10.2 Trypanosoma cruzi: cepas de eleição

Finalmente, fatores que podem não ser decisivos, mas que certamente são importantes, referem-se às condições operacionais. Estas vão desde a experiência prévia do grupo no uso de determinado modelo e a necessidade de incorporação de pessoal com experiência de manejo do animal a ser usado, até o custo, a disponibilidade de fornecimento e as condições laboratoriais e de infectório para manejo dos animais normais e infectados que comporão os grupos experimentais. As condições ambientais para a experimentação também podem ser limitantes ou decisivas para a escolha do modelo a ser empregado. Por exemplo, o trabalho com fêmeas requer a existência de salas especiais isoladas apenas para este gênero, pois a presença de machos na sala pode gerar sensações olfatórias que levem a alterações no ciclo estral das fêmeas, que por sua vez podem potencialmente interferir na sua imunidade inata. Já o trabalho com cães ou macacos implica condições laboratoriais e de infectório específicas para estes casos. As condições psicológicas da equipe para lidar com os animais também são fatores importantes, pois podem influir quando o pesquisador ou técnico precisar sacrificar fêmeas grávidas, cães ou macacos submetidos a longos períodos de observação.

Trypanosoma cruzi: cepas de eleição

Octavio Fernandes; David A. Campbell

Tradicionalmente o Trypanosoma cruzi apresenta como característica uma grande diversidade genética intraespecífica, demonstrada por diferentes técnicas bioquímicas e moleculares, se tratando na realidade de um complexo heterogêneo de subpopulações. As análises realizadas por distintos métodos sempre procuraram correlacionar características genéticas com propriedades biomédicas do parasito.

Uma das primeiras metodologias aplicadas em diversos isolados, clones e cepas de T. cruzi foi o perfil de restrição do kDNA. Esta técnica agrupou determinadas populações dos parasitos através dos padrões apresentados pelos fragmentos de restrição do DNA mitocondrial, em grupos denominados esquizodemas (Morel et al., 1980; Morel & Simpson, 1980). O potencial desta metodologia foi explorado em diferentes contextos e conseguiu atestar que o hospedeiro vertebrado se encontra parasitado por uma população de T. cruzi, que pode ser selecionada por distintos filtros como hemocultura, xenodiagnóstico, cultura in vitro e mesmo a própria interação parasito-hospedeiro (Deane et al., 1984; Morel et al., 1986).

De forma consistente com os achados de heterogeneidade obtidos com os padrões de restrição do kDNA, Morel et al. (1984), Macina et al. (1987) e Solari et al. (1991), ao utilizarem a rede de DNA mitocondrial como sonda para tipagem, obtiveram resultados que discriminavam distintos grupos de isolados. Com o desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante, regiões de hipervariabilidade puderam ser clonadas e utilizadas como sondas moleculares. Assim, as regiões variáveis dos minicírculos mostraram o seu relógio molecular veloz e conseqüente poder discriminatório (Macina et al., 1987).

A técnica de PCR veio contribuir para o estudo da heterogeneidade populacional de T. cruzi, principalmente por dispensar o cultivo prévio do parasito, que seleciona in vitro subpopulações do protozoário (Morel et al., 1986). Dessa forma, Sturm et al. (1989) amplificaram a região variável dos minicírculos (330 pb) e utilizaram os amplicons como substrato para digestão com endonucleases de restrição, produzindo um experimento esquizodemalike e obtendo padrões de bandas complexo. Avila et al. (1990), Brenière et al. (1992) e Britto et al. (1995), após amplificarem regiões variáveis de isolados de T. cruzi, realizaram experimentos de hibridização cruzada entre os amplicons, demonstrando que este segmento da molécula de minicírculo possui alta especificidade, revelando uma grande heterogeneidade entre os distintos isolados utilizados.

Macedo et al. (1992) descreveram o uso da técnica de fingerprint do DNA total do parasito, mostrando a sua capacidade de desvendar também a heterogeneidade presente dentro do taxon, possuindo uma boa correlação com a análise por esquizodemas.

Um dos alvos sempre procurados foi a tentativa de se correlacionar marcadores genéticos com propriedades biológicas e ou determinantes de patogenicidade ou formas clínicas.

Algumas destas abordagens de tipagem e agrupamento apresentam resultados tão heterogêneos que a sua aplicabilidade passou a ser questionada. Por exemplo, podemos citar a plasticidade existente entre os cariótipos moleculares de T. cruzi. Os resultados destes experimentos são variáveis e muitos fatores podem determinar diferentes padrões de migração de cromossomos ou localização de genes específicos. Relatos de amplificação gênica, expansão e contração teloméricas, elementos transponíveis (transposons) e aneuploidias poderiam eventualmente justificar a extensa heterogeneidade encontrada ao utilizar-se esta metodologia, mesmo entre subclones de um mesmo ancestral clonal ou cepas isoladas de um único paciente (Gibson & Miles, 1986; Engman et al., 1987; Iovannisci & Beverley, 1989; Wagner & So, 1990; McDaniel & Dvorak, 1993).

Em estudos iniciais, a análise dos padrões eletroforéticos de enzimas pareceu ser muito promissora, no que diz respeito a associar distintos zimodemas com padrões de transmissão doméstico e silvestre. Assim, Miles et al. (1977), ao investigarem dezessete isolados do protozoário provenientes do município de São Felipe, Bahia, determinaram dois grupos distintos de zimodemas: o primeiro, composto por isolados de gambá e triatomíneos silvestres e o segundo formado pelos isolados humanos e de animais domésticos, como gatos, ratos e camundongos.

Este mesmo grupo de autores ampliou a classificação dos grupos isoenzimáticos, após estudar seis isolados humanos da região amazônica (Miles et al., 1978) e cerca de 250 isolados de diversas localidades brasileiras (Miles et al., 1980), definindo três grupos característicos: o primeiro e o segundo, como descrito em São Felipe, que passaram a denominar de Z1 e Z2, e o terceiro (Z3) também relacionado ao ciclo silvestre. Confirmando as correlações biológicas dos zimodemas com os padrões de transmissão, Ready & Miles (1979) mostraram, através de análise de taxonomia numérica, que Z1 é mais relacionado com Z3 que com Z2. Ainda respeitando esta tripla classificação, Flint et al. (1984) conseguiram definir anticorpos monoclonais que reagiam especificamente com Z1, Z2 ou Z3.

Acostumados com a tradicional polaridade de T. cruzi, formas finas ou grossas, fase aguda ou crônica, forma cardíaca ou digestiva, cepa Y ou CL, ciclo silvestre ou doméstico, era de se esperar que ficássemos com a classificação isoenzimática e imunológica de Z1+Z3 e Z2 (Brener & Andrade, 1979; Miles & Cibulski, 1986). Entretanto, poucos anos depois de estabelecido este padrão, alguns pontos discordantes começaram a aparecer. Tibayrenc et al. (1986) analisaram o padrão eletroforético de quinze enzimas em 121 isolados provenientes dos mais diferentes sítios, englobando as Américas do Norte, Central e do Sul. Neste estudo, os autores estabeleceram 43 zimodemas diferentes, e apesar de atestarem uma grande heterogeneidade intragrupo, se aventuram em aglutinar os isolados em dois clusters distintos, exibindo um alto grau de polimorfismo genético interno.

O uso da técnica de PCR com iniciadores randômicos para gerar RAPDs (random amplified polymorphic DNAs), trouxe a possibilidade de se estudar vários loci em um único experimento. Assim, Tibayrenc et al. (1993) demonstraram uma grande correlação entre os ensaios de RAPD e os perfis eletroforéticos das enzimas, definindo igualmente os dois clusters supracitados.

Henriksson et al. (1996) relatam também uma certa correlação entre os padrões de cariótipo molecular e localização de distintos genes e os zimodemas de T. cruzi: Z1 e Z2. Pontuam que os isolados Z2 apresentam cromossomos maiores que cepas Z1 e afirmam que esta característica suporta a distância genética entre os dois grupos isoenzimáticos, podendo refletir um fenômeno de especiação dentro do taxon T. cruzi.

Fugindo um pouco do tradicional polimorfismo, Souto & Zingales (1993) estudaram o gene codificante para o rRNA 24Sa (subunidade maior) em vários isolados de T. cruzi. Utilizando a técnica de PCR como abordagem experimental, clonaram e seqüenciaram dois produtos distintos provenientes de diferentes isolados, conseguindo definir dois grupos dentro da espécie T. cruzi: grupo 1 (rDNA1) e grupo 2 (rDNA2). Após um estudo pormenorizado das seqüências dos genes de miniexon de diferentes isolados de T. cruzi (Fernandes et al., 1998), constataram-se dois grupos distintos que possuíam concordância com os grupos descritos por Souto & Zingales (1993). Análise por RAPD dos distintos isolados tipados, tanto através da seqüência codificante para o rRNA 24Sa como para o gene de miniexon, definiu duas linhagens principais em T. cruzi, ambas polimórficas e subdivididas em pequenos grupos: linhagem 1

e linhagem 2 (Souto et al., 1996), como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 – Tipagem de diversos estoques de Trypanosoma cruzi

através da dicotomia presente nos genes de miniexon e rRNA

Isolado Origem Linhagem Isolado Origem Linhagem (país) (país) Ana /BR Homem 1 Cuíca Roedor 2

cl1 /BR

Basileu Homem 1 Cutia cl1 Roedor 2 /BR /BR C1 /BR Homem 2 Esquilo Roedor 2

cl1 /BR

Esmeraldo Homem 1 F /BR Roedor 2 cl3 BR

JM /BR Homem 1 M226 Roedor 2

/BR

MAS cl1 Homem 1 G /BR Gambá 2 /BR

MC /BR Homem 1 Gambá Gambá 2

cl1 /BR

Tatiana Homem 1 Dm28 Gambá 2 /BR /VEN Sylvio X10 Homem 2 CL /BR Triatom. 1 /BR

Y /BR Homem 1 CL Triatom. 1

Brener

/BR

CBB cl3 Homem 1 YuYu Triatom. 2 /CH /BR MN Homem 1 Tulahuen Triatom. 2 cl2/CH /CH NR cl3 Homem 1 OPS 22 Triatom. 2 /CH /VEN CA 1 Homem 1 /ARG

Ao tiparmos amostras de T. cruzi recém-isoladas de hospedeiros humanos e de triatomíneos de distintas localidades brasileiras (Amazonas, Minas Gerais, Paraíba e Piauí), observarmos que os isolados da Amazônia correspondem à linhagem 2, condizentes com o ciclo de transmissão silvestre, enquanto todos os outros isolados humanos do restante do país são linhagem 1 (ciclo doméstico). A nossa impressão é de estarmos tendo a oportunidade de presenciar um fenômeno ímpar, que seria a interação do hospedeiro humano com o ciclo silvestre, peculiar da Amazônia (Fernandes et al., 1998).

Partindo-se do conceito de heterogeneidade populacional de T. cruzi, até atingirmos, pelo conceito dicotômico trazido pela caracterização pelo gene ribossômico 24Sa ou de miniexon, quais serão as cepas de eleição para se estudar T. cruzi? A resposta desta questão permeará o ponto específico de futuras investigações. O que pode ficar estabelecido é que a atual visão de dicotomia das distintas populações de T. cruzi nos indica a existência de duas unidades taxonômicas distintas dentro do taxon. Somente futuras correlações biomédicas e epidemiológicas poderão dar o aval a uma eventual separação de T. cruzi em mais de uma espécie. Em simpósio internacional recente (ver Anexos, Capítulo 20) foram adotadas recomendações para padronizar e uniformizar a denominação do isolado de T. cruzi, de modo a facilitar informações sobre sua origem (hospedeiro do qual foi isolado, ano de isolamento), a designação e numeração dada pelo laboratório que o isolou e o grupo de T. cruzi ao qual pertence. Assim, foi proposta a designação operacional, T. cruzi I e T. cruzi II, para isolados de

parasitas com as características da Tabela 3. T. cruzi # está recomendado para a designação de qualquer isolado que não puder ser enquadrado completamente em I ou II, por ausência de uma caracterização completa, ou por se enquadrar em cepas aparentemente híbridas, como Zimodema 2b ou 3 (Miles et al., 1980, 1981), Zimodema B (Romanha et al., 1979), Tipo I (Andrade, 1974), Locus 1/2 (tipadas por rDNA 24Sa (Souto et al., 1996), clonadas como 39 (Tibayrenc et al., 1993), que aguardam estudos mais aprofundados. De um modo geral o T. cruzi I circula no ciclo silvestre e o T. cruzi II no ciclo doméstico de transmissão do T. cruzi.

Tabela 3 – Nomenclatura operacional para os isolados de

Trypanosoma cruzi em dois grandes grupos proposta em abril de

1999 (ver Anexo, Capítulo 20)

Parâmetro T. cruzi I T. cruzi II

Zimodema 1 ou 2 (1) 1 2

Zimodema A (2) A

Biodema II ou III (3) III II

Ribodema I, II ou III (4) II/III I

Grupo 1 ou 2 (5) 1 2

Linhagem 1 ou 2 (6) 2 1

1. Miles et al., 1978; 2. Romanha et al., 1979; 3. Andrade, 1974;

4. Clark & Pung, 1994; 5. Tibayrenc et al.,1993; 6. Souto et al.,1996

Tabela 4 – Exemplo de nomenclatura dos isolados de Trypanosoma

cruzi usados muito freqüentemente em estudos de infecção

experimental

Isolado (designação Designação proposta corrente) (1999) Y MHOM/BR/00/Y (T.cruzi II) Tulahuen TINF/CH/00/Tulahen (T.cruzi

I)

Colombiana MHOM/CO/00/Colombia

(T.cruzi I)

Sylvio - X10 MHOM/BR/78/Sylvio - X10

(T.cruzi I)

Dm28c MDID/BR/82/Dm-28c

(T.cruzi I)

Peru MHOM/PE/00/Peru (T.cruzi

#)

21-SF MHOM/BR/00/12-SF (T.cruzi

#)

Esmeraldo MHOM/BR/77/Esmeraldo

(T.cruzi II)

Berenice MHOM/BR/62/Berenice

(T.cruzi II)

No Projeto Genoma de T. cruzi foi escolhido o clone CL-Brener, tipado como linhagem 1, representativo do parasita circulante no ciclo doméstico, e capaz de reproduzir em animais experimentais o comportamento biológico majoritário do T. cruzi em pacientes

chagásicos. Na Tabela 5 estão sumarizados dados básicos sobre a cepa CL e o clone CL-Brener, tal como descrito na referência do Projeto Genoma. Os experimentos comparativos entre a cepa parental e o clone CL-Brener conduziram a resultados semelhantes, exceto quanto às curvas de parasitemia de camundongos Balb/C com formas tripomastigotas metacíclicas, quando a parasitemia com a cepa parental indica níveis significativamente mais altos que o clone.