Capítulo 13 - Sangria de animais e preparo de inóculos para infecção experimental

Capítulo 13 - Sangria de animais e

preparo de inóculos para infecção

experimental

 

Tania C. Araújo-Jorge; Maria Teresa Rivera; Solange L. de Castro; Marcos Antônio P. Marques

 

13.1 Métodos de sangria

Tanto para a análise hematológica dos animais antes da infecção (ver Capítulo 12) como para se obter o sangue que será usado no preparo do inóculo, pode-se proceder tanto por sangria total do animal infectado, por punção cardíaca, como por sangria parcial, pela cauda ou plexo orbital. O sangue deverá ser colhido em anticoagulante e diluído em solução salina fisiológica.

USAR LUVAS, MÁSCARA E GUARDA-PÓ DE

MANGAS COMPRIDAS

13.1.1 Sangria pela cauda

Objetiva preparar lâmina para contagem de parasitemia, esfregaço para contagem leucocitária, medida do hematócrito e coleta de plasma.

Material

• caixa de contenção do animal

• tesoura de ponta fina e afiada

• algodão

• capilares heparinizados para microhematócrito e borracha de

sucção do capilar

• massa plástica para vedação do capilar

• suporte plástico para capilar com marcação milimetrada

• lâminas de vidro para esfregaço sangüíneo

• fósforos

• tubos de microcentrífuga

• caneta de diamante

• centrífuga de microhematócrito

• caixas de descarte de material com as soluções desinfetantes

apropriadas.

Procedimento

• identificar os capilares, as lâminas e os tubos que serão

utilizados para o recolhimento de sangue dos diferentes

camundongos;

• colocar o camundongo na caixa de contenção, com a cauda

para fora;

• com uma das mãos, massagear a cauda no sentido da base

para a ponta e segurar na ponta;

• com a tesoura na outra mão, cortar 1 mm ou menos da ponta

da cauda;

• recolher uma gota para o preparo de esfregaço, que deve ser

feito imediatamente por uma segunda pessoa. Caso seja feita a

contagem de hemáceas ou leucócitos basta recolher uma gota

do sangue sobre placa de Petri que será então utilizada para o

procedimento de diluição e contagem;

• segurar a cauda do animal com as duas mãos e tornar a

repetir o massageamento da base para a ponta, até aparecer

nova gota, que será recolhida no capilar heparinizado (atenção:

a ponta do capilar que contém a heparina geralmente é

marcada com vermelho). Basta encostar a ponta heparinizada

do capilar na cauda do animal e o sangue é transferido

naturalmente para o seu interior;

• colocar o capilar horizontalmente sobre o suporte milimetrado

e repetir o procedimento do item quinto acima (recolher uma

gota para o preparo do esfregaço...) até encher o capilar do

volume necessário (cada mm de capilar corresponde a 1 µl de

sangue);

• ao final, colocar verticalmente o capilar sobre a massa plástica

para vedá-lo;

• cauterizar a cauda do camundongo com fósforo;

• centrifugar o capilar em centrífuga de microhematócrito;

• ler o hematócrito contra régua própria ou régua simples de

marcação milimetrada, caso o volume retirado seja menor que

70 µl de sangue;

• colocar o capilar sobre um suporte e riscar com a caneta

diamante logo acima do creme leucocitário;

• quebrar o capilar em suas partes de plasma e células e

transferir o plasma para um tubo de microcentrífuga, com o

bulbo apropriado;

• congelar o plasma para análises posteriores.

No caso de trabalho com animais infectados, ao invés de vedar o capilar verte-se o sangue diretamente num tubo de microcentrífuga para a contagem de parasitas e o preparo da diluição do inóculo. Pode-se colher também diretamente o sangue no tubo de microcentrífuga, mas para que não coagule é necessário molhar a ponta da cauda com anticoagulante (heparina).

13.1.2 Sangria por punção do plexo orbital

Nos pequenos animais de laboratório a punção de uma veia é delicada, não permitindo a retirada de uma quantidade considerável de sangue e é difícil a sobrevida do animal quando obtemos uma quantidade significativa de sangue. É preferível recorrer à técnica preconizada por Hoffmann, que consiste em puncionar o plexo orbital existente nos mamíferos, entre o glóbulo ocular e o fundo da cavidade orbitária.

Material

• tubos capilares heparinizados

• tubos de microcentrífuga

• colírio anestésico (cloridrato de proximetacaína 0,5%)

Procedimento

• a contenção do animal é realizada pela região cervical, de

modo que automaticamente provoque uma estase venosa na

região cefálica, provocando a exteriorização do glóbulo ocular;

• após a exteriorização do glóbulo ocular deve-se instilar uma

pequena gota do colírio anestésico;

• introduzir o tubo capilar verticalmente entre o glóbulo ocular

exposto e o fundo da cavidade orbitária;

• realizar uma ligeira pressão acompanhada de movimentos de

rotação do tubo capilar;

Obs: assim que o plexo orbital é puncionado, o sangue

preenche espontaneamente o tubo capilar. O relaxamento da

pressão exercida sobre a região cervical, utilizada para conter o

animal, faz cessar consideravelmente o fluxo sangüíneo.

• transferir o sangue recolhido para um tubo de microcentrífuga,

previamente identificado.

Obs: a técnica de punção do plexo orbital pode ser novamente

realizada 72 h após a primeira punção.

13.1.3 Sangria por punção cardíaca

Material

• placa de cortiça com quatro agulhas para fixação do animal

• câmara de anestesia (vidro de boca larga, com tampa, e

algodão no fundo)

• éter etílico para anestesia

• tubos de microcentrífuga

• pissete com álcool

• seringas de 1 ml com agulhas de ponta fina e curta (13X4,5)

• anticoagulante (heparina ou citrato de sódio 3,8%)

• caixas de descarte de material com as soluções desinfetantes

apropriadas

Procedimento

• colocar o camundongo infectado na câmara anestésica;

• preparar a seringa com anticoagulante enquanto o animal está

sendo anestesiado: 0,1 ml de citrato de sódio 3,8% para cada 3

ml de sangue ou molhar a seringa com heparina;

• fixar o camundongo na placa, em posição de cruz;

• segurar a seringa com a mão direita (para dextros) e

puncionar sobre o terceiro espaço intercostal (esquerdo) do

camundongo;

• inserir a agulha de modo a perceber a perfuração da pele e do

pericárdio;

Obs: o sangue jorrará assim que a agulha estiver dentro do

ventrículo esquerdo do coração.

• aspirar lentamente com o embolo até completar 1 ml;

• retirar a seringa, descartar a agulha no recipiente apropriado e

colocar o sangue no tubo de microcentrífuga;

• sacrificar o animal, caso não tenha ocorrido sua morte, através

de overdose do anestésico ou por deslocamento cervical;

• descartar o animal em saco plástico mergulhando-o em formol

4%.

 

13.2 Inoculação

13.2.1 Escolha da via de inoculação

Diversas vias de inoculação podem ser usadas para a infecção por Trypanosoma cruzi, sendo mais comuns a subcutânea (SC) e a intraperitoneal (IP). Todas dão o mesmo resultado, com alguma diferença na cinética da parasitemia. A infecção também se transmite por inóculo via oral, mas não há muitos estudos comparando a resposta usando diferentes vias com diferentes modelos experimentais.

13.2.2 Cálculo e preparo do inóculo

Inóculo/animal

• mínimo: 102 (próximo ao fisiológico)

• médio: 103 4 a 10

• alto: 105 8 a 10

Material

• solução estoque de parasitas

• diluente: solução salina fisiológica (NaCl 0.85%), Alsever, etc.

• seringa de 1 ml

Preparo do inóculo intraperitoneal

Obs: recomenda-se dobrar o volume necessário para se trabalhar com folga.

Exemplo: para infecção de vinte animais com 104/animal em 200 ml, necessita-se de 4 ml (vinte animais x 200 ml) (utilizar o dobro, 8 ml, como dito acima) de um inóculo na concentração de 5.104/ml

• sendo, por exemplo, a solução estoque de parasitas = 40.105

parasitas/ml, deve-se diluir esta suspensão

• fórmula para diluição V N = V N 1 1 22

• vol x 400.104 4 = 8 x 5.10

• vol = 0,1 ml

• preparo da diluição = 0,1 ml da sol. estoque de parasitas + 7,9

ml diluente

Obs: no caso de inoculação SC, os cálculos devem ser feitos

para um volume de 100 ml, ou seja, 104/animal em 100 ml,

necessitandose de 4 ml (utilizar o dobro 8 ml, como dito acima)

de um inóculo na concentraçao de 10 x 104/ml.

 

Referências bibliográficas

CARVALHO, W. F. Técnicas Médicas de Hematologia e Imunohematologia. 1983. Cooperativa Editora e de Cultura Médica, Ltda.

GARCIA-NAVARRO, C. E. K. & PACHALY, J. R. Manual de Hematologia Veterinária. 1994. Editora Vanela.

HOFFMANN, G. Les animaux de laboratoire. 1963. Paris: Vigot Fréres.

RULIER, J. & PARODI, A. Laboratoire et diagnostic en Médicine Véterinaire. 1968. Paris: Vigot Fréres.