4.5 O timo como órgão-alvo na infecção pelo Trypanosoma cruzi

Figura 3 — Principais interações de citocinas e células que podem

resultar em modulação da resposta imune em camundongos

infectados com Trypanosoma cruzi. Mf: macrófagos, NK: células

natural killer, NO: óxido nítrico, Th: células T auxiliar. Setas

contínuas indicam ativação e setas interrompidas indicam inibição.

Ver explicações no texto.

4.5 O timo como órgão-alvo na infecção pelo

Trypanosoma cruzi

Vinícius Cotta-de-Almeida; Wilson Savino O sistema imunológico é determinante na resistência antiparasitária durante o curso da infecção pelo Trypanosoma cruzi (Tarleton, 1991, 1995). Isto pode ser verificado quando camundongos atímicos são infectados pelo T. cruzi (Gonçalves-da-Costa et al., 1984), bem como após depleção específica de linfócitos T CD4+ (Minoprio et al., 1987; Russo et al., 1988) ou de CD8+ (Tarleton, 1990). Nesses animais ocorre aumento de parasitemia, concomitante a um alto grau de parasitismo tecidual, com uma diminuição no infiltrado inflamatório intracardíaco, demonstrando assim, que ambas as subpopulações CD4 e CD8 parecem ser relevantes no controle da infecção (Tarleton, 1991, 1995).

Paralelamente, diversas alterações no ramo celular da resposta imunológica celular podem ocorrer como, por exemplo, uma ativação policlonal maciça concomitante a uma imunossupressão (revisado em Minoprio et al., 1989). Destaca-se ainda uma diminuição na produção de IL-2 (Harel-Bellan et al., 1983; Nabors & Tarleton, 1991), redução na expressão de moléculas de superfície de linfócitos T (Kierszenbaum et al., 1989) e presença importante de apoptose de linfócitos T (Lopes et al., 1995).

Outro ponto relevante refere-se à presença de um componente auto-imune na miocardite da fase crônica da doença (Takle & Hudson, 1988; Cunha-Neto et al., 1995). Nesse fenômeno, foi sugerida a participação de linfócitos T, após estudo em camundongos, mostrando que as células T CD4+ são responsáveis pela efetuação de uma resposta auto-imune antimúsculo cardíaco que ocorre em animais cronicamente infectados (Ribeiro-dos-Santos et al., 1992). Entretanto, a demonstração de que células CD8+ predominam em sítios inflamatórios no coração de pacientes chagásicos (D'Avila Reis et al., 1993a) sugere uma participação dessas células na lesão cardíaca da fase crônica.

Esses distúrbios na imunidade celular nos levam a imaginar um possível comprometimento também na geração de células T. De fato, a influência do timo no curso da infecção pelo T. cruzi pode ser evidenciada pela noção de que a infecção em animais timectomizados (Schmunis et al., 1971) ou em camundongos atímicos (Kierszenbaum & Pienkowski, 1979; Gonçalves-da-Costa et al., 1984), apresenta-se com um grau maior de severidade, com os animais apresentando parasitemia e mortalidade mais altas. É importante ressaltar que a timectomia em animais adultos, seguida de infecção pelo T. cruzi, determina nestes animais redução na resposta policlonal de linfócitos B, e que pode ser evidenciada diminuição no número de células secretoras de Ig, principalmente em relação aos isotipos de IgG (Minoprio et al., 1989). Além disso, a detecção de formas amastigotas no timo (Savino et al., 1989) demonstra como este órgão pode ser diretamente afetado na infecção pelo T. cruzi.

Antes de descrevermos as diversas alterações que ocorrem no timo após a infecção pelo T. cruzi, é importante ressaltar alguns aspectos da fisiologia deste órgão.

4.5.1 O Timo e a Diferenciação de Células T

O timo é um órgão linfóide primário onde células precursoras dos linfócitos T se diferenciam e aqueles selecionados para sobreviver, ao terminar o processo de maturação, deixam o órgão e vão se localizar nas regiões timo-dependentes dos órgãos linfóides periféricos. Esse processo ocorre em íntimo contato com o microambiente tímico, uma rede tridimensional formada essencialmente por células epiteliais, células dendríticas, macrófagos e elementos da matriz extracelular (ver revisões de Boyd et al., 1993; Savino et al., 1993; Anderson et al., 1996).

As células epiteliais tímicas (TEC) formam o principal componente celular do microambiente tímico e apresentam significante heterogeneidade morfológica e fenotípica (Boyd et al., 1993). As TEC são capazes de produzir diversas citocinas que estão envolvidas na proliferação e diferenciação de timócitos (ver revisão de Carding et al., 1991). Além disso, uma característica fundamental das TEC é a expressão de moléculas de classe I e classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), capazes de apresentar peptídeos ao receptor clonal de células T (TCR) expresso pelos timócitos, com a participação, respectivamente, dos coreceptores CD8 e CD4, também expressos na superfície dos timócitos.

Dentre as TEC, é importante destacar um grupo de células que apresenta um certo grau de organização celular e possíveis funções específicas, os complexos linfo-epiteliais denominados de células nurse do timo (TNC). Estes complexos, compostos de uma célula epitelial envolvendo de dois a duzentos timócitos, obtidos a partir de digestão enzimática de fragmentos de timo, foram primeiramente descritos por Wekerle & Ketelsen (1980). Eles parecem ser relevantes no processo de diferenciação, provavelmente participando em eventos de seleção positiva e negativa de timócitos (Kyewski, 1986; Aguilar et al., 1994). Os complexos TNC têm provável localização na região cortical tímica (Kyewski & Kaplan, 1982; Houben-Defresne et al.,1982; van de Wijngaert et al., 1984; van Vliet et al., 1984; Andrews & Boyd, 1985), e os timócitos intra TNC (TNC-T) apresentam características fenotípicas e funcionais de células imaturas (Kyewski & Kaplan, 1982; van Vliet et al., 1984; de Waal Malefijt et al., 1986; Leene et al., 1988; Li et al., 1992; Philp et al., 1993). Entretanto, ensaio em membrana cório-alantóica, onde TNCs de galinha são depositadas e TNC-T interagem com moléculas de MHC classe II expressas nessa membrana, demonstrou freqüência alta de TNC-T com capacidade alo-reativa e auto-reativa (Wick & Oberhuber, 1986; Wick et al., 1991; Penninger & Wick, 1992). Além disso, as TNCs secretam hormônios tímicos e citocinas, expressam proteínas de MHC classe I e classe II, produzem proteínas de matriz extracelular e ainda apresentam junções comunicantes (ver revisão Villa-Verde et al., 1995).

É no contexto deste microambiente de TEC, macrófagos e células dendríticas, e de matriz extracelular, que ocorre um intenso processo de migração, concomitante a um vasto corpo de interações celulares e moleculares desde a chegada de precursores até a saída de linfócitos T imunocompetentes do timo. Durante a diferenciação, as células precursoras passam por diversos estágios de maturação, caracterizados, em parte, pela expressão diferencial de algumas moléculas de superfície (para revisão, ver Fowlkes & Pardoll, 1989; Godfrey & Zlotnik, 1993).

As primeiras células linfóides a colonizarem o timo, os pró-timócitos, foram identificados em camundongos como precursores, expressando baixas quantidades de CD4 (CD4 lo), sendo negativos para CD8 e CD3 (Wu et al., 1991), mas positivos para CD44. Em seguida estas células começam a expressar CD24 e CD90 (Thy-1) em níveis mais altos, perdem a molécula CD4, e passam a expressar também CD25, resultando na subpopulação de timócitos CD4- -CD8TCR-, referidos como triplo-negativos. Neste estágio as células passam a estar comprometidas com a linhagem de células T (Godfrey & Zlotnik, 1993), sendo precursoras das outras subpopulações timocitárias: os timócitos duplo-negativos, os timócitos imaturos corticais CD4 + + CD8, ditos duplo-positivos, e os simples-positivos CD4+ - - + CD8 e CD4 CD8, considerados maduros

(Figura 4) e que migrarão para a periferia (revisado em Fowlkes & Pardoll, 1989; Godfrey & Zlotnik, 1993; Anderson et al., 1996).

Figura 4 - Diferenciação intratímica de linfócitos T. Adaptado a partir

de Oliveira-Dos-Santos (1997) e Godfrey & Zlotnik (1993)

Dentre essas subpopulações, é importante destacar os timócitos duplo-positivos TCRlo, que correspondem à subpopulação tímica mais freqüente e que, com a expressão do TCR/CD3, representam também o estágio no qual ocorre o principal evento da maturação timocitária, o fenômeno de seleção intratímica. Este fenômeno define quais dos inúmeros receptores gerados no processo de rearranjo do TCR darão origem ao repertório de células T maduras que povoará a periferia (Sprent et al., 1988). Dois são os processos envolvidos naquele fenômeno, a seleção positiva (Bevan, 1977) e a seleção negativa (Kappler et al., 1987). A seleção negativa tem como efeito a eliminação ou inativação de clones de timócitos com potencial auto-reativo, e a seleção positiva tem como efeito duplo permitir que as células progridam para a maturação (ao invés de morrerem) e definir o caminho de maturação. Essa definição se dá como conseqüência do reconhecimento pelos timócitos de complexos peptídeo-MHC apresentados por células do microambiente tímico (fenômeno de restrição ao MHC). Assim, paralelamente ao aumento da expressão de TCR/CD3 (Bonifacino et al., 1990), dependendo da interação com moléculas do MHC, apenas uma das moléculas acessórias, CD4 ou CD8, permanecerá (Guidos et al., 1990). Desse modo, se um linfócito T, durante o processo de desenvolvimento, reconhecer um peptídeo em associação com a molécula de MHC de classe II, será uma célula simples-positiva CD4 que não expressa CD8 e, reciprocamente, se a especificidade da célula T for dirigida a um peptídeo complexado ao MHC de classe I, expressará apenas CD8 (von Boehmer & Kisielow, 1993; von Boehmer et al., 1993). Essas subpopulações de células CD4 e CD8 agora maduras, localizadas na região medular dos lóbulos tímicos, emigrarão do órgão indo povoar as áreas T-dependentes dos órgãos linfóides periféricos (ver esquema da

Figura 4).

4.5.2 Alterações no Compartimento Linfóide após Infecção pelo T. cruzi

A atrofia é uma das principais características relacionadas ao timo em condições de imunodeficiência, estando entre elas diversas doenças infecciosas (revisado em Savino, 1990; Savino et al., 1992). Uma das características observadas na fase aguda da infecção pelo T. cruzi em murinos é uma atrofia tímica progressiva, com perda de massa e celularidade do órgão (Savino et al., 1989; Leite-de-Moraes et al., 1991). A severa diminuição na celularidade tímica se reflete, principalmente, na diminuição de células imaturas de fenótipo CD4+ + CD8 (duplo-positivas). Nesse contexto, verificou-se em paralelo um aumento na freqüência de células simples-positivas CD4+ - - + - -CD8 e CD4 CD8 e duplo negativas CD4 CD8. Além disso, a detecção de aumento na freqüência de células CD3hi corroboram a noção de que as células resistentes são, em sua maior parte, do tipo medular (Leite-de-Moraes et al., 1991). Histologicamente destaca-se uma redução na região cortical e até mesmo desaparecimento quando a atrofia é bastante intensa. Outro aspecto marcante é a presença de muitos núcleos picnóticos de timócitos na região cortical remanescente.

Como estas alterações se assemelham àquelas vistas em animais injetados com hidrocortisona, e como detectou-se no soro de animais infectados em fase aguda níveis três vezes aumentados de glicorticóides circulantes, as mesmas análises foram feitas em animais adrenalectomizados e infectados. Estas análises mostraram que o padrão das alterações se manteve semelhante àquelas descritas em animais intactos (Leite-de-Moraes et al., 1991).

Outro importante achado foi a demonstração de que toda esta modulação nas subpopulações de timócitos parece ser transitória, tendo em vista que as subpopulações de timócitos, definidos pela expressão de CD3, CD4 e CD8, retornam aos valores normais quando se analisa o timo de animais infectados na fase crônica da doença (Leite-de-Moraes et al., 1992). Nesse sentido, cabe frisar que ao final da fase aguda da doença experimental em camundongos isogênicos da linhagem C3H/HeJ, detectamos um aumento de células CD25+ e células em ciclo, que podem corresponder a timócitos em fases iniciais de diferenciação (Leite-de-Moraes et al., 1992).

Mais recentemente, a análise do repertório de timócitos de animais infectados revelou um aumento na porcentagem de células CD4-CD8+ + - + + Vb5 e CD4 CD8 Vb14, e apenas um ligeiro aumento na porcentagem de células CD4 + - + + - + CD8 Vb5 e CD4 CD8 Vb14 (Leite-de-Moraes, 1993). Estas alterações ao nível do repertório devem ser analisadas à luz da presença de antígenos parasitários no timo, visto que recentemente foi demonstrada atividade do tipo "superantigênica" associada ao T. cruzi (Leite-de-Moraes, 1993), que pode ser detectado parasitando o parênquima tímico (Savino et al., 1989; Gonçalves-da-Costa et al., 1991).

A análise funcional dos timócitos no curso da fase aguda da infecção experimental demonstrou, ainda, reduzida resposta proliferativa à concanavalina A (Con A) e ao anticorpo anti CD3 (Leite-de-Moraes et al., 1994). Demonstrou-se, também, aumento na atividade citotóxica inespecífica destes timócitos. Estas alterações podem ser explicadas pela modulação na produção de citocinas por timócitos de animais infectados em fase aguda. Assim, a resposta proliferativa diminuída se deve, provavelmente, à insuficiente produção de IL-2, visto que a adição deste fator restaura a atividade proliferativa. Esta insuficiência na produção de IL-2, por sua vez, se deve, provavelmente, aos níveis aumentados na produção de IFN-γ e IL-10, já que a resposta proliferativa à Con A e a produção de IL-2 são recuperadas ao se utilizar anticorpos contra estas duas citocinas. Por outro lado, a atividade citotóxica inespecífica exacerbada se deve, provavelmente, aos níveis aumentados na produção de IL-4, IL-5 e IL-6 pelos timócitos dos animais infectados (Leite-de-Moraes et al., 1994).

4.5.3 Alterações Fenotípicas e Funcionais na Rede Epitelial Tímica

Em paralelo às alterações fenotípicas e funcionais de timócitos na fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi, demonstrou-se que o microambiente tímico também está modificado. Nos animais infectados apresentando atrofia tímica, observou-se um processo de densificação da rede epitelial do órgão. Um estudo mais detalhado desta rede foi realizado através de análise imunohistoquímica utilizando-se um painel de anticorpos dirigidos contra diferentes proteínas da família de citoqueratinas. Assim, células reconhecidas pelo anticorpo monoclonal (mAb) ER-TR.5, que em timos normais estão presentes exclusivamente na medula, passam a ser encontradas também no córtex subcapsular e interno. Além disso, células CK8/18 +, normalmente restritas à região cortical, passam a ser detectadas também na medula tímica (Savino et al., 1989).

Um dado bastante relevante para a análise da patologia tímica na doença de Chagas é a observação de uma expressão maior de antígenos de classe II do MHC concomitante à atrofia que ocorre no timo de animais infectados (Savino et al., 1989). Este efeito seria, possivelmente, secundário ao processo de densificação da rede epitelial, mas talvez também decorra de indução por IFN-γ, cujos níveis intratímicos estão bastante elevados na fase aguda da doença (Leite-de-Moraes et al., 1994).

Por outro lado, a análise da produção do hormônio tímico timulina mostrou pequena redução nos níveis séricos e no número de células timulina-positivas (Savino et al., 1989).

Outra importante observação corresponde ao aumento progressivo na rede intralobular de proteínas de membrana basal fibronectina, do colágeno IV e do antígeno reconhecido pelo mAb ER-TR.7 (Savino et al., 1989).

4.5.4 Distúrbios nas Interações Timócitos/Microambiente

As alterações, tanto no compartimento linfóide como no microambiente tímico, nos levaram a investigar possíveis alterações das interações fisiológicas que acontecem entre timócitos/microambiente, no curso da infecção pelo T. cruzi. Assim, recentemente, estudando os complexos nurse do timo, verificamos uma diminuição no número destes, bem como alterações no tamanho, granularidade, e diversos danos em nível ultra-estrutural (Cotta-de-Almeida et al., 1997). Observamos também aumento na freqüência de timócitos mortos no interior desses complexos nurse, bem como aumento na expressão de proteínas de matriz extracelular, com aumento concomitante na liberação de timócitos dos complexos isolados de animais infectados (Cotta-de-Almeida et al., 1997).

Estes dados devem ser analisados em conjunto com os dados recentes em que demonstramos que após à infecção aguda pelo T. cruzi há um aumento progressivo na expressão de ligantes de matriz extracelular, por exemplo fibronectina e laminina, bem como na expressão de respectivos receptores VLA-4/VLA-5 e VLA-6 (Cotta-de-Almeida, 1996). Interessante é a observação de que o aumento pode ser percebido antes de haver uma clara atrofia do órgão. Definimos ainda, por citometria de fluxo, que a expressão de VLA-4 se mostrava aumentada já no 15º dia de infecção, porém de forma mais exuberante no 22º dia de infecção. A expressão de VLA-5 e VLA-6 mostrava discretas flutuações nos dias analisados, com a subpopulação de células duplo-positivas sendo, provavelmente, o grupo-alvo do aumento observado na expressão das integrinas (Cotta-de-Almeida, 1996).

Interessantemente, a infecção aguda pelo T. cruzi, além de determinar alterações na expressão de ligantes de matriz extracelular que possuem propriedades adesivas, provoca também importante modulação na expressão de tenascina, uma proteína de matriz extracelular que apresenta propriedades imunorregulatórias, tendo sido descrita como uma proteína de de-adesão (Chiquet-Ehrismann, 1995). Análises imunocitoquímicas in situ da expressão de tenascina no timo mostraram uma marcação essencialmente restrita à medula do órgão, com o córtex expressando tenascina apenas no nível da membrana basal de vasos sangüíneos e pouca ou nenhuma marcação na membrana basal subseptal e subcapsular. Já no nono dia de infecção, os timos de animais infectados mostravam aumento de tenascina; progressivamente percebemos que a infecção induzia aparecimento de tenascina no córtex, bem como uma forte marcação na membrana basal de cápsula e septos (Cotta-de-Almeida, 1996).

Além disso, estudando funcionalmente in vitro a adesão de timócitos com células epiteliais tímicas, fenômeno este sabidamente mediado por ligantes e receptores de matriz extracelular, pudemos observar que, ao contrário da expressão de ligantes e receptores de matriz extracelular, a adesão de timócitos obtidos de animais infectados se encontrava diminuída em relação aos timócitos de animais controles. Por outro lado, quando esses timócitos eram colocados sobre células epiteliais tímicas infectadas, observamos um bloqueio parcial na diminuição da adesão, o que ocorria em paralelo com um aumento de matriz extracelular nas culturas de células epiteliais tímicas infectadas (Cotta-de-Almeida, 1996). O conjunto de dados discutidos acima sugere que o processo de adesão/de-adesão/migração intratímica de células T, sob influência das alterações na expressão de ligantes e receptores de matriz extracelular, esteja modificado no curso da infecção experimental pelo T. cruzi, com provável influência no processo normal da diferenciação intratímica de células T.