100 ml

• dissolver o sal com água destilada e depois acrescentar o

ácido fosfórico

• deixar esfriar acrescentar o formaldeido

• corrigir o pH se necessário para 7,3-7,4 com solução de NaOH

2. Solução de gelatina para revestimento de lâminas

Gelatina 1 g Alúmem de cromo 0,005 g

H O 100 ml 2

• aquecer a 60-70ºC para dissolver

3. Soluções e tampões para reações de imunohistoquímica com peroxidase

PBS (25X): uso para reações de peroxidase

NaCl 180 g

K HPO anidro 188 g 2 4

NaH PO .H O 33 g 2 4 2

H2O deionizada qsp 1000 ml

Tampão TRIS NaCl 0,05 M (salina tamponada com TBS)

Solução A: TRIS 0,5M 10X pH 7,6

Tris base 0,5M 30,28 g

H O 500 ml 2 dd

Solução B: NaCl 10X 1,5M

NaCl 43,83 g

H O 500 ml 2 dd

Tampão 0,05 M pH 7,6

Solução A 50 ml Solução B 50 ml

H O 400 ml 2 dd

TRIS-HCl 0,2M pH 9,5

Solução A: TRIS 0,8 M

TRIS 24,23 g

H O 1000 ml 2 dd

Solução B: HCl 0,2N

HCl1 0,73g

H O 100 ml 2 dd

Tampão 0,2 M pH 9,5

Solução A 25 ml

Solução B até pH 9,5

H O 100 ml 2 dd

1 densidade específica: 1,19

Tampão acetato 0,1M pH 5,2

Solução A

Acetato de sódio (CH COONa.3H O) 0,1M 13,6 g 3 2

H O 1000 ml 2 dd

Solução B

Ácido acético glacial 0,1N 575 ml

H O 1000 ml 2 dd

Tampão 0,1 M pH 5,2

Solução A 79

Solução B 21

AEC (amino-etil carbazol) (substrato para peroxidase)

Solução estoque AEC

AEC 120 mg N, N, dimetilformamida 15 ml

Solução trabalho 1

AEC estoque 0,5 ml Tampão acetato 9,5 ml

H O 3 % 50 µl 2 2

1 misturar bem

DAB (diamino benzidina) (substrato para peroxidase)

Solução de uso DAB1 DAB 6 mg Tampão Tris 0,05M, pH 7,6 10 ml

H O 3 % 100 ml 2 2

1 preparar no momento de usar. Evitar inalação ou contato direto

com a pele; a solução deve ser filtrada se ocorrer precipitação

4. Soluções para reações de fosfatase alcalina

• solução de lavagem: TBS 0,05 M pH 7,6 (o mesmo usado em

reações para peroxidase)

• TBS/BSA 1%

• TBS/leite desnatado 5%

• TBS/soro normal 4%

Soluções estoque para fosfatase alcalina

X-fosfato 50X 19 mM1 X-fosfato (5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) 7 mg DMF (dimetilformamida) 1 ml

NBT 50X 20,5 mM 1

NBT (cloreto de nitro-blue tetrazólio) 16,7 mg DMF 1 ml

MgCl 100 mM 2

MgCl .6H O 0,95 g 2 2

H O 100 ml 2

1 preparar alíquotas de 200 µl e congelar

Meio de incubação para fosfatase alcalina

conc. final (mM)

TRIS-HCl 0,2M pH 9,5 9 ml X-fosfato 19 mM 200 ml 0,38 NBT 20,5 mM 200 ml 0,41 MgCl2 100 mM 1 ml 10

• dissolver primeiro X-fosfato e NBT em dimetilformamida 70%

Obs: o produto formado é azul, insolúvel em água

5. Meio de montagem para lâminas com cortes congelados

Gelatina 10 g

H O 60 ml 2 ddd

Glicerina 70 ml Fenol líquido 1 ml

• misturar a gelatina com a água, aquecer para dissolver

(banho-maria, placa ou direto no fogo)

• adicionar glicerina e fenol

6. Soluções para contracoloração de criocortes

Hematoxilina de Mayer (solução estoque) Hematoxilina (cristais) 1 g

H O 1000 ml 2 ddd

Iodato de sódio 0,2 g Alúmem de amônia ou potássio 50 g Ácido cítrico 1 g Hidrato de cloral 50 g

• dissolver a hematoxilina em água, usando aquecimento, se

necessário

• adicionar o iodato de sódio e o sulfato de alumínio

• misturar até que o sulfato de alumínio esteja completamente

dissolvido

• adicionar o ácido cítrico e o hidrato de cloral

• guardar em vidro apropriado. Evitar usar logo após o preparo

Obs: a cor final é violeta avermelhada

 

Anexo 17.2 - Soluções para microscopia

eletrônica

1. Tampões para microscopia eletrônica

Tampão fosfato 0,1M

Solução A (fosfato monossódico) 0,2 M

NaH PO .2H O (PM 156) 15,6 g 2 4 2

H2O qsp 100 ml ddd

Solução B (fosfato dissódico) 0,2 M

Na HPO .12H O (PM 358) 35,8 g 2 4 2

H2O qsp 100ml ddd

Tampão 0,1 M pH 7,2

Solução A 28 ml

Solução B 72 ml

H2O 100 ml ddd

Tampão 0,1 M pH 7,4

Solução A 19 ml

Solução B 81 ml

H2O 100 ml ddd

Tampão cacodilato de sódio-HCl 0,1M

Solução estoque de cacodilato 0,2 M

Na(CH ) AsO .3H O (PM 214) 42,8 g 3 2 2 2

H2O qsp 100 ml ddd

Tampão cacodilato 0,2M

Solução estoque 0,2M

HCl 0,2 N gotejar até atingir o pH desejado Tampão cacodilato 0,1 M pH 7,2

Solução estoque 50 ml

HCl 0,2M 4,2 ml

H2O qsp 100 ml ddd

Tampão cacodilato 0,1 M pH 7,4

Solução estoque 50 ml

HCl 0,2N 2,7 ml

H2O qsp 100 ml ddd

2. Soluções de fixadores

• glutaraldeído (GA) (HOC.(CH ) .COH) é comercializado em 2 3

soluções nas concentrações de 25% e 50%;

• paraformaldeído (PFA) (CH O)n (trioximetileno), um polímero 2

do formol, é comercializado em pó;

• tetróxido de ósmio (OsO ), comercializado puro, cristalizado, 4

em ampolas de 0,25 g a 5 g.

Solução estoque de PFA

• aquecer 100 ml de H O , adicionar 8 g de PFA e deixar 2 ddd

hidratar por 2-3 min;

• aquecer a solução em torno de 60-80ºC, sob agitação, em

capela de exaustão por 15-30 min;

• adicionar uma-duas gotas de NaOH 1N, para clarear a

solução;

• deixar esfriar e conservar em geladeira em frasco

hermeticamente fechado; Obs: esta solução pode ser feita em

várias concentrações em geral na faixa de 2 a 8%.

Solução estoque de tetróxido de ósmio 2%

• colocar 25 ml H O em um frasco âmbar e reservar; 2 ddd

• lavar bem uma ampola de OsO 500 mg, cortá-la com 4

diamante e quebrá-la;

• colocar os cristais de OsO juntamente com os fragmentos da 4

ampola e colocar dentro do frasco com os 25ml H O ; 2 ddd

• deixar o OsO4 dissolver durante uma noite a temperatura

ambiente;

• conservar o frasco contendo a solução a 2% envolvido com

papel alumínio na geladeira.

Solução fixadora de GA 2,5%

Solução estoque GA 25% 1 ml

Tampão cacodilato 0,1 M pH7,2 9 ml

Solução fixadora de PFA%

Solução estoque PFA 8% 5 ml

Tampão cacodilato-HCl 0,2M 5 ml

Solução fixadora de OsO4 1%

Solução estoque OsO 2% 5 ml 4

Tampão cacodilato-HCl 0,2M 5 ml

3. Agentes desidratantes

• os mais utilizados em técnicas de microscopia eletônica são

os solventes orgânicos acetona, álcool e metanol;

• os agentes desidratantes são diluídos em H O nas 2 ddd

concentrações de 15, 30, 50, 70 e 90% e conservados em

geladeira.

4. Resinas

As mais utilizadas para rotina em microscopia eletrônica de transmissão são as resinas Epoxi (Epon, Araldite e Spurr) com polimerização a 60ºC.

As resinas Lowicryl (K4M e HM20) com polimerização a -20ºC sob luz ultravioleta e as resinas London (LR-White e LR-Gold) são mais usadas em estudos onde precisam ser preservados os sítios antigênicos das estruturas celulares.

Preparo da resina Epon

• colocar em uma proveta bem limpa 25 ml de Epon 812;

• adicionar 17 ml de MNA;

• misturar durante 3 min sem formar bolhas;

• adicionar 32 gotas de DMP-30 e continuar misturando por 30

min a temperatura ambiente

Obs: a resina já pronta deve ser colocada em recipiente bem

fechado e conservada no congelador da geladeira. Ela não

deve permanecer fora da refrigeração devido à polimerização

começar a ocorrer mesmo a temperatura ambiente. Para ser

usada ela deve ser retirada com antecedência para o

descongelamento.

5. Polivinil pirolidina (PVP - 10) para criocortes

PVP-10 3 g

H O 2,4 ml 2

Na CO 1,1 M 0,6 ml 2 3

Sacarose 2,3 M 7 ml

• misturar e deixar secar por uma noite na geladeira (solução

estável por poucas semanas a 4ºC)

• antes do uso adicionar 10% de volume de H O destilada ou 2

0,1 M tampão fosfato (solução não estável)

 

Anexo 17.3 - Soluções para uso em hibridização

Solução D1

Isotiocianato de guanidina 11,81 g Citrato de sódio 75mM pH 7,0 8,33 ml Sarcosil 10% 1,25 ml

H O-DEPC completar para 25 ml 2

1 Chomczynski et al. 1987.

• dissolver a 65ºC;

• acrescentar 7,2 ml de 2-mercaptoetanol por ml de solução

(180 ml para 25 ml);

• concentrações finais: isotiocianato de guanidina 4M; citrato de

sódio 25mM, sarcosil 0,5% p/v; e 2mercaptoetanol 0,1M.

Solução A1

10 mg de RNA em formamida 10 ml

Formamida deionizada 2,5 ml

GLB 2,5 mg/ml 3 ml

H O-DEPC 2,5 ml 2

Formaldeído 37% 4 ml

Brometo de etídeo 5 mg/ml 0,5 ml

Tampão MOPS 10X pH 8,0 2,5 ml

1 Lorent et al., 1994

• concentrações finais: formamida 50%, formaldeído 6%,

brometo de etídio 0,1 mg/ml, MOPS 1X.

Tampão SSPE 20X

Cloreto de sódio 175,3 g

Fosfato de sódio NaH PO . 2H O 31,2 g 2 4 2

EDTA 0,5M pH 8,0 40ml

H O-DEPC 800 ml 2

• ajustar o pH para 7,4 e completar o volume para 1 litro

• adicionar 1 ml de DEPC, homogenizar, incubar overnight e

autoclavar.

• concentrações finais: cloreto de sódio 3M, fosfato de sódio

0,2M, EDTA 0,02M.

Solução de pré-hibridização

SSPE 20X 12,5 ml

Denhardts1 100X 2,5 ml

SDS 10% 2,5 ml

Formamida 25 ml

DNA de salmão desnaturado 10 mg/ml 500 ml

heparina 10 mg/ml 250 ml

H O-DEPC 6,75 ml 2

1 2% PVP, 2% BSA, 2% Ficoll-400

• concentrações finais: SSPE 5X, Denhardts 5X, SDS 0,5%,

formamida 50%, DNA 100 mg/ml, heparina 50 µg/ml

Gel de agarose 1%

Agarose 1 g

MOPS 10X 10 ml

H O-DEPC 75 ml 2

• aquecer até dissolução da agarose

• manter em banho a 60ºC por 10 min e acrescentar 17 ml de

formaldeído (37%)

• misturar bem

Tampão MOPS 10x pH 7,0

3-(morpholene) propane-sulfonic acid 41,86 g

Acetato de sódio 3M pH 7,0 16,6 mg

EDTA 0,5M pH 8,0 20 ml

H O-DEPC 900 ml 2

• ajustar o pH para 7,0, completar o volume para 1 litro com

H O-DEPC 2

• adicionar 1 ml de DEPC, homogenizar, incubar overnight e

autoclavar

• concentrações finais: MOPS 0,2 M, acetato de sódio 0,05 M,

EDTA 0,01 M.

GLB 2,5 mg/ml

Azul de bromofenol 50 mg Glicerol 10 ml

H O-DEPC 10 ml 2

H O-DEPC 2

DEPC 1 ml

H O-DEPC 1000 ml 2

• homogenizar bem, incubar overnight à temperatura ambiente

e autoclavar

 

Referências bibliográficas

CHOMCZYNSKI, P. & SACCHI, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162:156-159, 1987.

LORENT, K.; OVERBERGH, L.; VAN LEUVEN, F. & VAN DEN BERGHE, H. Distribution of mRNA coding for α-2-macroglobulin, the murinoglobulins, the α-2-macroglobulin receptor and the α-2-macroglobulin receptor associated protein during mouse embryogenesis and in adult tissues. Differentiation 55:213-223, 1994.