Doença de Chagas: Manual para Experimentação Animal
18.2 Protocolos de cultura primária
Juntos, estes resultados mostram que o T. cruzi, ao invadir o músculo cardíaco, precisa do controle absoluto sobre seu hospedeiro e, para tanto, desliga a comunicação celular, altera a freqüência cardíaca e é o coordenador dos danos iniciais simultâneos que afetam a funcionalidade do coração na doença de Chagas experimental e humana.
18.2 Protocolos de cultura primária
Helene S. Barbosa; Mirian C. S. Pereira; Maria de Nazareth S. L. Meirelles
18.2.1. Células Musculares
Culturas primárias compreendem células derivadas diretamente de um órgão ou tecido. Basicamente, o tecido isolado é fragmentado em pequenas peças com bisturi e pinça, dissociado com enzimas proteolíticas, dando origem a células individualizadas que serão cultivadas em meio nutritivo, in vitro. Células musculares são dependentes de ancoragem, requerendo substrato sólido para promover a sua proliferação, metabolismo e diferenciação. O emprego de tecidos embrionários permite o acompanhamento do processo de miogênese, com a vantagem de serem estéreis desde o início do isolamento. Este tipo de tecido apresenta desagregação fácil e as células isoladas têm alta capacidade de adesão ao substrato, alta motilidade e excelente índice de multiplicação e diferenciação celular in vitro (Konigsberg, 1960, 1963; Harary & Farley, 1963; De Luca, 1966; Kasten, 1973; Yaffe, 1973).
18.2.1.1. Roteiro para obtenção de cultura primária de célula muscular cardíaca (Meirelles et al., 1986)
Material:
• fêmeas de camundongos suíços grávidas com 18 a 20 dias de
gestação
• Ringer
• PBS
• tripsina
• colagenase
• gelatina
• L-glutamina
• cloreto de cálcio (CaCl ) 2
• antibióticos: estreptomicina e penicilina
• meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
• soro fetal bovino
• soro de cavalo
• extrato embrionário de pinto
• bicarbonato de sódio (NaHCO ) 3
• placas de Petri de vidro (100 x 15 mm e 35 x 10mm)
• Erlenmeyer de 50 ml contendo barra magnética (8 x 3mm)
• pipetas Pasteur
• pipetas sorológicas de 2 e 5 ml.
• lamínulas redondas de vidro (15 x 0,13 mm)
• tubos cônicos de 15 ml
Obs: o material deve ser embalado apropriadamente e
esterilizado em autoclave a 1 atm (120ºC) por 20 min.
• pinças de ponta dente de rato (12 cm) e ponta curva (10 cm),
tesoura cirúrgica ponta curva ou reta (12 cm) e bisturi (15 cm)
• gaze estéril
• placa de cortiça e alfinete
• câmara mortuária
• material plástico para plaqueamento (garrafas de 25 cm2,
placas de 24 poços, placas de 35 mm)
Procedimento:
• anestesiar as fêmeas grávidas em câmara mortuária contendo
éter etílico. Levar o animal para o fluxo laminar, fixá-lo na placa
de cortiça e esterilizar a área de dissecção (área abdominal)
com álcool a 70%;
• abrir o abdômen expondo a membrana peritoneal. Com
material cirúrgico estéril, abrir a cavidade peritoneal e remover o
útero contendo os embriões, transferindo-os para uma placa de
Petri (100 x 15 mm) contendo solução de Ringer no gelo;
• decapitar os embriões e abrir a cavidade torácica na altura do
osso externo. Remover os corações e transferi-los para com
placa de Petri (35 x 10 mm) contendo solução de Ringer. Retirar
os átrios e os vasos da base de cada coração e fragmentar os
ventrículos sobre lâmina escavada, transferindo os fragmentos
para outra placa de Petri (100 x 15 mm) com placa de Petri (35
x 10 mm) contendo solução de Ringer no gelo;
• transferir os fragmentos para Erlenmeyer (50 ml) contendo
barra magnética, lavar 2x em solução de Ringer para remoção
das células sangüíneas e posteriormente lavar em PBS (sem
cálcio e magnésio) sob agitação por 5 min a 37º C;
• iniciar o procedimento de dissociação enzimática:
■ Solução de dissociação: 0,025% tripsina + 0, 01% de colagenase (solução estéril e previamente aquecida em banho-Maria) a 37ºC
■ expor os fragmentos do tecido à dissociação seqüencial por 5 min cada etapa a 37ºC, sob agitação magnética, até completa digestão do tecido
■ recolher o líquido de dissociação contendo as células isoladas e transferi-lo para tubos de centrífuga (15 ml) contendo 2 ml de meio DMEM completo, suplementado com 0,5 ml de soro fetal bovino. Manter os tubos no gelo a fim de inativar a atividade enzimática. Marcar os tubos a cada etapa da dissociação
■ controlar ao microscópio óptico de contraste de fase: o padrão morfológico, a viabilidade celular e o número de células obtidas, após cada dissociação
• centrifugar os tubos com células a 1800 rpm (500g) por 5 min.
Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM
completo. Repetir este procedimento 2x, objetivando lavar as
células e eliminar a presença das enzimas proteolíticas. Manter
as células no gelo até o seu plaqueamento;
• utilizar uma alíquota da suspensão celular para avaliação do
número de células em câmara de Neubauer;
• iniciar o plaqueamento seqüencial para obtenção de culturas
ricas em mioblastos: plaquear as células (0,8-1x106 células) em
garrafas 25 cm2 previamente revestidas com gelatina 0,01%;
Obs: A gelatina é colocada nas garrafas por 15 min a 4 ºC e
posteriormente removida, sendo as garrafas mantidas em
estufa a 37ºC em atmosfera de 5% de CO até o momento do 2
plaqueamento. Este revestimento com gelatina propicia uma
melhor adesão das células ao substrato.
• após 15 a 30 min de plaqueamento, alta proporção de
fibroblastos irá aderir ao substrato, devido a sua velocidade de
adesão mais rápida do que os mioblastos. Recolher o
sobrenadante, rico em mioblastos, plaquear as células em
recipientes previamente revestidos com gelatina, como descrito
acima. A densidade celular de plaqueamento varia de acordo
com a área do substrato:
■ placas de 24 poços, com diâmetro de 18 mm: 15 x 10 5
■ garrafas de plásticos de 25 cm 2 6 : 2 x 10
■ placa de Petri com diâmetro de 35 mm: 0,8-1 x 106
• trocar o meio de cultivo após 24 horas, para remoção de
células mortas e "debris" celulares. Manter as células a 37ºC
em atmosfera de 5% de CO , sendo a troca do meio efetuada a 2
cada 2 dias
Características da cultura (Figs. 3 e 4):
A miogênese de células musculares cardíacas in vitro obedece etapas distintas: Nas primeiras 24 horas de plaqueamento existem 2 tipos celulares predominantes: pré-mioblastos e mioblastos que apresentam intensa multiplicação e motilidade celular. Após 24 horas, um percentual de mioblastos mantém a divisão celular e outros iniciam o processo de diferenciação celular com a organização das proteínas do citoesqueleto em miofibrilas e já se evidencia a presença de células diferenciadas, miócitos cardíacos, com contração espontânea. Após 48 horas, observa-se alto percentual de células diferenciadas. Estas células, cardiomiócitos, se caracterizam por estabelecerem contato com células vizinhas, apresentando interdigitações membranares formando o disco intercalar, além de apresentarem regiões de alta especialização de membrana com formação de gap-junctions, desmossomos e fascia adherens. Estas especializações favorecem o acoplamento celular, permitindo o sincronismo de contrações espontâneas. Ao final de 96 horas de cultivo, ocorre a formação de miofibras em virtude do alto índice de células acopladas.
Figura 3: Aspectos morfológicos da miogênese de células cardíacas,
in vitro. (A) Migração para alinhamento e acoplamento de células cardíacas após 48 h de plaqueamento. As setas indicam a possível direção do alinhamento, barra: 20 µm; (B) Evolução do acoplamento
celular para a formação da miofibra cardíaca, em culturas mantidas
por 5 dias, barra: 20 µm; (C) Células musculares cardíacas (4 dias
de cultivo) coradas com faloidina-FITC para detecção de filamentos
de actina. Evidenciação de cardiomiócitos apresentando uma
complexa organização do citoesqueleto em miofibrilas, barra: 10
µm.
Figura 4: Aspectos ultra-estruturais de células musculares cardíacas
cultivadas in vitro. (A e B) Uma miofibra apresentando acoplamento
e exibindo disco intercalar (DI) com presença de regiões
especializadas de membrana, como desmossomas (D) e gap
junctions (GJ) (A). Detalhe de uma gap junction em (B). (C) Imagem
de dois miócitos acoplados, observa-se miofilamentos de actina e
miosina em cortes transversais (MF). (D) Aspecto de sarcômeros
organizados com evidenciação de linhas Z (Z) no citoplasma de um
miócito após 5 dias de cultivo. Observa-se também a riqueza de
grânulos de glicogênio distribuídos no citoplasma da célula,
revelados pela técnica de Thièry. Barras: 0,2 µm.
Características morfológicas dos tipos celulares presentes nas
culturas:
■ - células bem espalhadas Fibroblastos:
- freqüentemente na forma triangular
ou estrelada
- citoplasma transparente e pouco
refratário em microscopia de contraste
de fase
- uninucleados
- núcleo e citoplasma pouco corados
pelo Giemsa
- 2 ou mais inclusões densas
intranucleares
- arredondadas durante a divisão
celular
■ Mioblastos:- células bipolares
- altamente refratária em contraste de
fase
- núcleo com tendência a forma
alongada
- uninucleados
- núcleo bem corado pelo Giemsa
- citoplasma granular
■ Miócitos: - células volumosas (CARDÍACOS)- presença de estriações (miofibrilas)
18.2.1.2. Roteiro para obtenção de cultura primária de célula muscular esquelética (Araújo-Jorge et al., 1986)
Material:
• basicamente os mesmos utilizados para a obtenção de células
cardíacas
• solução de dissociação: tripsina associada à verseno
Procedimento:
• anestesiar as fêmeas grávidas em câmara mortuária contendo
éter etílico. Levar o animal para o fluxo laminar, fixá-lo na placa
de cortiça e esterilizar a área de dissecção (área abdominal)
com álcool a 70%;
• abrir o abdômen, expondo a membrana peritoneal. Com
material cirúrgico estéril, abrir a cavidade peritoneal e remover
o útero contendo os embriões, transferindo-os para uma placa
de Petri (100 x 15 mm) contendo solução de Ringer no gelo;
• remover as coxas traseiras dos embriões e transferi-las para
uma placa de Petri (100 x 15 mm) com placa de Petri (35x10
mm) contendo solução de Ringer. Dissecar o material, retirando
a pele, os ossos e a cartilagem. Fragmentar o tecido muscular
sobre lâmina escavada, transferindo os fragmentos para outra
placa de Petri (100 x 15 mm) com uma placa de Petri (35 x 10
mm) contendo solução de Ringer no gelo;
• transferir os fragmentos para Erlenmeyer (50 ml) contendo
barra magnética, lavar 2 vezes em solução de Ringer para
remoção das células sangüíneas e posteriormente lavar em
PBS (sem cálcio e magnésio) sob agitação por 5 min a 37ºC;
• dissociação enzimática:
■ Solução final (v/v): 0,05% tripsina + 0,01% de verseno em PBS (solução pré-aquecida, estéril, a 37ºC em banho-maria)
■ expor os fragmentos do tecido à dissociação seqüencial por 5 min cada etapa a 37ºC, sob agitação magnética, até
completa digestão do tecido
■ recolher o líquido de dissociação contendo as células isoladas e transferi-lo para tubos de centrífuga (15 ml) contendo 2 ml de meio DMEM completo, suplementado com 0,5 ml de soro fetal bovino. Manter os tubos no gelo a fim de inativar a atividade enzimática. Marcar os tubos a cada etapa da dissociação
■ controlar ao microscópio óptico de contraste de fase: o padrão morfológico, a viabilidade celular e o número de células obtidas, após cada dissociação
• centrifugar os tubos com células a 1800 rpm (500g) por 5 min.
Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM
completo. Repetir este procedimento 2x, objetivando lavar as
células e eliminar a presença das enzimas proteolíticas. Manter
as células no gelo até o seu plaqueamento;
• utilizar uma alíquota da suspensão celular para avaliação do
número de células em câmara de Neubauer;
• iniciar o plaqueamento seqüencial para obtenção de culturas
ricas em mioblastos: plaquear as células (0,8-1x106 células) em
garrafas 25 cm2 previamente revestidas com gelatina 0,01%;
• após 15 a 30 min de plaqueamento, alta proporção de
fibroblastos irá aderir ao substrato, devido a sua velocidade de
adesão mais rápida do que os mioblastos. Recolher o
sobrenadante, rico em mioblastos, plaquear as células em
recipientes previamente revestidos com gelatina, como descrito
acima. A densidade celular de plaqueamento varia com a área
do substrato:
■ placas de 24 poços, com diâmetro de 18 mm: 15 x 10 5
■ garrafas de plásticos de 25 cm 2 6 : 2 x 10
■ placa de Petri com diâmetro de 35 mm: 0,8-1 x 106
• trocar o meio de cultivo após 24 h, para remoção de células
mortas e "debris" celulares. Manter as células a 37ºC em
atmosfera de 5% de CO , sendo a troca do meio efetuada a 2
cada 2 dias.
Características da cultura (Figs. 3 - 7):
A miogênese de células musculares esqueléticas in vitro obedece a uma seqüência de transformações morfofisiológicas nas primeiras 24 horas de cultivo. Mioblastos dividem-se e migram na cultura, se alinhando a outros mioblastos. Após 24 horas, estes mioblastos são competentes para fusão e se transformam em miotubos jovens pela fusão de mioblastos, que não mais se dividem e são predominantemente binucleados. A partir de 48 horas formamse os miotubos maduros que se originam da fusão de vários miotubos jovens e ainda de mioblastos, sendo então multinucleados. Da fusão de miotubos maduros formam-se as miofibras em torno do quinto ou sexto dia de cultivo. A contração espontânea ocorre após 10 dias de cultivo.
Figura 5: Aspectos das etapas da dissociação e cultivo de células
musculares esqueléticas, in vitro. (A e B) Micrografias de mioblastos
durante sua dissociação parcial (A) e total (B), barras: 0,1 mm; (C)
Aspecto geral da cultura após 24 horas de plaqueamento. As células
são observadas em processo de alinhamento e alguns fibroblastos
destacam-se com núcleos volumosos (cabeças de seta), barra: 1
mm..
Figura 6: Aspectos morfológicos da miogênese de células
musculares esqueléticas. (A e B) Migração e alinhamento de
mioblastos após 48 horas de plaqueamento, para a posterior fusão
(A; cabeça de seta) e a formação de miotubo jovem binucleado (B);
(C-F) Crescimento do miotubo com multinucleação (3, 4 ou 7
núcleos) após 72 horas (C e D) e 96 horas de cultivo (E e F). Nota-
se que durante o processo de fusão, miotubos já multinucleados podem fundir-se, apresentando imagens de ramificação angular, (E);
(G) Miotubo maduro no 5o dia de cultivo in vitro, apresentando
multinucleação com disposição central e linear dos núcleos, barras:
20 µm.
Figura 7: Aspectos ultra-estruturais das células musculares
esqueléticas, in vitro. (A) Miotubo maduro com 4 núcleos; (B e C)
Aspectos do citoplasma de um miotubo no qual pode se observar
filamentos de actina e miosina em arranjos longitudinais ou
transversais (MF) , invaginações da membrana plasmática para a
formação de túbulos T (setas), mitocôndrias com cristas
longitudinais paralelas (M), barras: 0,2 µm.
18.2.2. Procedimento para Cultivo de Macrófagos Peritoneais de Camundongos (Araújo-Jorge & De Souza, 1986)
Este tipo de cultura primária dispensa o uso de enzimas para dissociação. São células obtidas da parede do peritôneo, que se soltam facilmente, após massagem do abdômen do animal.
Procedimento:
• anestesiar o camundongo (25 a 30g);
• ao fluxo laminar, prendê-lo sobre placa de cortiça;
• injetar, no peritôneo, 5-10 ml de solução salina (Hanks) ou
meio de cultivo (DMEM) com seringa estéril;
• massagear o abdômen;
• recolher o líquido do exudato peritoneal e controlar ao
microscópio a presença de bactérias e/ou protozoários, que se
presentes indicam perfuração do intestino, devendo ser
desprezado;
• manter o líquido em banho de gelo para evitar adesão das
células, principalmente macrófagos, à superfície do tubo de
vidro ou do plástico;
• centrifugar a 4ºC (500g por 10 min) e ressuspender as células
em DMEM contendo 5-10% de soro fetal bovino. Avaliar o
número de células obtidas em câmara de Neubauer;
• plaquear as células a uma densidade 1-2 x 104 2 células/mm,
por 20 min a 37ºC. Trocar o meio após esse período.
Características da cultura:
Os macrófagos se apresentam como células arredondadas, sendo dependentes de ancoragem ao substrato para o seu metabolismo. Aderidas ao substrato se apresentam em formato de estrela. São células já diferenciadas e portanto, não se multiplicam, e têm tempo limitado de manutenção in vitro (em torno de 3-4 dias), sob ótimas condições de pH, temperatura e nutrientes.
Anexo 18.1 - Soluções e meios de cultura
Todas as soluções e meios devem ter seu pH aferido antes de se iniciar a cultura.
Solução de Ringer pH 7,0
NaCl 154 9,0 g
mM
KCl 154 tomar 8,4 ml de solução
mM 5%
CaCl 154 tomar 5,0 ml de solução 2
mM 5%
Água tridestilada 1000 qsp ml
• esterilizar em autoclave (20 min/1atm)
Solução de PBS pH 7,0
NaCl 137,0 mM 8,0 g K Cl 2,7 mM 0,20 g
KH PO 0,88 mM 0,12 g 2 4
Na HPO 6,4 mM 0,91 g 2 4
Água tridestilada qsp 1000 ml
• esterilizar em autoclave (20 min/1 atm)
Solução de gelatina 0,01%
• dissolver 0,01 g em solução de Ringer pH 7,0, sob
aquecimento
• esterilizar em autoclave (20 min/1 atm)
Solução de L-glutamina 200 mM
• dissolver 2,9263 g em 100 ml de água tridestilada
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução de bicarbonato de sódio (NaHCO ) 333 mM 3
• dissolver 2,8 g em 100 ml de água tridestilada
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução de cloreto de cálcio (CaCl . 2 H O) 25 mM 2 2
• dissolver 0,3675 g em 100 ml de água tridestilada
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução de tripsina 0,1%
• solução estoque: dissolver 0,1 g em 100 ml de PBS pH 7,0
• deixar sob agitação por cerca de 7 h a 4ºC
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução de colagenase 0,8%
• preparar solução estoque dissolvendo 0,5 g em 60 ml de PBS
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução de EDTA ou Verseno 0.02%
• preparar solução estoque dissolvendo 0,02 g em 100 ml de
PBS
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Solução estoque de penicilina - estreptomicina
• 1 frasco de estreptomicina (1 g)
• 1 ml de penicilina (1000000 U/ml)
• 100 ml de água tridestilada estéril
• concentração final: 10 mg/ml de estreptomicina e 10000 U/ml
de penicilina
• concentração de trabalho: 0,1 mg/ml de estreptomicina e 1000
U/ml de penicilina
Meio Eagle (pH 6,8)
• meio Eagle MEM 13,4 g
• nitrato férrico (Fe(NO ) .9H O) 0,001 g/l diluir em 10 ml 3 2 2
• acrescentar 10 ml da sol. estoque de penicilina –
estreptomicina
• água tridestilada qsp 1000ml
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Meio Eagle Completo (pH 6,8)
• 73 ml de meio Eagle
• 10 ml de soro de cavalo (inativado por 30 min a 56ºC)
• 5 ml de soro fetal bovino (inativado por 30 min a 56ºC)
• 10 ml de CaCl a 25mM 2
• 1 ml de L-glutamina a 200 mM
• 1 ml de extrato embrionário
• ajustar o pH com bicarbonato de sódio (pH ácido) ou gás
carbônico (pH básico)
• filtrar estéril em membrana com poro 0,2 µm
Preparo de extrato embrionário a partir de embrião de pinto (10 dias) (Paul, 1975)
• limpar a casca do ovo com álcool
• quebrar a base da casca do ovo batendo levemente com
auxílio de uma pinça
• remover a casca sobre a câmara de ar para expor a
membrana
• soltar e remover a membrana com um outro par de pinças
estéreis
• introduzir uma terceira pinça estéril (ponta curva) abaixo do
pescoço do embrião, tomando cuidado para não exercer
nenhuma pressão. Extrair o embrião lentamente do ovo e
depositá-lo em uma placa de Petri
• após a remoção de todos os embriões, lave-os 3x em solução
salina balanceada (solução de Ringer) para remoção de todo
sangue e a gema de ovo
• colocar os embriões dentro de uma seringa e introduzir
lentamente o êmbolo
• inserir a extremidade da seringa em um tubo de centrífuga e
pressionar os embriões
• adicionar igual volume de solução de Ringer à massa
embrionária e homogeneizar sucessivamente o material com
auxílio de uma pipeta Pasteur
• centrifugar por 20 min a 2.000g, remover o sobrenadante e
distribuir em tubos. Fazer um teste de esterilidade pela adição
das 10 últimas gotas em um tubo contendo meio de cultura e
incubar este tubo em estufa a 37º C
• estocar no refrigerador caso o extrato seja utilizado no mesmo
dia. Para tempos longos de estocagem (6 meses), o extrato
embrionário deve ser mantido no freezer. Antes de usar,
descongelar lentamente e centrifugar por 10 min a 2.000g.
Recolher o sobrenadante e diluir em solução de Ringer na
proporção de 1:2 antes de adicionar ao meio de cultura DMES
Solução fixadora de Bouin
• solução estoque: solução saturada de ácido pícrico (filtrada)
diluída em formaldeído na proporção de 3:1 (300 ml ácido
pícrico + 100 ml de formol).
• solução de uso (1/20): solução estoque (19 ml) + ácido acético
(1 ml)
Coloração por Giemsa
• lavar as culturas 2x em PBS ou Ringer
• fixar em solução de Bouin por 5 min
• lavar 2x com álcool 70% (PA) por 30 min, para remoção do
excesso de fixador
• lavar com água destilada
• corar com Giemsa diluído de 1/10 por 60 min (1 ml de Giemsa
+ 9 ml H O destilada) 2
• lavar em água destilada
• desidratação:
■ acetona 100% (2x)
■ acetona 70% + xilol 30%
■ acetona 50% + xilol 50%
■ acetona 30% + xilol 70%
■ xilol 100% (2x)
• montar em Permount
Obs: Este procedimento pode ser interrompido na etapa do
álcool 70% e mantido overnight a 4ºC.
Processamento de lamínulas redondas para cultura de células
• cortar lamínulas de vidro em moldes circulares de 15mm
• ferver em banho de Extran ou sabão de coco
• lavar exaustivamente com água corrente para retirar todo o
resíduo de sabão
• ferver 3 vezes em banhos consecutivos de água destilada
• deixar pelo menos uma hora em álcool a 70% para remover a
gordura
• lavar exaustivamente em água destilada, para retirar todo o
resíduo de álcool
• ferver novamente em banho de água destilada
• secar cada lamínula em lenço de algodão limpo e com o
auxílio de uma pinça
• distribuir em placas de Petri (100 x 15 mm) revestidas com
papel de filtro
• embrulhar cada placa com papel pardo, identificar e esterilizar
em autoclave a 1 atm por 20min) ou em forno microondas por
15 min em potência máxima
Lavagem de vidraria para cultura de células
• ferver a vidraria usada em Extran ou sabão de coco
• ainda morna, lavar individualmente cada vidro utilizando
escovas apropriadas
• enxaguar bem cada vidro individualmente com água corrente
e colocar de molho em água por pelo menos 2 h
• enxaguar o material 3x em água destilada
• secar em estufa
• embalar e esterilizar em autoclave a 1atm por 20 min
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