Capítulo 14 - Avaliação de parâmetros parasitológicos e de mortalidade

Capítulo 14 - Avaliação de parâmetros

 

parasitológicos e de mortalidade

 

Solange L. de Castro; Tania C. Araújo-Jorge; Maria Teresa Rivera; Angela C. V. Junqueira

A detecção de parasitas no sangue periférico é a prova definitiva da infecção pelo Trypanosoma cruzi. A identificação individual da parasitemia, positiva ou negativa, patente ou subpatente, bem como sua quantificação, além de consistirem na prova parasitológica diagnóstica concreta da infecção, podem indicar o grau de equilíbrio em que se encontra a relação parasita-hospedeiro, refletindo a infectividade da cepa de parasita, o grau de parasitismo tissular e a intensidade do efeito da resposta imune específica articulada contra o parasita. No estudo experimental, além da análise individual, os parâmetros de percentual de mortalidade ou sobrevida cumulativa, tempo de sobrevida e tempo para mortalidade de metade dos animais, permitem uma medida do grau de resistência de uma dada população de hospedeiros a uma dada cepa de parasitas, ou o efeito de uma terapia ou imunoterapia.

 

14.1 Parasitemia direta em camundongos

infectados com T. cruzi

O acompanhamento da parasitemia dos camundongos infectados é indispensável tanto para se fazer a passagem da cepa do T. cruzi para sua manutenção em animais no laboratório, como para inferir a modulação da infecção por diferentes tratamentos. Vem sendo utilizada desde os primeiros trabalhos experimentais em doença de Chagas. Inicialmente qualitativa (positividade ou negatividade de encontro do parasita em gota espessa ou esfregaço sangüíneo, tal como feito para humanos até hoje), passou a parâmetro semiquantitativo, expresso em cruzes ou em parasitas por campo microscópico, e foi posteriormente padronizada para expressão em número de parasitas por ml de sangue (Pizzi et al., 1998). A parasitemia é um parâmetro individual, colhido a partir da análise de cada um dos animais do grupo experimental, e que pode ser expressa em razão do tempo (curva de cinética de parasitemia) ou em razão de seu nível máximo (parasitemia máxima). Com um mínimo de seis animais pode-se trabalhar com as médias ou medianas obtidas em cada grupo. Como os valores de parasitemia comumente não apresentam distribuição normal, o tratamento estatístico dos dados obtidos é, em geral, feito através de métodos não paramétricos, ou então por métodos paramétricos (teste t, qui-quadrado ou análise de variância) sobre o logaritmo calculado com os dados originais (ver Capítulo 19).

No Capítulo 20 temos um modelo de coleta de dados de parasitemia e no Capítulo 19 um exemplo de elaboração de planilha para cálculo de parasitemia pelo método de Pizzi-Brener e também por contagem em câmara de Neubauer.

USAR LUVAS, MÁSCARA E GUARDA-PÓ DE

MANGAS COMPRIDAS

Material

• caixa de retenção do animal

• ponteiras descartáveis em suporte apropriado

• tesoura de ponta fina e afiada

• micropipeta para 5 µl

• placa de Petri com tampa

• fósforos

• algodão

• lâminas (ou câmaras de Neubauer)

• solução de lise de hemáceas: cloreto de amônia a 0.85% em

água

• lamínulas de 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm

• frasco lavador com álcool

• microscópio óptico

• tubos de microcentrífuga (ou microplaca com tampa) com

solução de lise

• caixas de descarte de material com as soluções desinfetantes

apropriadas

Método de Pizzi-Brener

• colocar o camundongo infectado na caixa de retenção, com a

cauda para fora;

• com uma das mãos, massagear a cauda no sentido da base

para a ponta e segurar na ponta;

• com a tesoura na outra mão, cortar 1 mm ou menos da ponta

da cauda deixando o sangue correr formando uma gota. Sobre a

placa de Petri, colocar a primeira gota, que será desprezada (ou

utilizada para fazer uma lâmina de esfregaço sangüíneo), e

colocar a seu lado a segunda gota. Manter a cauda do

camundongo segura até que seja cauterizada;

• deixar a tesoura sobre algodão embebido em álcool e pegar a

micropipeta com ponteira para 5 µl;

• tomar 5 µl da segunda gota que está sobre a placa de Petri e

depositá-la sobre a lâmina e desprezar a ponteira na cuba

apropriada. Imediatamente recobrir com a lamínula, deixando

espalhar naturalmente o sangue sem qualquer pressão. Se o

espalhamento não ficar bom, repetir o procedimento em outra

lâmina;

• acender um fósforo e tocar com a base da chama (não com a

ponta) no ponto de corte da cauda do animal até cauterizar.

Soltar então o camundongo;

• desprezar o fósforo num vidro apropriado, com cuidado para

não encostar em nada que contenha álcool;

• levar ao microscópio, sob objetiva de 40x, e contar o número

de parasitas móveis em cinqüenta campos aleatoriamente

observados, cobrindo toda a área da lamínula;

• calcular o número de parasitas por ml de sangue de acordo

com o procedimento descrito no item 14.2;

• no caso de parasitemias muito altas (maior que trinta) parasitas

por campo), pode ser feita uma diluição inicial em solução de

lise. Nesse caso, deve-se preparar o tubo eppendorf com o

volume apropriado de solução de lise: 20 µl ou 45 µl,

respectivamente para uma diluição de 1/5 ou 1/10 (p/5 µl de

sangue). Em todos os casos é fundamental definir qual a

diluição utilizada, para correção posterior do número de

parasitas.

Obs: pode-se utilizar câmaras de Neubauer para a contagem.

Nesse caso encher a câmara com o sangue diluído e

hemolisado, contar os quatro quadrantes, calcular a média do

número de parasitas por quadrante e multiplicar pela diluição e

pelo fator da câmara (104).

Cálculo do número de parasitas/ml

Os parasitas serão quantificados em número de parasitas/campo microscópico, observados por toda a área da lamínula. Portanto, essa área vai diferir com lamínulas de dimensões diferentes. Além disso, o aumento com que o material será observado dependerá do jogo de lentes, assim, a área do campo deverá ser calculada para cada microscópio.

Ao final, será preciso aplicar um fator de multiplicação para que aquele número médio observado por campo seja extrapolado para toda a área da lamínula (que corresponde ao volume de 5 µl de sangue adicionado), corrigido pela diluição e extrapolado para 1 ml (200 x).

Cálculo do fator de correção

Procedimento

1. Medir o diâmetro (d) do campo microscópico com o qual se

vai fazer as contagens. Utilizar para isso uma lâmina

micrométrica colocada na platina do microscópio ou então uma

objetiva micrométrica.

2. Calcular a área de um campo microscópico observado

 

π = 3,14

3. Calcular a concentração de parasitas no sangue (usar fator de

correção): por exemplo para a lamínula de 20 x 20 mm sob

objetiva cujo campo microscópico mede 0,42 mm de diâmetro

Sendo n = nº de parasitas contados em cinqüenta campos, calcular sucessivamente:

• n' = nº de parasitas em 1 campo (corresponde a área Ac =

0,138474 mm2) (n' = n /50)

• n'' = nº de parasitas em toda a lamínula (corresponde a área Al

= 400 mm 2)

Obs: n'' corresponde ao número de parasitas totais na lamínula em um volume de 5 µl

• n''' = concentração de parasitas, i.e., nº de parasitas em 1.000

µl (como temos o número em 5 µl, para calcular parasitas no

volume de 1.000 ml – 200 x maior – (temos que multiplicar por

200)

n''' = n'' x 200 = n' x 2,89 x 103 x 200

n''' = n' x 578 x 103 4 = n' x 57,8 x 10

• assim, o fator = 57,8 x 104 (só válido para aquele microscópio

onde foi contada a lâmina), com a mesma objetiva – mesmo

aumento – no qual foi medida a área do campo, para lamínula

20 x 20 e para um volume de sangue 5 µl)

• desta forma, basta multiplicar o número de parasitas/campo

por 57,8 e teremos a concentração de parasitas no sangue

expressa em 104 parasitas/ml

• uma vez calculado o fator de multiplicação a ser usado, pode-

se construir uma tabela para anotação direta do valor absoluto

na planilha de coleta de dados (ver Capítulo 20).

Se a amostra de sangue tiver sido diluída, multiplicar ainda pela diluição:

Exemplo: contagem de duzentas parasitas em cem campos, amostra

diluída 1:20 (fator = 57,8.104)

Parasitas Parasita/campo Parasita/ml Parasita/ml

em 50 4 6 (10 p/ml) (10 p/ml)

campos

200 4 4 x 57,8 x 46,2

20 = 46,24

4. Expressar em logaritmo de base 10

Exemplo: log 6 46,2.10 = 6 + log 46.1 = 6 + 1,664 = 7,664 10 10

14.2 Parasitemia por amplificação parasitária:

hemocultura, xenodiagnóstico e PCR

Métodos indiretos como a hemocultura e o xenodiagnóstico são os procedimentos mais utilizados para a avaliação parasitológica em situações de baixos níveis de parasitemia, especialmente em humanos ou em animais experimentais submetidos à quimioterapia ou à imunoterapia. Como a evidenciação do parasita, através de testes parasitológicos, é a forma definitiva de caracterização da infecção ativa, devido à escassez de tripomastigotas circulantes, estes métodos indiretos são necessários tanto na fase aguda assintomática como nas fases indeterminada e crônica. Na fase aguda da doença, quando sintomática, a detecção do parasita é relativamente fácil e pode ser realizada pelo exame direto do sangue.

É praticamente consenso que se adote mais de um procedimento técnico no isolamento e/ou detecção do T. cruzi tanto em indivíduos nos quais se suspeita a infecção, bem como em animais experimentalmente infectados e reservatórios. Os parâmetros parasitológicos indiretos mais empregados são o xenodiagnóstico (Brumpt, 1914) e a hemocultura (Freitas, 1947). Mais recentemente introduziu-se a denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction - PCR), que consiste na síntese enzimática, in vitro, de milhões de cópias a partir de um segmento específico de DNA do parasita (Saiki et al., 1985; Mullis & Faloona, 1987).

A seguir serão descritas essas três técnicas empregadas com mais freqüência no diagnóstico e isolamento do T. cruzi em amostras biológicas.

Para a realização da técnica de hemocultura, devido aos excelentes resultados obtidos por Chiari et al. (1979) e de Luz et al. (1994a,b), tem-se adotado o procedimento básico destes autores.

14.2.1 Hemocultura

Material

• frasco de meio LIT para lavagem

• micropipeta para 10 µl

• tubos com meio LIT (5, 15 ou 50 ml)

• ponteiras descartáveis em suporte apropriado

• sangue heparinizado do animal ou paciente recolhido em tubo

de centrífuga

• lâminas

• centrífuga clínica

• lamínulas de 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm

• câmara de fluxo laminar

• caixas de descarte de material com as soluções desinfetantes

apropriadas

• estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28ºC

• frasco lavador com álcool

• pipetas Pasteur estéreis

• microscópio óptico

Meio de cultivo

Utilizar o meio liver infusion tryptose (LIT) formulado por R. Yaeger e introduzido por E. P. Camargo (Camargo, 1964). Este meio é rico em componentes e tem apresentado bons resultados no cultivo de formas sangüíneas de T. cruzi (ver Capítulo 10)(Chiari et al., 1979; Luz et al., 1994a,b). Após a filtração, o meio é aliquotado em tubos de vidro refratário com tampa de rosca ou em frascos plásticos estéreis; sendo dois frascos submetidos à prova de esterilização, um lote fica no laboratório para ser empregado na rotina de cultivo de amostras do T. cruzi e o restante estocado a 4ºC até o momento do uso. Para cada amostra a ser testada deve-se prever seis tubos de cultura.

Obtenção do sangue

• no caso de camundongo, promover a sangria por punção do

seio orbitário (Kimura, 1993). No caso de pacientes, coletar em

condições assépticas 30 ml de sangue venoso de cada

indivíduo, através de tubo vacutainer contendo heparina sódica

ou outro anticoagulante;

• no mesmo dia da coleta, o volume obtido de sangue deverá ser

centrifugado em uma centrífuga clínica a 2.500 rpm por 15 min.

Processo de cultivo

Todo o procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar ou em uma sala asséptica que contenha bico de Bunsen, para evitar contaminação no momento da retirada do plasma e da lavagem da papa de hemáceas com o meio de cultura.

• após a centrifugação do sangue, retirar o plasma, que é

aproveitado para sorologia, e adicionar à camada de hemáceas

e leucócitos igual quantidade de meio LIT;

• promover-se uma nova centrífugação a 2.500 rpm por 20 min;

• a seguir, remover o sobrenadante, e distribuir o sedimento

(hemácea e leucócitos) em seis tubos, contendo 2 ml de LIT, ou

em dois tubos de plástico (50 ml) com 6 ml de meio;

• transferir os tubos semeados para uma estufa incubadora

B.O.D. regulada a 28ºC; os tubos devem ser homogeneizados

uma vez por semana.

Período e forma de leitura

• realizar a leitura retirando-se alíquotas de 10 µl da suspensão

de cada tubo e examinando-as aos 45, 60, 90 e 120 dias após o

cultivo, entre lâmina e lamínula, ao microscópio ótico binocular

com aumento de 400x;

• após a última leitura, os tubos que permanecerem negativos

devem ser centrífugados a 2.500 rpm por 15 min para que o

sedimento seja reexaminado (Bronfen et al., 1989);

• independente da comprovação de T. cruzi em um tubo, a

pesquisa do parasita deve continuar sendo efetuada nos outros

tubos provenientes do mesmo sangue, com objetivo de avaliar

indiretamente a parasitemia no animal.

14.2.2 Xenodiagnóstico

Este teste parasitológico é ainda muito empregado em humanos e animais sob suspeita de atuarem como reservatórios.

Material

• ninfas de III ou IV estágio do triatomíneo escolhido (cinco ou

dez para cada caixa, a depender do uso em animais ou

humanos, respectivamente)

• caixas de madeira para os triatomíneos se alimentarem

• frascos para manutenção das ninfas após a alimentação

• solução anestésica para o animal em estudo

• galinha para alimentação dos insetos aos 23 dias após o teste

• material de dissecção (duas pinças, tesoura e bastão de vidro,

lâminas escavadas)

• lâminas

• lamínulas de 22 x 22 mm

• solução de PBS 0,01M

• micropipeta de 5 ml

• ponteiras descartáveis em suporte apropriado

• caixas de descarte de material com as soluções desinfetantes

apropriadas

• frasco lavador com álcool

• microscópio óptico

Espécie de triatomíneo empregada

Não existe um consenso sobre qual ou quais espécie(s) vetora(s) devam ser empregadas no xenodiagnóstico. Nossa experiência tem demonstrado bons resultados na utilização da espécie Panstrongylus megistus, como também a importância na aplicação de uma segunda espécie, devido à diferença de susceptibilidade ao parasita entre os diferentes vetores, bem como aumento da sensibilidade (CNPq, 1974; Junqueira et al., 1989a,b; Pereira et al., 1996).

Aplicação de ninfas

• escolhida a espécie, separar quarenta ninfas de III ou IV

estágio, deixar as mesmas em jejum de duas a três semanas, e

acondicioná-las em quatro recipientes de madeira cobertos com

filó na parte superior, conforme proposto por Schenone et al.

(1968), e colocar sobre a face interna do antebraço de cada

indivíduo durante 30 min (Schenone et al., 1968; Salgado, 1969;

Cerisola et al., 1974; CNPq, 1974);

• no caso de animais de pequeno porte, como por exemplo

camundongo e cobaia, este número deve ser reduzido para

cinco exemplares; aconselha-se também imobilizar os mesmos

através de uso de mesa de contenção apropriada ou anestesiá-

los com ketamina ou cloridrato de tiletamina associada com

cloridrato de zolazepam. Aconselha-se a mesma conduta para

macacos;

• verificar o número de ninfas que se alimentaram em cada

recipiente, antes de transferi-las para frascos maiores,

desprezando aquelas que não ingerirem sangue. Considerar

como ninfas alimentadas somente aquelas que, através da

observação, apresentarem abdome distendido, independente da

intensidade. Conforme Freitas (1947), deve-se conservar para o

exame apenas os exemplares que sugaram sangue,

independente da quantidade sugada;

• até o momento da leitura do xenodiagnóstico, manter os

triatomíneos a temperatura e umidade ambientes. Aos 23 dias,

contados a partir da aplicação, submetê-los a uma única

alimentação em Gallus gallus (galinha). Segundo Dias (1933,

1940b), essa alimentação é importante para a manutenção do T.

cruzi no vetor. Também Perlowagora-Szumlewicz & Muller

(1982, 1987,1988, 1990) demonstraram que a alimentação

adicional com sangue de ave doméstica, após a infecção inicial,

foi capaz de aumentar a densidade parasitária em cinco das oito

espécies de triatomíneos testadas.

Leitura do xenodiagnóstico

• o exame das ninfas (Figura 1) deve ser realizado aos 30 e 60

dias ou apenas uma leitura aos 45 dias após a aplicação dos

exemplares (Salgado, 1969; Perlowagora-Szumlewicz & Muller,

1987);

• obter fezes dos triatomíneos por compressão abdominal.

Observar inicialmente o pool de fezes obtidas de duas a três

espécimes e, em caso positivo, verificar através de um novo

exame individual, o número de exemplares positivos

• as ninfas do pool de fezes em que não se detectar formas de T.

cruzi devem ser reexaminadas individualmente, dessa vez por

dissecção total de seu trato digestivo. O procedimento de

dissecção consiste na retirada de todo o trato digestivo, com

auxílio de duas pinças e uma tesoura, e no seu maceramento,

empregando-se um bastão de vidro;

• cada conteúdo biológico (fezes e trato digestivo) obtido é

depositado sobre uma lâmina, à qual acrescenta-se 5 µl de

salina tamponada, pH 7,2, e cobre-se com lamínula 22 x 22 mm

(Figura 1);

• essa leitura em duas fases permite que se preserve para

estudos posteriores os triatomíneos que apresentem de início

• o conteúdo fecal positivo e, por sua vez, a dissecção torna

possível detectar formas de T. cruzi que não estejam sendo

eliminadas nas fezes (Salgado, 1969; Fuente et al., 1985). Em

áreas endêmicas onde ocorra concomitantemente a espécie T.

rangeli recomenda-se o exame da hemolinfa para diagnóstico

diferencial;

• proceder a leitura ao microscópio óptico binocular com um

aumento de 400x, percorrendo todos os campos em busca de

formas evolutivas do T. cruzi.

Figura 1 – Exame individual pela técnica de dissecção de um

 

triatomíneo

14.2.3 PCR (diagnóstico molecular)

Devido à sua alta sensibilidade dentre as técnicas propostas, a PCR contribui de forma importante na detecção desse protozoário na fase crônica da doença de Chagas. A reação de PCR tem sido empregada com sucesso na detecção do T. cruzi em triatomíneos e camundongos (Moser et al., 1989), em sangue (Sturm et al., 1989) e soro (Russomando et al., 1992) de pacientes chagásicos. O segmento alvo de DNA do parasita tem sido o DNA genômico ou o DNA cinetoplástico. Em ambas as circunstâncias, enfocam-se os segmentos altamente repetidos no DNA do parasita, o que amplia muito as chances de detecção do T. cruzi, ou parte de seu DNA nos materiais biológicos.

Método 1: Iniciadores para amplificar um segmento de

kDNA

Na Fiocruz, vários laboratórios têm trabalhado em epidemiologia da doença de Chagas em diversas regiões do Brasil como Minas Gerais, Paraíba, Piauí e Amazonas. Em todas essas regiões, dados de diagnóstico molecular foram obtidos através da técnica de PCR, amplificando-se a região variável da molécula de minicírculo, um dos

componentes da rede de DNA mitocondrial deste protozoário (Figura

2). A escolha deste alvo foi proposital, uma vez que essa região se encontra repetida quatro vezes por molécula circular e estas estão presentes em cerca de 10.000 cópias por célula (Degrave et al., 1988; Sturm et al., 1989).

Figura 2 – Representação esquemática do minicírculo de

Trypanosoma cruzi, mostrando a disposição simétrica das quatro

regiões constantes (retângulos sombreados) e as duplas de

oligonucleotídeos iniciadores específicos para PCR

O protocolo que se segue foi introduzido por Britto et al. (1993, 1995a,b) e Wincker et al. (1994a,b, 1997) e empregado para amplificação do DNA de T. cruzi em amostras de sangue e material fecal de triatomíneo; fez-se uso também do procedimento em amostras de líquor, cultura e fragmento mumificado de tecido. É o protocolo em uso atualmente no Depto. de Medicina Tropical do IOC.

Material

• tubos de polipropileno para coleta de sangue com solução de

guanidina-EDTA

• placa de aquecimento a 70ºC

• frasco com água deionizada

• banho-maria a 100ºC com água fervente

• aparelho de PCR DNA Thermal Cycler 480 (para os ciclos

térmicos)

• solução de fenol-clorofórmio 1:1 (v/v)

• tampão Taq Polymerase 10x

• soulção de clorofórmio saturado

• Mg Cl 25 mM 2

• solução de acetato de sódio a 3M

• nucleotídeo dATP 10 mM

• etanol absoluto

• nucleotídeo dCTP 10mM

• recipiente de isopor com gelo moído para banho de gelo

• nucleotídeo dGTP 10mM

• nucleotídeo dTTP 10 mM

• congelador a -20ºC

• oligonucleotídeos121 100 ng/µl

• micropipeta para 100, 10 e 5 µl

• oligonucleotídeos 122 100 ng/µl

• ponteiras descartáveis em suporte apropriado

• pérolas de parafina purificada

• microcentrífuga

• tubos para microcentrífuga

• cuba de eletroforese pequena

• enzima Taq Polymerase 2,5 U

• marcador de peso molecular φx174 DNA Hae III

• agarose NUSieve GTG

• soluções tampão para eletroforese

• agarose SeaKem GTG – FMC

• fonte de eletroforese

• Tris

• azul de bromofenol

• ácido bórico

• glicerol

• EDTA

• brometo de etídeo

• transiluminador UV com sistema fotográfico

Coleta da amostra a ser amplificada

• a amostra é transferida para um frasco de polipropileno

contendo igual volume da solução de 6 M guanidina HCl + 200

mM EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) pH 8,0. No caso da

mostra ser sangue de indivíduo suspeito, retirar 10 ml por

punção venosa, com auxílio de vacutainer sem anticoagulante e

homogeneizar em um tubo contendo 10 ml de guanidina-EDTA.

Este volume deverá ser reduzido no caso de animais de

pequeno porte;

• a solução guanidina-EDTA permite que o sangue possa ser

estocado por um prazo de trinta dias em temperatura ambiente,

até o momento de ser transferido para o laboratório onde será

processado (Avila et al., 1991). Estocar o material a 4ºC até a

etapa seguinte.

Isolamento do DNA do sangue coletado

Tem-se utilizado como alvo várias seqüências de DNA do parasita para a PCR. Neste protocolo a estratégia de amplificação são os minicírculos da rede de kDNA, que existem em grande quantidade, cerca de 5-20 x 10 3 minicírculos de 1,42 Kb (kilobases) por T. cruzi (Degrave et al., 1988; Sturm et al., 1989). Esse elevado número e a presença nas seqüências de nucleotídeos de regiões conservadas minirrepetidas permitem que apenas 0,1% dos minicírculos contidos em um único parasita seja suficiente para a visualização após a PCR (Sturm et al., 1989).

Clivagem física

Com objetivo de promover a linearização e conseqüente liberação dos minicírculos concatenados na rede de kDNA (Britto et al., 1993), os tubos contendo sangue + guanidina-EDTA deverão ser parcialmente imersos em água e fervidos por 15 minutos.

Extração

• realizar em duplicata, a partir dessa etapa, todos os

procedimentos, e a cada série de cinco amostras extraídas,

incluir um sangue de indivíduo comprovadamente negativo. Isso

permite um monitoramento da presença de contaminantes

durante as etapas da PCR (Wright & Wynford-Thomas, 1990;

Kitchin & Bootman, 1993);

• para a extração do DNA de cada amostra de sangue fervido,

retirar duas alíquotas de 100 µl. Cada alíquota deverá ser

submetida a um processo de desproteinização empregando

fenol-clorofórmio na proporção de 1:1 (v/v); clorofórmio saturado;

• precipitar a fase aquosa obtida, acrescentando-se 10% de

acetato de sódio a 3 M (300 mM de concentração final), mais

dois volumes de etanol e deixar 15 min em banho de gelo;

• passado esse tempo, centrifugar (centrífuga modelo 5415C,

Eppendorf ou similar) o volume total a 12.000 rpm por 15 min;

• desprezar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o

sedimento sobre uma placa de aquecimento, regulada para

70ºC, por um período suficiente para que evapore toda a parte

líquida (gotículas de etanol) (normalmente 5 min são

suficientes);

• ressuspender o sedimento em 50 µl de água deionizada

(Sambrook et al., 1989) e estocar a -20ºC até o momento da

amplificação.

Amplificação do DNA extraído

No caso de se utilizar o procedimento hot start, reação de amplificação in vitro, os componentes químicos empregados deverão ser adicionados em duas fases, com uma separação física entre elas promovida por uma pérola de parafina especialmente formulada pela Perkin-Elmer Cetus Instruments (USA). A qualidade desse procedimento está em promover uma melhor especificidade e precisão das amplificações realizadas em amostras com baixas concentrações de seqüências-alvos, evitando a hibridização de iniciadores (primers) e as seqüências não-alvo (mis-priming), bem como a extensão de primers complementares que tendem a se hibridizar um ao outro (primer dimerization), gerando um produto amplificado inespecífico (Chou et al., 1992).

Pré-amplificação Antes dos ciclos térmicos, os reagentes da reação são adicionados em duas fases:

1ª fase ou fase inferior

As quantidades fornecidas a seguir e na próxima fase correspondem a valores empregados em apenas uma reação de amplificação, ou seja, 7,5 µl de DNA ressuspendido.

• em um tubo de microcentrífuga, acrescentam-se os seguintes

produtos

µl

H O deionizada 11,3 2

Tampão Taq Polymerase 10x 4,0

Mg Cl 25 mM 13,5 2

Nucleotídeo dATP 10 mM 1,8 Nucleotídeo dCTP 10mM 1,8 Nucleotídeo dGTP 10mM 1,8 Nucleotídeo dTTP 10 mM 1,8 Oligonucleotídeos 121 100 ng/µl 2,0 Oligonucleotídeos 122 100 ng/µl 2,0 Total 40,0

• após homogeneização, transferir os 40µl da mistura anterior

para um tubo apropriado, que possibilita a troca rápida de

temperatura, e introduzir uma pérola de parafina purificada

(Ampliwax PCR Gem 100 - Perkin-Elmer);

• a seguir, com a finalidade de liqüefazer a parafina, incubar o

tubo a 80ºC durante 5 min com auxílio de uma placa de

aquecimento;

• deixar o tubo esfriar a temperatura ambiente até a parafina se

solidificar.

Utilizar os oligonucleotídeos 121 (5'-

AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3') e 122 (5'-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3') que apresentam a característica de se ligarem em um trecho das quatro regiões constantes dos minicírculos de T. cruzi e promoverem a amplificação

em direção à região variável (Sturm et al., 1989) (Figura 3). Desta forma, a variabilidade genética das seqüências de minicírculos das populações de T. cruzi não interfere na hibridização dos oligonucleotídeos.

 

Figura 3 – Detecção de DNA por gel de agarose. O DNA foi extraído

de amostras de sangue de indivíduos de área endêmica para doença de Chagas com sorologia positiva (linhas 7 a 11). M = marcadores de

peso molecular; NO DNA e (-) são controles negativos; (+) weak,

strong são controles positivos fraco e forte reatores

2ª fase ou fase superior

• em outro tubo de microcentrífuga adicionar os três últimos

componentes da reação

µl

H O deionizada 23,5 2

Tampão Taq Polymerase 10x 3,5 Enzima Taq Polymerase 2,5 U 0,5 Total 27,5

• promover a mistura dos elementos e a seguir transferir os 27,5

µl totais para o tubo que já contenha a fase inferior e a camada

de ampliwax. A este acrescentar 7,5 µl de DNA ressuspendido.

Ciclos térmicos

• introduzir os tubos, contendo os componentes das fases 1 e 2,

no aparelho modelo DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer

Cetus Instruments ou similar), programado para seguir os

seguintes ciclos de temperatura e tempo

 

Dois ciclos iniciais 98ºC 1'

64ºC 2'

 

33 ciclos intermediários 94ºC 1'

64ºC 1'

Um ciclo final 72ºC 10'

Nestas condições de amplificação, a hibridização dos oligonucleotídeos iniciadores e a extensão da fita de DNA se processam entre as temperaturas de 64 e 94ºC e no mesmo espaço de tempo, encurtando, com isso, a reação de amplificação para o tempo de 2h10m. A temperatura mínima de 64ºC cria uma situação de alta estringência, permitindo que os primers se liguem a seqüências totalmente complementares. Isso conduz a uma alta especificidade da reação. O último ciclo, de 10 minutos de duração, tem como objetivo complementar produtos de parcial extensão (Rofls et al., 1992).

Controle

A cada série de cinco amplificações em duplicata, incluímos duas alíquotas de amostras comprovadamente negativas (previamente relatado no item Extração) e mais duas positivas. A inclusão dessas amostras de sangue ou de outro material biológico, comprovadamente negativas, possibilita um controle rigoroso da contaminação, uma das maiores limitações do emprego da PCR como método de diagnóstico. Por outro lado, os controles positivos servem para avaliar a qualidade dos reagentes (Wright & Wynford-Thomas, 1990) e do próprio processo de extração, como também estimar a qualidade da reação pela intensidade relativa das bandas.

Para detectar a presença de contaminantes nos componentes da reação, introduziu-se no protocolo um tubo contendo a fase inferior e superior, mas sem produto extraído (Wright & Wynford-Thomas, 1990; Erlich et al., 1991).

Visualização do produto de reação

Para a separação e posterior identificação dos fragmentos de base resultantes da amplificação, empregar a técnica de eletroforese em gel de agarose NUSieve, por ser mais prática do que em gel de poliacrilamida além de apresentar uma resolução na faixa de peso molecular a ser visualizada (Moser et al., 1989; Avila et al., 1991, 1993).

Eletroforese

• em uma pequena cuba de eletroforese (modelo Submarine

mini-gel - Sigma ou similar), adicionar 200 ml de agarose (uma

parte de agarose NUSieve GTG, e outra parte de agarose

SeaKem GTG - FMC BioProducts) a 2% (Mullis et al., 1986);

• após solidificação da agarose, banhar a mesma em tampão

TBE 1x (tris-ácido bórico, EDTA) pH 8,3 e a seguir introduzir as

alíquotas a serem corridas;

• a ordem de aplicação deverá ser a seguinte;

■ na primeira canaleta: 15 µl do marcador de peso molecular φx174 DNA Hae III (Sigma)

■ nas canaletas seguintes: 15 µl de cada amostra + 2 µl do corante azul de bromofenol;

• após ocupar todas as canaletas, promover uma corrida de

aproximadamente 1h30min a 70V (volts), utilizando uma fonte

com duas entradas e duas saídas.

Obs: tampão de aplicação: 0,25% azul de bromofenol + 0,25%

xileno-cianol FF + 30% glicerol em água.

Revelação

• corar o gel por 15 min sob um misturador (Rocker Platform RP-

50 Elmeco ou similar) à temperatura ambiente em 5 µg/ml de

brometo de etídeo diluído em tampão TBE 1x e descorar por

mais 15 min em água destilada;

• passado esse tempo, transferir o gel para um transiluminador

de luz ultravioleta e o fotografar para futura análise (sistema

fotográfico marca Polaroide).

Obs: a visualização de uma única banda de peso molecular 330

pb indicará a presença de kDNA de T. cruzi amplificado, PCR

positiva (Sturm et al., 1989).

Amplificação do DNA da β-globina

Nos casos em que a amostra biológica apresentar PCR negativa, realizar uma nova amplificação, empregando iniciadores específicos para o gene da ß-globina humana. Essa nova amplificação permite controlar a qualidade da extração do DNA e saber se o resultado negativo não é devido a fatores inibitórios presentes no sangue (Rolfs et al., 1992).

Utilizar o mesmo protocolo citado nas etapas anteriores, exceto os oligonucleotídeos que serão substituídos por PCO3 (5'-ACACAAACTGTGTTCACTAGC-3') e PCO4 (5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3') (Saiki et al., 1985). O número de ciclos térmicos também deverá ser alterado para 25.

Cuidados a serem tomados durante a execução da técnica de PCR

Vários procedimentos deverão ser seguidos para evitar a contaminação das amostras submetidas a PCR (Wright & Wynford-Thomas, 1990; Sarkar & Sommer, 1990; Kitchin & Bootman, 1993):

• executar o isolamento e a amplificação do DNA em capela

(Tamer Template Tm 14500 - Coy Corporation ou similar) e

câmara de fluxo laminar (modelo 10557 - EACI ENVIRCO -

Environmental Air Control Inc. ou similar) individualizadas;

• empregar materiais de consumo novos (não reciclados);

• distribuir os reagentes em pequenas alíquotas, incluído o kit

com a enzima;

• utilizar apenas ponteiras protegidas com uma barreira de filtro;

• empregar tubos de microcentrífuga (modelo Safe-lock de 1,5

ml e 0,5 ml - Eppendorf ou similar) que apresentem um sistema

de lacre para evitar extravasamento das amostras durante a

homogeneização;

• todo o material permanente, incluindo os aparelhos, deverão

ser "limpos" com hipoclorito de sódio e submetidos à luz

ultravioleta. Utilizar as lâmpadas ultravioletas (UV) do aparelho

Stratalinker (modelo 1800 - Stratagene) para degradação de

DNA exógeno. De preferência processar todas as etapas em

salas com sistema de UV no teto;

• durante toda a execução da técnica, usar luvas, que deverão

ser trocadas e descartadas a cada amostra processada

• realizar o manuseio do produto amplificado em uma sala em

separado, com equipamentos também individualizados e

geralmente por um profissional que não tenha trabalhado na

extração e preparação dos reagentes;

• na etapa da pré-amplificação, todos os tubos com os reagentes

deverão ser deixados em banho de gelo até o momento de

serem introduzidos na máquina de amplificação.

Método 2: Amplificação de fragmento de DNA nuclear

Extração de DNA

• isolamento de DNA de sangue total ou de soro de paciente

chagásico;

• a 100 µl de soro adicionar 200 ml de água destilada, 50 ml de

sarkosyl a 30% e 1,5 µl de proteínase K a 20 mg/ ml. Incubar

este homogenato a 60ºC por 1 h;

• adicionar 30 ml de dodecil sulfato de sódio a 10% e

homogeneizar;

• extrair o DNA das amostras com fenol/clorofórmio, adicionar 20

µg de glicogênio e precipitar com etanol;

• suspender o sedimento de DNA em 50 µl de água e submetê-

lo a PCR;

• alternativamente, para obtenção de DNA de soro de pacientes

chagásicos poderá ser utilizada a precipitação térmica das

proteínas do soro;

• centrifugar e pesquisar o DNA do parasita no sobrenadante, via

PCR.

Reação de PCR

• a reação é realizada em 10 µl, contendo 1/100 do DNA total

isolado dos 100 µl do soro ou sangue total, 250 µM de cada um

dos desoxinucleosídeos trifosfatos, 10 pmoles de cada um dos

primers e 0,2 U de Taq DNA polimerase. Os primers utilizados

são os descritos por Diaz et al. (1992);

• a mistura de reação deve ser protegida contra evaporação por

uma camada de óleo mineral (20 ml) e submetida a 25 ciclos de

amplificação num termociclador;

• o perfil de temperatura para a desnaturação do DNA,

anelamento dos primers e cópia e extensão do segmento são os

seguintes, respectivamente: 95ºC por 60 segundos (com um

tempo inicial de 300 s a 95ºC), 53ºC por 90 s e 73ºC por 120 s

(com uma incubação final a 73ºC por 300 s);

• 1-2 µl dos produtos de amplificação são separados por

eletroforese em gel de agarose ou acrilamida e corados por

brometo de etídeo ou nitrato de prata, respectivamente;

• o produto de amplificação esperado é um segmento de DNA de

188 pares de base;

• para se precaver de possíveis contaminações, controles

internos devem sempre corridos em cada passo e amostras de

soro de indivíduos normais sempre incluídas em cada partida de

preparação de DNA

• este DNA obtido e estocado é usado como controle na

amplificação por PCR

• um controle com todos os reagentes à exceção do DNA,

também deve ser incluído em todas as partidas de amplificação.

Devem também ser incluídos soros ou sangue total de pacientes

com leishmaniose.

14.3 Índice de infectividade

Esse parâmetro é calculado para a avaliação do grau de virulência e infectividade de um certo isolado de T. cruzi, num determinado inóculo. Com infecção de um grupo mínimo de dez animais, calcula-se o percentual de camundongos que apresentaram parasitemia positiva em qualquer dia após à infecção (número de animais que apresentaram parasitemia positiva/número total de animais inoculados, multiplicado por cem).

 

14.4. Parasitismo tissular

O estudo do parasitismo tissular implica, necessariamente, no sacrifício do animal experimental; portanto, não é uma rotina a ser seguida. Quando necessário é feito pela análise de cortes histológicos de tecidos fixados ou criopreservados, nos quais os parasitas são identificados por coloração ou por reação imunocitoquímica. Quantifica-se então (a) o percentual de campos microscópicos contendo ninhos de amastigotas e/ou (b) o número de ninhos de amastigotas por área (mm 2) de corte estudado. Neste caso, conta-se o número de ninhos em dez a cinqüenta campos e após realizar o mesmo procedimento para quantificar a área do campo microscópico (ver item 14.1), expressa-se o resultado em ninhos/mm2. Pela técnica de imunofluorescência (Capítulo 15) esse procedimento fica facilitado.

Um detalhado estudo de Hanson & Robertson (1974) mostrou que durante a fase aguda da infecção por T. cruzi a densidade de parasitas nos vários órgãos correlaciona-se perfeitamente com a curva de parasitemia, especialmente no coração.

 

14.5 Parâmetros populacionais de mortalidade

14.5.1 Mortalidade cumulativa Esse parâmetro é calculado a partir da observação diária de quantos animais morrem após a infecção, indicando a cinética dessa mortalidade. É expresso sempre em percentual do número total de animais com os quais o experimento foi iniciado, excluindo-se aqueles que tiverem apresentado alguma alteração nos parâmetros de higidez (hematócrito e/ou contagem leucocitária diferencial anormais, ou problemas dermatológicos detectáveis). Pode ser expresso como percentual de mortalidade (a curva sobe) ou de sobrevida (a cura desce).

O Capítulo 20 mostra um modelo de coleta de dados para cálculo de taxas de sobrevida. A Figura 7 do Capítulo 19 mostra uma curva de mortalidade típica.

14.5.2 M50

Este parâmetro M representa o dia em que morreram 50% dos 50

animais de experimentação. É calculado a partir da planilha de mortalidade, tal como a mostrada no Capítulo 20. É comumente utilizado ao se comparar resultados de grupos de animais submetidos a diferentes gradações de um mesmo procedimento, tal como diferentes inóculos, diferentes concentrações de drogas, etc.

 

14.6 Parâmetros individuais de mortalidade e

sobrevida

14.6.1 Tempo de sobrevida

O tempo de sobrevida também é um parâmetro individual. Refere-se ao dia anterior ao da verificação da morte do animal. A análise deste parâmetro é feita apenas com o conjunto dos animais que morrem durante o curso do experimento. Geralmente é expresso como tempo média de sobrevida ± 1 desvio padrão ou como intervalo mínimo e máximo. Alguns autores preferem expressar variações no tempo de sobrevida como freqüência (%) em relação a intervalos de tempo definidos (por exemplo semanas). Isso implica correlacionar cineticamente quando a maioria dos animais morre frente a um determinado inóculo de uma determinada cepa, exprimindo também qual a taxa de sobrevida após o tempo de estudo. Consideram-se sessenta dias como um prazo razoável para se assumir que o animal entrou na fase crônica da infecção, podendo ou não desenvolver a sintomatologia da fase crônica.

 

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