Capítulo 15 - Quantificação de marcadores humorais de inflamação, de resposta imune e de lesão tissular nos animais infectados

Capítulo 15 - Quantificação de

marcadores humorais de inflamação,

de resposta imune e de lesão tissular

nos animais infectados

 

Tania C. Araújo-Jorge; Paulo R. Z. Antas; Solange Lisboa de Castro

Devido à heterogeneidade da doença tanto em camundongos como em humanos, os parâmetros parasitológicos (parasitemia, tempo de sobrevida, mortalidade) e imunológicos específicos (ativação de células T por antígeno de Trypanosoma cruzi e anticorpos antiparasita) podem não se correlacionar diretamente com o grau de lesão. O acompanhamento de parâmetros inflamatórios e do desenvolvimento de lesões tissulares durante o curso da infecção por T. cruzi pode ser bastante informativo.

Como foi discutido nos Capítulos 4 e 9, diferentes aspectos da resposta inflamatória e imune podem ser estudados experimentalmente em camundongos infectados pelo T. cruzi. A avaliação dos níveis ou da atividade de diferentes componentes destas respostas é feita em material colhido dos animais em diferentes tempos após a infecção, seja por acompanhamento individual de um mesmo animal por longo tempo, quando apenas sangue, fezes e urina podem ser colhidos, seja por sacrifício do animal, quando então células provenientes de diferentes tecidos podem ser analisadas, bem como seus produtos de secreção.

O sangue é um material valioso, especialmente para a análise dos componentes humorais das respostas inflamatória e imune. Plasma ou soro podem ser obtidos, a depender do uso ou não de anticoagulantes, respectivamente. Dosagens de imunoglobulinas totais e específicas, em seus diversos tipos e isotipos, de complexos imunes, de citocinas, de proteínas de fase aguda, de moléculas de adesão solúveis, de enzimas, de metabólitos de nitrogênio (por exemplo, óxido nítrico), sais e outros oligoelementos, são parâmetros que podem ser pesquisados e acompanhados no plasma ou no soro, tanto individualmente como em agrupamentos de pool. Os procedimentos para coleta de sangue, plasma ou soro já foram descritos no Capítulo 13. No presente capítulo vamos nos concentrar nos procedimentos para análise de marcadores humorais de inflamação e de resposta imune ativas, bem como de lesão muscular e miocárdica.

Partimos então do pressuposto que o experimento foi realizado e foi colhido sangue de animais individuais, que rendeu, por animal, até 30 µl de plasma ou soro por sangria na cauda ou no plexo orbitário, ou até 500 µl por sangria com punção cardíaca. O material pode ser analisado individualmente ou em pool.

Vamos nos deter em ensaios que utilizam espectrofotômetro de microplacas (leitor ELISA) por considerá-los extremamente práticos e confiáveis, e disponíveis na maioria dos laboratórios de pesquisa em imunoparasitologia. Serão descritos protocolos para:

ELISA

• sorologia específica (convencional) e não específica (resposta

humoral)

• dosagem de proteínas de fase aguda: SAP (resposta

inflamatória)

• dosagem de citocinas: IFN-γ e TNF-α (respostas inflamatória e

humoral)

Ensaios em microplaca

• dosagem de CK e CKMB (lesão tissular)

15.1 ELISA: sorologia específica (convencional),

não específica e proteínas séricas diversas

O método de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) é um ensaio imunoenzimático, onde se aproveita, entre outras coisas, o princípio de interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac). Este princípio tem como fundamentos:

• todo Ag tem a propriedade de gerar, in vivo, um Ac, dado por

sua própria nomenclatura (antigen = antibody generator);

• todo Ag tem uma alta constante de afinidade (Kd) por seu Ac;

• epitopos antigênicos de uma molécula geram distintos

anticorpos (Acs) para si;

• uma vez ligados, Ags e Acs dificilmente podem ser separados,

graças às interações que ocorrem;

• dado o princípio de maturação da afinidade, certos Acs serão

o "espelho" dos Ags que os geraram.

O método de ELISA se constitui essencialmente de uma hierarquia de interações Ag=Ac, onde em cada etapa temos atuando os mesmos fundamentos. Esta hierarquia (ou "pirâmide") está calçada em um suporte, ou matriz, que geralmente é uma placa de poliestireno, material ideal para a primeira ligação (revestimento). Uma vez ligado à placa, dificilmente se consegue reverter a interação, daí as placas para ELISA serem descartáveis.

Após sucessivas etapas, onde se varia grandemente o pH, o último procedimento também se baseia em outra propriedade, esta agora um fundamento bioquímico:

• toda enzima possui o seu substrato e com ele poderá interagir,

respeitando-se o pH, a temperatura, o tampão e os co-fatores

necessários à reação.

No final do experimento, pode-se observar uma cor intensa nas cavidades da placa, o que se considera um padrão de positividade. Porém nuances de cor também ocorrem, até se chegar ao transparente, ou branco. Para se quantificar essas diferenças, usa-se um aparelho do tipo espectrofotômetro para microplaca (ELISA reader), para se distinguir o gradiente de cor, que quantificará a densidade óptica (DO) de cada poço da placa, comparando esta a do ar ou a de outro poço que seja definido como padrão negativo de reação. Os aparelhos mais modernos acoplam-se a programas computadorizados para cálculos diversos, que podem definir limiares, tirar médias, fazer regressões lineares e logarítmicas e calcular automaticamente a concentração de um poço-teste quando fornecida a de uma curva-padrão referência. Destacaremos os protocolos para a obtenção dos dados e trataremos apenas brevemente da análise dos dados gerados.

As etapas gerais de um ELISA são:

• revestimento das placas com o Ag ou o Ac de captura;

• bloqueio de sítios inespecíficos de ligação na placa;

• incubação com o material para teste e padrões para serem

capturados;

• incubação com o Ac para revelação da ligação do antígeno ou

anticorpo capturado;

• revelação desse Ac (direta, se estiver diretamente conjugado

à enzima traçadora, ou indireta, se depender de outra etapa de

revelação ou amplificação), através de um ensaio de atividade

enzimática com o substrato apropriado para a enzima usada

como marcadora do Ac;

• leitura no espectrofotômetro e análise dos resultados.

Em qualquer ELISA os tampões utilizados nas diferentes etapas visam variar o pH.

• pH 9,6: o pH alcalino é o ideal para a sensibilização e o

bloqueio da placa, uma vez que a ligação de proteínas à placa

de poliestireno é facilitada neste pH. Pode-se adicionar azida

sódica (NaN ) como agente preservativo no tampão nestas 3

etapas, pois ainda haverá muitas lavagens antes da incubação

com o anticorpo conjugado à enzima;

• pH 7,0 - 7,4: o pH neutro é empregado a partir da lavagem da

placa, até a incubação com o substrato;

• pH 4,0 - 4,2: o pH ácido é o ideal para que a peroxidase clive

a H O . Deve ser ajustado de acordo com a enzima utilizada 2 2

como traçador.

Utilizam-se três tipos básicos de ELISA, cujos princípios são:

• captura: baseia-se no uso de um Ag aderido à placa, para a

captura dos Acs por ele gerados. É o ELISA empregado em

sorologias de rotina.

• sanduíche: baseia-se na formação seqüencial de um

"sanduíche" de Ac-Ag-Ac, quando as placas são revestidas com

um anticorpo muito específico para a captura de um Ag

específico. Necessita um par de Acs bem específicos para o Ag

que se quer detectar, gerados em animais de espécies

diferentes. É o ELISA usado para a dosagem de Ags

circulantes, imunocomplexos, citocinas, proteínas séricas,

anticorpos idiotípicos e antiidiotípicos. etc.

• competitivo: este ELISA se fundamenta na competição entre

um Ag solúvel, que se quer quantificar, e outro com as mesmas

características e especificidades, com o qual se revestiu a

placa, por um Ac específico para esse Ag. Substitui o ELISA

sanduíche quando não se dispõe de um par de Acs, mas sim de

um Ac específico e do Ag purificado.

Muitos sistemas já são comercializados em forma de kits para a dosagem de diversas proteínas, bem como para o sorodiagnóstico de certas infecções. Na maioria dos kits a placa já vem sensibilizada e bloqueada, iniciandose as reações na terceira etapa.

As enzimas mais utilizadas em ensaios ELISA são peroxidase e fosfatase alcalina. Descreveremos protocolos com o uso de peroxidase, mas que podem ser adaptados para o uso de conjugados marcados com outras enzimas. O substrato para peroxidase é tetra-metil-benzidina (TMB), que dá um produto de reação azul, lido a 450 nm. O substrato para fosfatase alcalina é o nitro-fenil-fosfato (NPP), que dá um produto amarelo, lido a 405 nm. Um cuidado importante é não utilizar azida nestas últimas etapas, pois ela inibe a ação da peroxidase.

Descrevemos a seguir o material de uso geral para ELISA, seguido de protocolos de preparo de Ag para sorologia específica anti T. cruzi ou então de sistemas de ELISA para quantificação de imunoglobulinas ou isotipos totais, proteínas de fase aguda e citocinas que podem indicar a evolução da resposta inflamatória e imune.

Material

• protocolo de distribuição das amostras na placa (sempre em

triplicata, e sem esquecer poços controles para PBS -branco)

• placas de polistireno ELISA fundo chato (existem placas

apropriadas para melhor adsorção do Ag)

• tubos de microcentrífuga

• placas de microtitulação para diluição, fundo em U

• micropipetas monocanal e multicanal de 20 a 200 µl

• ponteiras para as micropipetas, em suportes adequados

• cubas para as soluções de Ac

• recipiente para tampão de lavagem

• filme plástico de PVC

• papel ou tecido absorvente

• cuba para descarte de líquidos

• cuba para neutralização de placas acidificadas

• estufa ou banho-maria para incubação a 37ºC

• leitor espectrofotométrico de microplacas

• um sistema de aspiração/lavagem de placas é recomendável,

composto por bomba de vácuo, recipiente para tampão de

lavagem e sistema para distribuição para lavadora automática

• todos os Acs conjugados a enzimas ou outros traçadores

precisam ser prévia e periodicamente titulados e aliquotados,

além de ter sua especificidade previamente testada.

A Tabela 1 mostra as soluções utilizadas no ELISA. Quando se prepara um ELISA com 50 µl de Ag/poço, calcula-se um consumo de 6 ml/placa. Para 100 µl/poço, calcula-se um consumo de 12 ml/placa

Tabela 1 – Soluções usadas para ELISA

 

1 solução NaCl 0,85% (154 mM)

15.1.1 Sorologia específica anti T. cruzi por ELISA

Preparo de Antígeno

a. Parasita fixado em paraformaldeído

Pode-se usar quaisquer dos estágios do T. cruzi como Ag particulado para captura de imunoglobulinas anti T. cruzi. Os métodos que dão maior rendimento de parasitas são os mais comumente empregados (ver Capítulo 10): cultura de epimastigotas em meio LIT, metaciclogênese para obtenção de tripomastigotas metacíclicos em meio definido, cultura de células para obtenção de amastigotas ou tripomastigotas. Podem ser utilizados em reações de imunofluorescência (103 5 3 5 a 10 /poço) ou ELISA (2 x 10 a 2 x 10 células/poço). Os antígenos particulados favorecem especialmente a captura de IgM, pois os epitopos de carboidratos, muito reativos a IgM, são preservados.

Com qualquer dos procedimentos para obtenção dos parasitas, para serem utilizados como Ag, após sua obtenção eles deverão passar pelas seguintes etapas:

• lavar 2x em tampão;

• fixar em paraformaldeído 1% por 15 min ou 0,1 % por 24 h;

• lavar 2x em tampão;

• contar o número de parasitas em câmara de Neubauer;

• ajustar a concentração para 108 parasitas/ml (100X

concentrado);

• preparar alíquotas para uso (5 x 104 parasitas/poço, em 50 µl):

6 ml de suspensão a 106 parasitas/ml para cada placa de

ELISA ou 5 ml de suspensão a 5x 106 parasitas/ml para dez

lâminas de imunofluorescência (5 µl/poço nas lâminas).

Obs: um cuidado adicional pode ser tomado, com o tratamento

inicial das placas com etanol 70% por 10 minutos, seguido de

descarte do etanol e secagem com vento (secador de cabelos).

b. Ags solúveis de T. cruzi (congelamento e descongelamento)

Para a quantificação de IgG e outros isotipos de Ig, costuma-se dar preferência ao uso de frações antigênicas solúveis dos parasitas, epi-, ama- ou tripomastigotas. São preparados como se segue:

• obter os parasitas (2 x 109 células/ml);

• lavar 3x em solução salina com centrifugação a 2.000g;

• ressuspender 1:3 em água destilada;

• realizar três a cinco ciclos de congelamento e

descongelamento, utilizando-se banhos de nitrogênio líquido ou

gelo seco alternado com banho-maria a 37ºC;

• centrifugar a 26.000 g por 1 h a 4ºC;

• recuperar o sobrenadante;

• dialisar o sobrenadante contra PBS pH 7,4;

• quantificar o teor de proteína (medida da DO a 280 nm);

• liofilizar (optativo) ou aliquotar a 10-100 µg/ml em PBS com

0,1% de azida sódica, mas sem detergente nem proteína extra.

Obs: o Ag é utilizado a 1 a 10 µg/ml, num volume de 50 µl para

os poços nas placas ELISA.

Existem outros protocolos para preparo de Ags de T. cruzi, por processos variáveis de extração química e, mais recentemente por produção de Ags recombinantes. Os métodos acima citados são os que fornecem Ags brutos para captura de Acs, o que pode levar à reações cruzadas com infecções por outros tripanosomatídeos, mas que são absolutamente úteis e suficientes para a avaliação da resposta imune humoral de animais experimentalmente infectados.

Anticorpos anti-isotipos conjugados a enzimas

O Ag de T. cruzi usado vai capturar Igs dos diversos isotipos, e a sorologia determinará Ig total, IgG, IgM ou qualquer outro isotipo que se pretenda investigar, a depender do Ac utilizado na etapa de detecção e revelação da imunoglobulina capturada. Muitos fabricantes comercializam Acs (simples e conjugados a enzimas) para esta finalidade. Para um ELISA mais rápido, recomenda-se que este Ac anti Ig ou isotipo de camundongo já seja conjugado com peroxidase. É importante o teste prévio de reatividade do conjugado enzimático tanto ao Ag usado para sensibilizar a placa, como ao agente usado para bloqueio. Às vezes, em função dessa reatividade cruzada, que leva a altas leituras nos poços controles sem o soro teste, é necessária a mudança do bloqueador, de BSA para leite desnatado, ou para soro normal da espécie em que foi obtido o conjugado. É importante também que o conjugado seja previamente titulado com diluições seriadas sobre placas revestidas com soro normal de camundongo 10%.

Procedimento para sorologia anti T. cruzi

A Tabela 2 resume a seqüência de etapas do ELISA para a sorologia anti T. cruzi. Para esse procedimento seqüencial, ressaltamos as seguintes observações:

• as soluções estoque dos Ags devem ser aliquotadas em

volumes suficientes para até cinco placas, em PBS. Evitar

congelar e descongelar repetidamente as mesmas alíquotas.

Pode-se adicionar 0,1% de azida sódica (NaN ) como 3

preservativo para evitar contaminação (concentração final de

uso: 0,01%);

• a etapa de sensibilização pode ser feita no dia anterior, com a

incubação das placas com o Ag na geladeira. Não é necessária

lavagem da placa antes do bloqueio;

• a solução de bloqueio pode variar e deve ser testada para

cada ELISA durante sua padronização. Pode-se usar BSA 1%,

leite desnatado 4%, ou glicina 1%. Verter a placa com o Ag,

bater sobre tecido absorvente e colocar a solução de bloqueio;

• as placas sensibilizadas e bloqueadas podem ser estocadas

na geladeira, mas sua eficácia para capturar o Ag deve ser

testada para determinação do prazo de validade;

• para todas as etapas de lavagem (três vezes) é preciso verter

a solução final de tampão, bater bem a placa em tecido

absorvente para retirar o excesso;

• opcionalmente, pode-se proceder nas etapas de incubação

com PBS-T, obtendo-se a mesma eficácia.

Tabela 2 – Etapas seqüenciais na realização do ELISA de captura

 

1 Ag Epi fixado; 2 Ag solúvel; 3 para soro de camundongo; 4 para

soro humano

15.1.2 Captura de Ig's totais e isotipos para sorologia não específica

(ELISA sanduíche)

Uma das características clássicas da infecção experimental por T. cruzi é a ativação policlonal e a hipergamaglobulinemia poliisotípica (ver Capítulo 4), com destaque para os isotipos IgG2a e IgG2b. O sistema mais simples de monitoramento deste processo é o ELISA sanduíche, como descrito no item 15.1.

Material

• os mesmos reagentes usados para ELISA (Tabela 1)

• imunoglobulina purificada para construção de curva padrão

(opcional); a opção simples para cálculo das variações nos

níveis de Ig's observadas a diferentes dias pós-infecção é o

cálculo da razão entre a DO obtida com as amostras infectadas

em relação à DO média de amostras colhidas dos animais

antes da infecção, ou de controles não infectados com a

mesmo tempo de cativeiro e experimentação que os infectados

• pares de anticorpos para o sanduíche (Tabela 3)

Tabela 3 – Pares de anticorpos para a sorologia não específica

 

PO: peroxidase

1 deve ser específico para Ig de camundongo, com um mínimo de

reação cruzada para o 1º Ac

2 deve ser específico para o 2º Ac, com um mínimo de reação

cruzada para o 1º Ac e para Ig de camundongo

Procedimento

De um modo geral é necessário primeiro um ajuste do protocolo aos títulos dos Acs disponíveis, cumprindo-se sempre o seguinte conjunto de experimentos preliminares (padronização dos ensaios):

• curva de titulação do Ac conjugado à peroxidase frente a soro

normal das várias espécies que serão usadas no ensaio (o 1º e

o 2º Acs e o soro de camundongo). A melhor diluição é a que

fornece menor leitura sobre o 1º Ac e sobre o soro de

camundongo, e maior sobre o 2º Ac

• curva de sensibilização: diluições seriadas do 1º Ac com

concentrações fixas dos demais reagentes nas etapas

posteriores

• curva de detecção: diluições seriadas do 2º Ac com

concentrações fixas dos demais reagentes nas etapas

anteriores e posteriores

• curva de titulação das amostras de camundongo, com uma

amostra sabidamente positiva e outra sabidamente negativa,

para a escolha das melhores três diluições onde as diferenças

de leitura de DO entre positivos e negativos possam ser

máximas.

Uma vez estabelecidas as concentrações ideais para cada etapa, procede-se ao ELISA com a seqüência de etapas enumeradas na

Tabela 4.

Tabela 4 – Etapas seqüenciais no ELISA sanduíche

 

As demais etapas de revelação da peroxidase (PO) seguem como

na Tabela 2.

15.1.3 Dosagem de proteínas de fase aguda: SAP (ELISA de captura)

A detecção de proteínas de fase aguda no plasma de animais infectados é indicativa do início da resposta imune inata (ver Capítulo 4), e indicativas da ação de IL-6, IL-1 e TNF-α. Como não existem reagentes comerciais disponíveis para a maioria destas proteínas no modelo murino, descreveremos apenas um ELISA simples para a quantificação dos índices de variação de SAP (proteína amilóide P sérica), o principal reagente de fase aguda no camundongo, com a ressalva de que nem todas as linhagens de camundongos desenvolvem níveis semelhantes de aumento de SAP (ex.: C3H, Balb/C). A SAP apresenta-se em níveis indetectáveis nos animais normais e aumenta de 10 a 1.000 vezes após a primeira semana de infecção na linhagem C57BL/6, que é tipicamente boa respondedora para SAP. É bastante comum pesquisadores que trabalham com esta e outras proteínas de fase aguda cederem, de bom grado, soros produzido experimentalmente em seus laboratórios para a montagem de sistemas de detecção e quantificação.

Material

• os mesmos reagentes usados para ELISA (Tabela 1)

• soro ou Ac purificado anti SAP (fonte comercial: Calbiochem;

IgG de coelho anti SAP): titular previamente ante SAP

purificada ou a plasma de camundongo C57BL/6 após sete a

dez dias de infecção

• conjugado específico para revelar o anti SAP (cabra anti IgG

de coelho) e com mínima reação cruzada com soro de

camundongo

Procedimento

Nesse ELISA revestimos as placas com diferentes diluições do soro de camundongo a ser testado (em uma analogia com Western blot) e detectamos a presença da proteína.

Tabela 5 – Etapas para dosagem de SAP

 

PO: peroxidase

15.1.4 Dosagem de citocinas: INF-γ e TNF-α

A dosagem de citocinas no plasma ou soro pode ser hoje feita de rotina com kits comerciais para ELISA que fornecem resultados confiáveis e reprodutíveis, com base no princípio do ELISA de captura descrito no item 15.2.2. A diferença é que estes kits geralmente utilizam Acs monoclonais contra as citocinas-alvo (e portanto extremamente específicos) como 1º e 2º Acs, e constroem sempre uma curva padrão com a citocina recombinante em concentrações conhecidas. Além disso, se o 2º Ac for biotinilado ele pode ser obtido da mesma espécie do 1º Ac, e a revelação pode ser feita pela incubação com estreptoavidina(EA)-peroxidase, o que minimiza muito a reação cruzada de fundo, posto que a EA não reage (ou apenas minimamente) com as imunoglobulinas usadas para o sanduíche, nem com possíveis contaminantes no plasma testado. O uso de Acs monoclonais dos kits comerciais pode ser substituído pelos mesmos Acs, pois pode-se obter os respectivos hibridomas produtores seja comercialmente (ATCC ou outro banco comercial de células) ou por intermédio de cessão por pesquisadores da área, e usá-los para padronizar ensaios sob a forma de sobrenadantes ou de ascites.

As citocinas mais comumente monitoradas, que apresentam aumento na fase aguda em todos os modelos experimentais já testados são IFN-γ e TNF-α. Alguns ensaios de atividade funcional das citocinas também podem ser de interesse, mas não serão objeto desse manual, e recomenda-se a procura de literatura específica (Current Protocols in Immunology, 1991, ou Immunology Methods Manual - A Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1997, ou Methods in Cell Biology vol. 49, 1995).

Os mesmos materiais e procedimentos descritos no item 15.2.2 são utilizados para a dosagem de IFN-γ e TNF-α com as diferenças dos

Acs. A Tabela 6 sumariza alguns dos Acs usados para essa finalidade.

Tabela 6 – Anticorpos usados

 

15.2 Ensaios em microplaca: dosagem CK e

CKMB

É bem conhecido que, em processos patológicos, danos tissulares são acompanhados por liberação de enzimas na corrente sangüínea e que a identificação de isoenzimas correspondentes revela a fonte de tecido específico que foi danificado, e portanto no qual o processo patológico está em curso. Uma série de estudos feitos por Teresa Mercado analisando bioquimicamente a expressão de diversas isoenzimas nos tecidos de camundongos infectados indicaram que aumentos substanciais de creatino fosfokinase total (CK), bem como de suas isoformas típicas de músculo esquelético (CK-MM) e cardíaco (CK-MB) podem ser observadas. Adaptamos o método de dosagem laboratorial de CK e CKMB humanas para volumes menores disponíveis em análises individuais de camundongos e confirmamos que seu aumento pode ser indicativo de lesão tissular ativa. O protocolo que usamos atualmente é o seguinte:

Material

• amostras de plasma ou soro, mantidas congeladas a -20ºC

• kit comercial para dosagem de CK-MB humana sérica (Merck)

• placas de microtitulação para diluição, fundo em U

• protocolo de distribuição das amostras na placa (em duplicata,

e sem esquecer poços controles para PBS branco)

• micropipetas monocanal e multicanal de 20 a 200 µl

• papel de filtro no tamanho das placas embebido em água

• ponteiras para as micropipetas, em suportes adequados

• cubas para as soluções

• leitor espectrofotométrico de microplacas com filtro a 340 nm

Obs1: é recomendável um sistema de leitura cinética das placas no leitor

Obs 2: os ensaios devem ser feitos em duplicatas

Procedimento

• preparar protocolo de aplicação dos plasmas na placa, com a

cinética a ser estudada sempre em colunas verticais (não

infectado/ dia x, dia 2x, dia 3x, etc.);

• preparar meio de incubação para revelação da enzima

segundo as instruções do fabricante (mistura do tampão com os

reagentes específicos);

• preparar programa de leitura seqüencial das placas no

espectrofotômetro, a 340 nm a cada minuto, por 5 min;

• colocar 5 µl de plasma de cada amostra nos respectivos

poços cobertura da placa com papel de filtro embebido em água

para evitar o ressecamento até a aplicação do meio de

incubação;

• aplicar 125 µl do meio de incubação com pipeta multicanal em

uma única placa (não aplicar várias placas ao mesmo tempo);

• aguardar 3 min e ler seqüencialmente a DO a cada minuto,

por 5 min;

• repetir a operação de aplicação do meio de incubação/leitura

cinética para cada uma das outras placas previamente

preparadas com os plasmas a serem testados;

• calcular em planilha apropriada a diferença de DO medida

entre cada um dos sucessivos minutos ([5º-4º] , [4º-3º], [3º-2º],

[2º-1º]) de modo a ter quatro valores de diferença (ΔE) e poder

calcular a média (ΔE/min);

• calcular como padrão negativo a média de ΔE/min de

diferentes amostras não infectadas;

• calcular um índice de variação entre os valores obtidos nas

amostras infectadas, seja em relação ao nível individual do

animal pré-infecção, ou então em relação ao valor médio obtido

como padrão negativo.

 

15.3 Protocolos para microplaca e obtenção de

resultados

Todos os testes com microplacas precisam ser bem acompanhados com protocolos indicativos da localização de cada amostra na placa, bem como do protocolo usado no ensaio. Anexamos a seguir alguns exemplos de protocolos que podem ser copiados e adaptados.

A cada protocolo de trabalho corresponde uma leitura de DO ao espectrofotômetro, ou até a mais de uma, no caso de leituras a diferentes intervalos de tempo (ex. CK). É extremamente importante que planilhas de análises destes dados sejam bem preparadas, para que a média de triplicatas possa ser obtida, o cálculo de valor cut-off possa ser feito, bem como o cálculo dos índices de variação em relação ao valor padrão que se tomou. Este pode ser a média de valores normais, ou então o valor individual do animal antes da infecção. Essa escolha é do pesquisador e das condições de experimentação.

Alguns cuidados devem ser tomados:

• as amostras a serem estudadas em uma diluição pré-fixada

(sem diluição seriada) devem ser avaliadas sempre em

triplicatas (no mínimo em duplicatas); quando os soros forem

analisados em diluição seriada, as duplicatas constituem um

bom cuidado a tomar, mas podem ser dispensadas;

• o estudo cinético de amostras de um mesmo animal deve,

sempre que possível, ser colocado na mesma coluna, ou em

colunas colaterais;

• nunca deve-se esquecer de reservar numa placa espaço para

o branco (PBS ao invés de soro), para um soro controle

sabidamente positivo, e para três soros sabidamente negativos.

Estes últimos permitirão calcular um limite de exclusão (cut-off)

com seis a nove amostras no mínimo.

Apresentamos, a seguir, um exemplo de organização de planilha de cálculo e de análise dos níveis de IgG anti T. cruzi em animais infectados, no qual foram ensaiadas duas placas com cinco soros cada, numa cinética dos dias 0, 1, 8, 20 e 41 pós-infecção (dpi) para os grupos controle (não infectado) e infectado. Neste experimento o interesse era comparar a variação de IgG a cada dia com o valor obtido individualmente nos animais antes da infecção. Por isso foi calculada a média e somados dois desvios aos resultados de cada animal no dia 0, e calculado o índice de variação de cada animal ao longo da infecção. Os animais não infectados foram analisados de modo semelhante, como controle interno do experimento.

Protocolos das placas

Leituras obtidas no espectrofotômetro

 

dpd = desvio padrão; coff = "cut off"

Planilha de resultados: Expressão em IV

 

A figura abaixo expressa graficamente estes resultados. A análise estatística (ver Capítulo 19) foi feita e indicou aumento significativo nos dias 20 e 40 pós-infecção.

Figura 1 – Valores de índice de variação (IV) para IgG anti

Trypanosoma cruzi para animais dos grupos controle e infectado