9.1 Camundongo

Atualmente a maioria das instituições de pesquisa dispõe de Comissões de Ética específicas para analisar os projetos que envolvem o uso de animais, e aprovar seus procedimentos experimentais, indicando sua adequação ou não, pendências e substitutos quando necessário. No Capítulo 20 (Anexos) são encontrados os Princípios Éticos Básicos para Pesquisa e Experimentação com Animais, bem como os contatos com instituições que tem contribuído para o aperfeiçoamento contínuo das normas deles decorrentes.

 

9.1 Camundongo

Tania C. Araújo-Jorge

9.1.1 Características do Mus Domesticus Domesticus (Camundongo) como Modelo para a Infecção por Trypanosoma cruzi

Os parâmetros reprodutivos do camundongo são:

• idade de acasalamento: cinqüenta a sessenta dias;

• período de gestação: dezoito a 21 dias;

• filhotes por parto: três a dez;

• idade de desmame: dezoito a 21 dias;

• peso ao nascimento: 1,5 g;

• peso ao desmame: 10 g;

• peso ao acasalamento: 25 g.

Hoje confirmadas e ampliadas por diversos autores, as seguintes características básicas da infecção no camundongo foram descritas por Chagas (1909) e por seu discípulo E. Dias (1934):

• existem diferenças no curso da infecção (cinética, intensidade

e mortalidade) a depender da espécie hospedeira utilizada e da

origem dos parasitas;

• animais jovens apresentam maior susceptibilidade à infecção

experimental que animais adultos;

• qualquer que seja o material infectante utilizado (sangue de

animal ou fezes de barbeiro infectado), a intensidade da

infecção depende do número de parasitos inoculados;

• tanto formas tripomastigotas metacíclicas como as sangüíneas

são infectivas para o camundongo, deflagrando a forma aguda,

e nos casos de sobrevivência a essa fase, também a forma

crônica, apresenta as características histopatológicas da

doença humana, ao menos em sua forma cardíaca;

• durante toda a fase inicial da infecção, seja qual for a via de

inoculação utilizada, existe sempre parasitemia, ainda que

subpatente, pois com o sangue de animais inoculados por

apenas 24 horas pode-se transferir a infecção para outro

animal;

• formas metacíclicas do vetor apresentam maior capacidade de

penetração nas células do sítio de inoculação e não aparecem

rapidamente na circulação, precisando de um período de

proliferação tecidual preliminar maior do que tripomastigotas

sangüíneos para se evidenciar a parasitemia;

• qualquer via de inoculação deflagra qualitativamente um curso

similar de infecção, diferindo somente no tempo necessário

para observação de parasitemia patente e para início do

período de mortalidade;

• o principal local de multiplicação inicial do T. cruzi é ao nível

dos tecidos do ponto de inoculação dos parasitas;

• o homem e os animais experimentais que sofreram infecção

pelo T. cruzi adquirem certo grau de imunidade contra esse

parasita, pois animais infectados reinoculados demonstram

grande resistência à infecção. No entanto essa imunidade é

relativa, pois em certos casos pode haver "recidivas".

As características que se seguem foram descritas num vasto número de estudos que utilizaram o camundongo como modelo experimental:

• heterogeneidade do curso da infecção dependente da

especificidade da cepa/clone de T. cruzi e da linhagem exo ou

endocriada do camundongo;

• alta letalidade na fase aguda ante cepas patogênicas, com

elevada parasitemia, presença de amastigotas em macrófagos

de baço, fígado e tecido adiposo, em cardiomiócitos, músculo

esquelético e liso, em neurônios e na neuroglia;

• pan-infectividade tissular na fase aguda com intensidade

elevada em alguns órgãos, a depender do par parasita-

hospedeiro (Lenzi et al., 1996);

• na fase crônica a pan-infectividade persiste, pois é possível

recuperar parasitas de praticamente todos os órgãos (McCabe

et al., 1989);

• fase aguda com sinais de imunossupressão transitória,

ativação policlonal e apoptose;

• fase crônica com soropositividade (convencional e lítica) e

parasitemia subpatente, miocardite e miosite, fibrose,

inflamação em camadas do intestino, alterações funcionais do

coração e eletrocardiográficas (bloqueios atrioventriculares de

primeiro e segundo graus, extra-sístoles, distúrbios de

condução intraventricular com aumento do complexo QRS) e

encontro eventual de megavísceras;

• a miocardite induzida por T. cruzi é um processo progressivo,

e a intensidade das lesões inflamatórias está provavelmente

relacionada à extensão dos danos miocárdicos iniciados

durante a fase aguda (Schlemper et al., 1983; Marinho et al.,

1999);

• reversão de lesões histopatológicas pelo tratamento com

agentes tripanocidas tanto na fase aguda como na fase crônica;

• apesar da pan-infectividade, pode ser observado um marcado

histotropismo de certas cepas para certos órgãos (Melo &

Brener, 1978). Recentemente esse tropismo tem sido atribuído

a características das próprias cepas, pois comparando-se

quinze isolados dos três principais clones genotípicos do T.

cruzi (Diego et al., 1998), foi observado que todos induzem à

formação de infiltrados inflamatórios no miocárdio, mas que a

formação de pseudocistos (ninhos de amastigotas) varia com a

cepa, ocorrendo em 20% dos isolados do genotipo 20, 50% do

genótipo 19 e 83% do genotipo 39, caracterizando claramente

um potencial replicativo diferente destes genotipos no tecido

cardíaco. Outro achado interessante nesse sentido foi a

descoberta de que animais infectados simultaneamente por

dois isolados de T. cruzi (cepa JG e clone Coll.7G2), que

podiam ser identificadas por técnicas moleculares específicas

(LSSP-PCR), mostraram distribuição tissular claramente

diferente entre elas, indicando uma influência do polimorfismo

genético das populações de T. cruzi infectantes na patogênese

da cardiopatia chagásica crônica (Andrade et al., 1999).

9.1.2 Aplicações do Modelo Camundongo

As fases aguda e crônica da doença de Chagas, com suas características parasitológicas, imunológicas e histopatológicas (ver Capítulo 4) já foram reproduzidas no modelo camundongo, em diferentes graus de severidade a depender do par parasita-hospedeiro (cepa de T. cruzi-linhagem de camundongo) utilizado (ver a seguir). Também a infecção congênita já foi reproduzida, apresentando características similares à doença de Chagas congênita humana (Cabeza-Meckert & Laguens, 1980; Carlier et al., 1987), com uma incidência de até 4%.

Têm sido muito vastas as aplicações de diferentes cepas de camundongo no estudo da infecção experimental. Em especial destacam-se estudos sobre:

• isolamento de cepas patogênicas, quando se utilizam,

geralmente, camundongos bastante susceptíveis;

• o curso da infecção em diferentes situações experimentais:

cepas/clones de T. cruzi, inóculos, vias de infecção, constituição

genética do hospedeiro (cepas de camundongo e diferentes

tipos de cruzamentos), idade, temperatura, sexo, etc.;

• quimioterapia;

• a caracterização das respostas inflamatória e imune inata;

• a caracterização da resposta imune global e específica ao

parasita e de aspectos auto-imunes;

• a caracterização da evolução das lesões histopatológicas e

funcionais dos diversos órgãos e sistemas afetados no curso da

infecção e da doença.

9.1.3 Heterogeneidade no Modelo Camundongo

Uma característica importante do modelo camundongo é a heterogeneidade do curso e intensidade da infecção, bem como das lesões em diferentes populações (raças, cepas), que se expressa na distinção entre modelos resistentes e susceptíveis a condições similares de infecção. Essa característica, já apontada na década de 40 (Hauschka, 1947; Pizzi et al., 1948), foi explorada quanto ao mapeamento genético da resistência durante as décadas de 70 e 80 (Trischmann et al., 1978; Trischmann & Bloom, 1982; Wrightsman et al., 1982, 1984; Trischmann, 1983; Juri et al., 1990; Eksi et al., 1996), e até hoje é utilizada para facilitar estudos sobre as características da resposta imune inata e adquirida (Silva J.S. et al., 1995). Os padrões de resistência e susceptibilidade à infecção, medidos através de taxas de mortalidade, tempo de sobrevida e níveis de parasitemia, dependem da conjunção das cepas do camundongo e do parasita, o que implica em que qualquer estudo tenha que ser interpretado à luz do modelo usado (Andrade et al., 1985a).

A linhagem CBA foi caracterizada quanto ao curso da infecção por T. cruzi pelo grupo de F. Kierszenbaum (Hayes & Kierszenbaum, 1981; Kierszenbaum & Budzko, 1982), mas não é um modelo de uso mais generalizado. Camundongos C3H e C57BL/6 são classicamente referidos, respectivamente, como resistentes e susceptíveis à infecção por T. cruzi (Trischmann et al., 1978; Starobinas et al., 1991), contudo, eles apresentam respostas inversas às usualmente descritas quando infectados com o clone SylvioX10 (Postan et al., 1983, 1984); os camundongos C57BL/6 são extremamente suscetíveis à infecção pela cepa Tulahuen de T. cruzi (Silva et al., 1992). Como disse Tarleton (1995) "não é possível fazer-se qualquer generalização de um achado em modelo experimental sem que seja no contexto estrito do par hospedeiro-parasita usado como modelo".

No entanto, como a doença humana também varia desde formas assintomáticas e muito brandas até as muito severas e letais, o fato de o camundongo apresentar fenótipos heterogêneos quanto à resistência à infecção o torna um modelo adequado. As diferentes combinações de cepa de camundongo com cepa/clone de parasita tendem a se distribuir nesse espectro quando analisados diversos parâmetros, sejam eles parasitológicos, imunológicos, histopatológicos, eletrofisiológicos ou bioquímicos. E para não fugir à regra da heterogeneidade no modelo de camundongo, até o dogma de que todos os camundongos já ensaiados se infectam com T. cruzi e contraem a doença foi recentemente contestado, com a descrição de um modelo experimental (Balb/C infectado com clone CL14 de T. cruzi) no qual não se conseguiu observar infecção, mas apenas desenvolvimento de imunidade (Lima et al., 1991).

Em função dessa heterogeneidade, desde os primeiros estudos com animais experimentais, e especialmente com camundongos, uma questão emerge: o que torna um animal susceptível ou resistente à infecção?

Essa questão foi explorada tanto sob a ótica do parasita como pela ótica do hospedeiro. Assim, foi estudado o curso da infecção experimental com formas metacíclicas ou sangüíneas, introduzidas por diferentes vias de inoculação; com isolados (cepas) de diferentes regiões geográficas ou provenientes de diferentes hospedeiros (isolados de vetores, de reservatórios naturais, de pacientes com diferentes formas clínicas da doença, etc.); com parasitas submetidos à atenuação ou aumento da virulência por passagens repetidas em cultura ou em animais, ou ainda pré-incubados com diferentes drogas ou com diferentes componentes do soro ou plasma de hospedeiros imunes ou não imunes; entre outras. Hoje sabemos que isso varia com o modelo animal utilizado, com a cepa de T. cruzi inoculada e com o tamanho do inóculo, e que são determinadas em grande extensão pelo balanço funcional de diferentes citocinas produzidas no curso da infecção (ver Capítulo 4).

As vias intraperitoneal (IP) e subcutânea (SC) são as mais amplamente utilizadas para inoculação do T. cruzi em camundongos e os animais jovens são mais susceptíveis que os adultos. A via conjuntival, utilizada em outros modelos (Ramirez & Brener, 1987), foi menos explorada com camundongos. A via oral foi demonstrada como eficaz apenas em camundongos de até vinte dias de idade, enquanto a IP promove infecção em qualquer faixa etária (Culbertson & Kessler, 1942). Mais recentemente, foi demostrado que a infecção via oral ocorre através da mucosa gástrica e não da mucosa de qualquer outra parte superior do tubo digestivo (Hoft et al., 1996). Apenas tripomastigotas metacíclicos são competentes para a infecção via oral; com tripomastigotas sangüíneos a infecção não foi obtida (Hoft, 1996).

Diferenças na resistência entre machos e fêmeas são observadas em alguns modelos e não em outros (Hauschka, 1947; Araújo-Jorge et al., 1992). Até hoje não estão esclarecidos os mecanismos que interferem na resistência dos animais com relação à idade e ao sexo.

A reprodução da fase crônica da infecção por T. cruzi em camundongos já foi obtida por quatro estratégias: (1) infecção de linhagens de camundongos susceptíveis com cepas de T. cruzi patogênicas numa combinação de inóculo, idade dos animais e via de inoculação que permita a sobrevida à fase aguda de uma proporção significativa dos animais infectados (Federici et al., 1964; Laguens et al., 1980); (2) infecção de camundongos com uma dose letal de parasitas seguida de tratamento com drogas tripanocidas que assegurem a sobrevida na fase aguda sem cura parasitológica (Andrade et al., 1970; Marinho et al., 1999); (3) infecção de linhagens de camundongos resistentes ou susceptíveis com cepas de parasitas de baixa patogenicidade, especialmente a cepa CA1 e os clones CL-Brener e Dm28c, com inóculos subletais (González-Cappa et al., 1981; Araújo & Chiari, 1989; Lopes et al., 1995); (4) infecção com cepas patogênicas em animais imunizados com cepas atenuadas (Johnson et al., 1963; Hudson, 1984; McCormick & Rowland, 1989; Milei et al., 1991; Gomez et al., 1996).

9.1.4 Modelos mais Amplamente Utilizados

Um dos maiores problemas para o entendimento e sistematização dos dados existentes sobre a imunobiologia e imunopatologia na doença de Chagas experimental é o fato de não haver um modelo comum, de eleição, usado pela maioria dos grupos que trabalham na área. Certos grupos se concentram num único modelo e caracterizam-no sob vários parâmetros. Isso é útil do ponto de vista da biologia geral da infecção, delineando um quadro mais completo da resposta do hospedeiro ao parasita, mas deixa a desejar quanto à possibilidade de extrapolação dos dados para outros modelos e mesmo para humanos. Outros laboratórios buscam analisar um mesmo fenômeno em diferentes modelos para firmar conceitos que possam ser generalizados com relação à infecção.

9.1.4.1 Camundongos exocriados Swiss, não isogênicos

Desde os primeiros experimentos com o camundongo branco, até hoje, o camundongo albino Swiss, não isogênico, tem sido um modelo amplamente utilizado. Os animais são extremamente sensíveis às diversas cepas do parasita (Andrade et al., 1985a) e não apresentam diferença na resistência quanto ao sexo (Luz et al., 1995). No entanto, isolados de T. cruzi provenientes de animais silvestres podem apresentar parasitemia baixa e 100% de sobrevivência (ver Capítulo 3). Pelo seu baixo custo, os camundongos Swiss são muito utilizados em estudos de quimioterapia experimental (ver Capítulo 7), que implicam no estudo de grande número de animais e avaliação de sobrevida (Gutteridge et al., 1978). A reversibilidade de lesões musculares em animais crônicos após quimioterapia tripanocida foi demonstrada nesse modelo (Andrade et al., 1991; Segura et al., 1994). Os primeiros estudos eletrocardiográficos em camundongos infectados também foram feitos nesse modelo (Packchanian & Robinson, 1958) e mostraram claramente que existem diferenças significativas nos traçados de animais crônicos em relação aos normais. Alterações eletrocardiográficas e correlação destas com lesões histopatológicas no sistema de condução também foram descritas em camundongos Swiss (Andrade & Sadigursky, 1987). A descrição das cepas Y e CL como polares em relação a curvas parasitêmicas e ao tropismo tissular foi feita nesse modelo (Melo & Brener, 1978), assim como a caracterização biológica do clone Dm28c (Contreras et al., 1988). A influência da cepa de parasita na resistência do hospedeiro também foi confirmada no modelo Swiss (Andrade et al., 1985b). Algumas podem ser extremamente virulentas, como a cepa Y (Silva & Nussensweig, 1953), enquanto outras não, como a Tulahuen (Cardoni et al., 1986). Com inóculos baixos de cepas pouco virulentas foram obtidas cronicidade (Laguens et al., 1980) e reprodução da miocardiopatia chagásica humana crônica, com fibrose, poucos parasitas intracelulares, alterações eletrocardiográficas, sorologia positiva, parasitemia subpatente evidenciada por xenodiagnóstico ou inoculação em camundongos recém-natos, e associação eventual com megavísceras (Laguens et al., 1981; Milei et al., 1984; Molina et al., 1988). Um estudo com setenta animais crônicos demonstrou que mesmo em animais com testes parasitológicos persistentemente negativos, a infecção ativa pode ser evidenciada quando se submetem os animais à imunossupressão com ciclofosfamida (Magalhães & Andrade, 1994).

9.1.4.2 Camundongos endocriados, isogênicos

O uso de camundongos isogênicos com diferenças no complexo maior de histocompatibilidade (locus H-2) e back-grounds genéticos foi revisto por De Titto (1994). Estudos clássicos mostraram, no entanto, que diferente de certos microorganismos como Mycobacterium leprae, Listeria monocitogenes ou Leishmania donovani, cuja resistência é governada por um gene ou grupo de genes relacionados, a resistência a T. cruzi é regulada por controle multigênico (Trischmann & Bloom, 1982; Wrightsman et al., 1982, 1984). Não existem linhagens polares, resistentes ou susceptíveis, mas um gradiente contínuo entre esses dois fenótipos. Além disso, como a resistência está mais ligada às características da cepa de T. cruzi infectante (Andrade et al., 1985b), um hospedeiro pode ser resistente e controlar a infecção com algumas cepas, mas não com todas.

9.4.1.3 Camundongo Balb/C

De longe os camundongos Balb/C se configuram na linhagem mais utilizada em estudos experimentais (282 referências na base de dados MedLine com as palavras-chave Balb e Chagas disease, em julho de 1999). Descrito como um dos modelos mais susceptíveis, e portanto bom para a triagem inicial de drogas e de agentes imunomoduladores que aumentem a resistência, essa cepa é muito utilizada por vários grupos. O modelo Balb/C-cepas Y ou CL foi muito estudado por grupos no Brasil e na França (Rossi et al., 1984, 1986; Silva et al., 1985; Minoprio et al., 1986, 1988; D'Império-Lima et al., 1986; Russo et al., 1989). Como controle para o modelo Xid (ver Capítulo 4), a imunologia do camundongo Balb/C infectado por T. cruzi tem sido amplamente investigada (Minoprio et al., 1991, 1993). O modelo Balb/C-cepa Colombiana é o preferido e é largamente caracterizado pelo grupo de Ribeiro dos Santos & Pirmez, no Brasil (Ribeirodos-Santos et al., 1992; Silva-Barbosa et al., 1997). O modelo Balb/C-cepa Tulahuen tem sido intensamente utilizado e caracterizado pelo grupo argentino de Cardoni & De Titto (Cardoni et al., 1986; Rottenberg et al., 1991; Antunes et al., 1997). O modelo Balb/C-cepa Tehuantepec foi o escolhido e amplamente caracterizado por Carlier et al. (1987). Os modelos Balb/C-clone Dm28c (Lopes et al., 1995) e Balb/C-cepa CL e clone CL14 (Lima et al., 1991) vêm sendo utilizados e caracterizados no Brasil.

9.4.1.4 Camundongo C3H

O conjunto de trabalhos realizados por Pizzi et al. (1948, 1953) nas décadas de 40 e 50 introduziram o uso da linhagem C3H nos estudos de infecção experimental com T. cruzi, em conjunção com a cepa Tulahuen, que é reticulotrópica e bastante virulenta. Os camundongos C3H são hoje a segunda linhagem mais utilizada (197 referências encontradas na base de dados MedLine com as palavras-chave C3H e Chagas disease, em julho de 1999). O modelo C3H-cepa Colombiana (10 4 IP) cronifica, e mostrou-se interessante quanto à reprodução de características fisiopatológicas e hemodinâmicas observadas em humanos chagásicos crônicos (Federici et al., 1964; Abelman, 1969). Muitos outros grupos têm usado a cepa C3H para estudos da resposta inflamatória e imune, ante diferentes cepas e clones de parasitas (Postan et al., 1983; Minoprio et al., 1989; Russo et al., 1989; Pakianathan & Kuhn, 1994). O modelo C3H-cepa Tulahuen foi caracterizado por Morales et al. (1987), com relação à miocardiopatia, comparativamente a outras linhagens de camundongo. Recentemente os camundongos C3H vêm sendo utilizados para estudos da infecção e patologia do sistema nervoso central no Instituto Oswaldo Cruz (Silva, A. A. et al., 1995).

9.4.1.5 Camundongos C57BL (6 e 10)

Descrita como uma das cepas de camundongos mais resistentes (Pizzi et al., 1948), as linhagens C57BL/6 e C57BL/10 vêm sendo utilizadas ante diferentes cepas e clones do T. cruzi, por muitos grupos (Reed et al., 1984; Silva J.S. et al., 1995; Tarleton, 1995). Exatamente por isso é um modelo em que a cronificação pode ser obtida com certa facilidade, especialmente quando se utilizam inóculos baixos (Postan et al., 1984, 1987a). Muitas vezes são usados comparativamente com camundongos C3H ou Balb/C. Em todos os casos, no entanto, há que se referir sempre à cepa do parasita utilizada, pois algumas são extremamente virulentas, inclusive para esse hospedeiro (Luz et al., 1994).

9.4.1.6 Camundongos geneticamente transformados: mutantes e knock-outs

O interesse no uso de animais geneticamente deficientes em certa função ou molécula para estudo da implicação direta ou indireta desta na resistência à infecção já é antiga. Os primeiros animais usados para essa finalidade foram os camundongos "Biozzi" selecionados quanto à capacidade de produção de anticorpos (alta ou baixa) por cruzamentos e retrocruzamentos (Kierszenbaum & Howard, 1976). Posteriormente animais B10.D2/ old, geneticamente deficientes no componente C5 do sistema complemento, foram usados para demonstrar que a lise mediada por complemento não é decisiva na sobrevida nem na parasitemia dos animais na fase aguda (Dalmasso & Jarvinen, 1980). Os animais "nude", que não possuem timo, também foram usados como instrumentos para a compreensão do papel de células T na infecção (Gonçalves da Costa et al., 1984; Trischmann, 1984), bem como os animais Xid, que não possuem células BCD5 (Minoprio et al., 1991, 1993). Linhagens com fenótipos auto-imunes (tais como linhagens com o gene lpr, linhagens NZB e BXSB) também tendem a ser mais susceptíveis à infecção por T. cruzi (Nickell et al., 1985). Mais recentemente uma série de animais, geneticamente deficientes em certas moléculas, têm sido utilizados para estudos experimentais com diversos agentes infecciosos, tais como animais knock-out, para os genes de moléculas de histocompatibilidade classe I, sem células T CD8 maduras (Tarleton et al., 1992), de classe II, sem células T CD4 maduras (Rottenberg et al., 1993), para os genes RAG e de IL-10 (Abrahamsohn & Coffman, 1996; Hunter et al., 1997), para a cadeia d do TCR (Santos-Lima & Minoprio, 1996), entre outros. Do mesmo modo, animais deficientes em receptor de IFN-γ, bem como em óxido nítrico sintetase (Holscher et al., 1998) mostraram um fenótipo extremamente susceptível à infecção por T. cruzi e permitiram evidenciar o papel crucial que estes mecanismos exercem na resistência dos animais, como discutido no Capítulo 4. Recentemente foi estudado o curso da infecção por T. cruzi em animais deficientes em vias de citotoxicidade, como a via Fas (animais gld) e a via perforina (Henriques-Pons et al., 1998; Lopes et al., 1999). No primeiro caso os animais apresentaram maior susceptibilidade, associada ao desenvolvimento precoce de uma potente resposta Th2, e no segundo maior mortalidade, associada a um descontrole do grau de inflamação tissular. A perspectiva para os próximos anos é que mais modelos com deficiências gênicas naturais ou induzidas por recombinação homóloga (knock-outs) venham a ser aplicados para o estudo da imunopatologia da infecção por T. cruzi.