Capítulo 12 - Controle da qualidade dos animais antes da infecção experimental

Capítulo 12 - Controle da qualidade

dos animais antes da infecção

experimental

 

Celia V. P. Cardoso; Marcos Antonio P. Marques; Tania C. Araújo-Jorge; Solange L. de Castro; Maria Teresa Rivera

 

12.1 Padrões de qualidade

Quanto mais eficientes forem as barreiras sanitárias do biotério, menores as chances de contaminação dos animais. Em função das barreiras disponíveis, podemos classificá-los em três grupos, de acordo com seu padrão sanitário, ou seja, quanto à microbiota (conjunto de formas de vida associadas, ou seja, vírus, bactérias, fungos e parasitos).

• Convencionais ou holoxênicos: animais que possuem

microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente

desprovido de barreiras sanitárias rigorosas.

• Livres de patógenos específicos (specific pathogen free/SPF):

animais que não apresentam microbiota capaz de lhes

determinar doenças, ou seja, albergam somente

microorganismos não patogênicos. Sua criação e/ou

manutenção é realizada em ambientes protegidos por barreiras

sanitárias rigorosas e também em isoladores.

• Gnotobióticos: animais que possuem microbiota associada

definida e devem ser criados e/ou mantidos em ambientes

dotados de barreiras sanitárias absolutas (isoladores). Em

função da quantidade de microbiotas associadas ao animal,

este pode ser classificado em

Axênico ou germ free: totalmente livre de microbiota

Monoxênico: contaminado deliberadamente com um tipo de microbiota

Dixênico: contaminado deliberadamente com dois tipos de microbiota

Polixênico: contaminado deliberadamente com vários tipos de microbiota.

A maioria dos biotérios de criação e produção faz controle sanitário dos animais e fornece o resultado de seus exames. Ao final deste capítulo, encontra-se, em anexo, a tradução de um certificado de saúde animal usado pelo biotério da Rockfeller University, para uma doação de animais trangênicos em 1996 (Anexo 12.1). Mesmo que eles indiquem que os animais são livres de patógenos específicos, é recomendado que se faça uma rechecagem em uma amostra dos animais recebidos para confirmação dos dados e para se evitar qualquer risco de contaminação. Animais com padrão microbiológico desconhecido devem ser considerados como infectados e devem ficar em quarentena, buscando-se identificar a presença ou não de algum microorganismo indesejável no biotério de experimentação. O Ministério da Agricultura controla toda a entrada de animais no país; no Anexo 12.2 está um formulário padrão de requerimento para autorização de importação de animais.

Quanto mais padronizado o animal for, melhor a reprodução do experimento nele realizado. A monitorização desses padrões é necessária não somente em biotérios de criação e produção, como também nos biotérios de experimentação. O estado de saúde dos animais tem que ser redefinido nas instalações de uso dos mesmos, em intervalos regulares, depois de recebidos do biotério de origem. Durante a experimentação animal só serão obtidas informações seguras se houver um controle sanitário sistemático e cuidadoso nos biotérios de experimentação com controle de qualidade dos animais. Esse controle sanitário vai depender do objetivo da pesquisa, das condições de alojamento (convencional, sob barreiras, isoladores ou microisoladores), do tempo de duração do experimento, da freqüência de introdução de animais e outros materiais biológicos, da importância do patógeno específico, ou mesmo da probabilidade de interferência com a pesquisa.

Além das considerações relativas ao bem-estar dos animais, o principal alvo da monitoração sanitária antes e durante os experimentos é definir as condições de saúde dos animais para se avaliar a presença ou ausência de certos microorganismos, lesões e outras alterações como variáveis experimentais. Convém lembrar que a maioria das infecções em roedores é subclínica, podendo ocorrer modificações nos resultados dos experimentos devido a infecções naturais com ausência de doença clínica. Daí ser essencial a prevenção de infecções e não apenas a prevenção da doença.

Outros fatores exógenos, como por exemplo o meio ambiente, podem influenciar na susceptibilidade dos animais à pesquisa (ver Capítulo 11). A introdução de animais e outros materiais biológicos, particularmente quando de origem externa, exige a monitoração do ambiente para prevenir a introdução de agentes transmissíveis que possam influenciar na saúde do homem (agentes zoonóticos), ou de outros animais, ou nos resultados dos experimentos. É comum que mais pessoas tenham acesso aos biotérios de experimentação do que aos de criação, o que aumenta o risco de introdução de infecções por pessoal. A adoção de sistemas adequados de entrada, através de barreiras sanitárias, deve ser enfatizada para se manter o risco mínimo aceitável.

O emprego de um programa de animais sentinelas pode garantir a monitoração dos animais durante os experimentos de longa duração, como por exemplo, a avaliação da fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi. Os animais sentinelas são aqueles obtidos de colônias de criação de padrão microbiológico conhecido, introduzidos numa população de animais em experimentação, onde atuarão como "vigilantes" substitutos daquela população. Como regra geral, o controle sanitário é mais eficaz usando-se animais da mesma espécie e cepa da população residente. Devem ser submetidos a um minucioso exame antes de serem introduzidos nas salas dos animais em experimentação. E devem ter pelo menos dez semanas de idade, e mantidos dentro da sala por, no mínimo, quatro semanas. Os exames realizados nos sentinelas são os mesmos adotados no controle sanitário dos biotérios de criação e produção.

 

12.2 Avaliação geral dos animais antes da

infecção

Genericamente um animal saudável é aquele que não apresenta sinais ou sintomas de quaisquer doenças genéticas, neoplásicas, degenerativas, associadas ao desenvolvimento, nutricionais, tóxicas ou infectocontagiosas, de forma aguda ou crônica. O animal sadio tem funções normais, se alimenta, procria, é ativo e não estressado. Espera-se sempre obter um animal nestas condições.

Nas duas semanas de adaptação dos animais às condições ambientais da sala de experimentação, devem ser adotados outros procedimentos para garantir a sua higidez.

12.2.1 Inspeção geral

Para avaliação de lesões de pele, anotar as anormalidades e descartar os animais que apresentarem sinais de ferimentos ou lesões. Prolapso de reto evidente pode indicar infecções intestinais por diferentes agentes. Prurido excessivo pode indicar presença de infestações por ectoparasitas, especialmente sarna.

12.2.2 Pesagem e avaliação de idade

O cuidado de pesar todos os animais antes do experimento, além de permitir maior homogeneidade na população a ser utilizada, possibilita também a avaliação indireta de sua idade. É aconselhável que ao se escolher certa linhagem genética de camundongos, proceda-se ao estudo da curva de evolução ponderal dos dois sexos naquela cepa nas condições locais do experimento. Um exemplo

pode ser observado para camundongos Swiss e C57BL/6 na Tabela

1 e na Figura 1.

Tabela 1 – Evolução ponderal em camundongos Swiss e C57BL/6 *

 

* Resultados obtidos no Depto. de Ultra-estrutura e Biologia Celular,

IOC

 

Figura 1 – Evolução ponderal de camundongos Swiss e C57BL/6.

As barras representam dois desvios-padrão (correspondem a 95%

da população)

 

12.3 Dados hematológicos e sorológicos A coleta de sangue por um dos métodos que não impliquem sacrifício do animal (ver Capítulo 13), ou seja, sangria pela cauda ou por punção do plexo orbital, possibilita a análise de dados hematológicos (leucometria e hematócrito) que podem ser bastante úteis para a avaliação do grau de higidez da população a ser ensaiada, e a exclusão de animais que apresentem algum tipo de anormalidade no momento da infecção. De rotina, deve-se preparar um esfregaço sangüíneo (para avaliação da distribuição do percentual leucocitário). Colhem-se 5 ml de sangue total heparinizado para hematimetria e leucometria (contagem de hemácias na diluição de 1/50.000, e para contagem de leucócitos na diluição de 1/500), e ainda um capilar com cerca de 60 µl de sangue que será centrifugado para medida do hematócrito e obtenção de plasma. O plasma pode ser congelado para dosagem posterior de todos os parâmetros bioquímicos (por exemplo proteínas de fase aguda, citocinas ou enzimas indicadoras de lesão tissular) e sorológicos (por exemplo, dosagem de diversos isotipos de imunoglobulinas totais e específicas) de interesse ao experimento.

12.3.2 Contagem diferencial de leucócitos

A contagem diferencial dos leucócitos tem por finalidade estabelecer o valor percentual de cada tipo de leucócito no sangue circulante, para depois, conhecendo-se o total de leucócitos circulantes, conhecer-se o total de cada tipo de leucócito. Para isso, utiliza-se um esfregaço de sangue periférico feito da amostra colhida para o hemograma. O esfregaço é corado (ver adiante) e examinado ao microscópio com objetiva de imersão a óleo (100 X). A melhor região do esfregaço para contagem é aquela mais próxima de seu final, chamada de cauda. O examinador deve estabelecer um padrão para correr a lâmina, em movimentos verticais ou horizontais, mas tomando o cuidado de não passar mais de uma vez sobre a mesma área. Conta-se cem células, anotando-se o tipo de cada uma, utilizado-se contadores mecânicos ou elétricos.

Procedimento

• preparar o esfregaço;

• corar pelo método Panóptico de Pappeinheim (May-Grunwald-

Giemsa), com kit comercial Panótico Rápido LB (Laborclin)

cinco imersões (1 segundo cada) seqüenciais nas três soluções

do kit; lavar com água deionizada; secar ao ar;

• solução nº 1: triarilmetano 0,1% (nocivo ao organismo);

• solução nº 2: xantenos 0,1%;

• solução nº 3: tiazinas 0,1%;

• contar cem leucócitos ao longo de toda a lâmina.

12.3.3 Leucometria (contagem do número de leucócitos)

A identificação de leucocitose é um parâmetro essencial para a avaliação das condições de saúde do animal antes e durante a infecção experimental. A contagem é facilmente feita e deve ser um procedimento de rotina. O sangue é diluído na proporção de 1:20 com líquido diluidor de Turk, que hemolisa as hemácias e cora o núcleo dos leucócitos pelo azul de metileno.

Material

• pipeta de 1 ml graduada a 0,01 ml

• frasco tipo penicilina com tampa de borracha

• papel de filtro ou algodão

• câmara de Neubauer

• conta-gotas ou tubo capilar

• microscópio

Procedimento

• pipetar 0,4 ml do líquido diluidor no frasco de penicilina;

• adicionar ao frasco 20 µl de sangue. A diluição é de 1:20;

• agitar suavemente por 1 min;

• encher o retículo da câmara de Neubauer com conta-gotas ou

tubo capilar, deixando repousar por 1 min para sedimentação

das células;

• focalizar a preparação com pequeno aumento no microscópio

para observar a distribuição uniforme dos leucócitos;

• fazer a contagem de todos os leucócitos encontrados nos

quadrados laterais da câmara de Neubauer, ou seja, 0,4 mm2;

• após a soma das contagens dos leucócitos, multiplicar o

resultado obtido por 50.

12.3.4 Hematimetria (contagem do número de hemácias)

A contagem de hemácias pode ser dispensada, pois o valor do hematócrito já fornece um bom indicador da presença ou não de anemia nos animais, dado mais importante para o descarte ou não de animais antes do experimento.

12.3.5 Hematócrito

Também conhecido como volume globular, o hematócrito mede a relação entre os glóbulos vermelhos e o plasma. Em outras palavras, mede a percentagem do sangue ocupada por eritrócitos. Valores abaixo do normal indicam anemia; acima, indicam poliglobulia.

Descreveremos abaixo a técnica do microhematócrito por ser de maior rapidez e utilizar uma pequena quantidade de sangue.

Procedimento

• homogeneizar a amostra, e em seguida encher de sangue

aproximadamente ¾ do tubo capilar;

• fechar uma das extremidades. Para isso, há duas maneiras:

coloca-se o dedo indicador sobre a extremidade sem sangue,

para evitar vazamento e introduz-se o tubo alguns milímetros

em massa de modelar; ou encosta-se a extremidade sem

sangue numa chama, fechando o tubo a fogo;

• colocar o tubo na centrífuga apropriada e rodar conforme

indicado pelo fabricante do aparelho (geralmente, 5 min);

• fazer a leitura na tabela de leitura de microhematócrito.

12.3.6 Parâmetros hematológicos normais obtidos para camundongos Swiss

Os dados da Tabela 2 podem ser utilizados como indicativos para camundongos, mas devem ser repetidos com a cepa a ser utilizada como modelo experimental. Referem-se a camundongos Swiss utilizados em um trabalho desenvolvido no INCQS/Fiocruz, em 1988.

Tabela 2 – Hemograma completo

 

Série branca Machos (n = Fêmeas (n = parâmetro 40) 48)

Intervalos Intervalos

normais1 normais

Leucócitos totais/mm3 3500 a 9500 5.000 a 8.000

Linfócitos (%) 76,1 a 81,0 72,0 a 77,0 Neutrofilos (%) 18,1 a 23,0 16,0 a 21,0 Monócitos (%) 3 a 4 3 a 4 Basófilos (%) 0 0 Eosinófilos (%) 0 a 1 0 a 1 Bastão (%) 0 a 1 0 a 1

Série vermelha Machos Fêmeas parâmetro

Intervalos Intervalos

normais1 normais

Peso (g) 32,1 a 36,0 26,1 a 30,0 Hematócrito (%) 46,0 a 51,0 44,1 a 51,0

Hemáceas/mm3 6 6 6 6 n=11 e 5.10 a 7.10 5.10 a 7. 10

39

Hemoglobina n=11 e 12,0 a 13,9 12,1 a 15,0 (g%) 16

VGM (m 3) n=11 e 48,0 a 53,0 57,1 a 68,5

16

HGM (mmg) n=11 e 16,0 a 20,0 18,1 a 22,0

16

CHGM (%) n=11 e 29,0 a 34,0 35,1 a 39,0

16

n: número de animais analisados; 1 intervalo de maior freqüência

 

Referências bibliográficas

FEDERATION OF EUROPEAN LABORATORY ANIMAL SCIENCE ASSOCIATIONS (FELASA). FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig and habbit breeding colonies. Laboratory Animals 28:1-12, 1994.

FEDERATION OF EUROPEAN LABORATORY ANIMAL SCIENCE ASSOCIATIONS (FELASA). FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig and rabbit experimental units. Laboratory Animals 30:193-208, 1996.

INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES. Committee on Infectious Diseases of Mice and Rats. Infectious Diseases of Mice and Rats. 1991. Washington DC: National Academy Press.

LUCA, R. R.; ALEXANDRE, S. R.; MARQUES, T.; SOUZA, N. L.; MERUSSE, J. L. B. & NEVES, S. P. Manual para técnicos em bioterismo. 1996. São Paulo:ICB/USP.

 

Anexo 12.1 - Exemplo de certificado de saúde

usado por biotério na Rockfeller University, USA

Tradução: Relatório de Vigilância de Saúde de

Roedores

Centro de Pesquisa em Animais de

Laboratório, Box 2

Av. York 1230 (64a. e York), New York, New

York, 10021-6399

(212) 327-8534

 

PAINEL DE SAÚDE: (realizado a cada dois meses para cada sala de roedores) inclui:

Virologia: (Sorologia - ELISA); vírus sendai, vírus de hepatite de camundongos (MHV), vírus minuto de camundongos (MVM) e coriomeningite linfocítica de camundongo (LCM), GD V11, diarréia epizoótica de camundongos infantis (EDIM), vírus de pneumonia de camundongo (PVM), ectromelia, vírus polioma, vírus K, adenovírus de camundongo (Maden), Reo 3

Parasitologia: ectoparasitas artrópodes, endoparasitas helmínticos

Microbiologia: Mycoplasma pulmonis (Sorologia -ELISA)

 

Resultados - Sala 302

Painel principal (oito vírus) (out./dez.) / Painel estendido (12 vírus)

(fev.)

Mês Sorologia Parasitologia Out 1995 Negativo Negativo Dez 1995 Negativo Negativo Fev 1996 Negativo Negativo

Sala: 302

Mês: outubro, dezembro 1995, fevereiro 1996

Cepa sentinela: CD-1 (Charles Rivers)

Sexo: fêmea

Seis camundongos sentinelas são colocados em gaiolas sem tampa e disseminados em cada sala nas diferentes estantes e expostos à ração de diferentes gaiolas contendo animais agrupados por idade, cada qual numa gaiola. Três camundongos são sacrificados para avaliação sentinela.

Comentários

Estes camundongos (Chau-Ching Liu) foram recentemente transferidos da sala 302 para as alas 228 A e B, que foram positivas para PVM em junho de 1995. Os camundongos originalmente vieram da Universidade do Sudeste da Califórnia e tinham uma história de positividade sorológica para MVM. Desde junho de 1995 estes animais estiveram SPF para os patógenos mencionados. Foi feito um teste direto dos camundongos desta colônia que foram enviados a outras instituições e foi também demonstrado o estado SPF.

Durante o último ano houve uma tentativa audaciosa de tornar as instalações centralizadas do biotério inteiramente SPF, pela implementação de procedimentos SPF estritos através de todas as salas de roedores com gaiolas de microisolamento e câmaras de fluxo laminar utilizadas, bem como seguindo os movimentos dos animais de acordo com seu estado de saúde. Além disso, todas as instalações foram tratadas por vários meses com ivermectina para traças e cupins e nossos sentinelas foram basicamente negativos no último ano. Todas as salas de camundongos na colônia primária em todo o prédio no presente momento tiveram pelo menos três avaliações de saúde negativas consecutivas (num período de seis meses).

Uma vez que os resultados destes testes são de animais sentinelas e não de testes diretos nos animais que serão embarcados, é sempre aconselhável uma quarentena nos animais quando do recebimento e um teste diagnóstico nas suas próprias instalações antes de introduzi-los numa colônia SPF.

Assinado: Patologista Responsável

 

Anexo 12.2 - Formulário padrão para

requerimento de importação de animais

Ao

Ministério da Agricultura

Secretaria de Produção Animal (SPA)

Secretaria de Defesa Sanitária (SDSA)

REQUERIMENTO DE AUTORIZAÇÃO DE IMPORTAÇÃO DE

ANIMAL VIVO, SÊMEM, EMBRIÕES E OVOS FÉRTEIS

(exceto para eqüídeos)

Senhor secretário da SDSA/Senhor secretário da SPA

Solicito autorização para importação da mercadoria adiante

caracterizada, de acordo com o disposto na Resolução Concex

nº 149/87 e na Portaria nº 49/87 do Sr. ministro da Agricultura,

para o que prestamos as informações que se seguem:

1. IMPORTADOR

 

Nome: ______

(instituição)

Endereço: ______

Cidade: ______ Estado: ______ CEP: ______ Telefones: ______

(Dr. ______, pesquisador responsável )

(Dr. ______, veterinário responsável)

(Sr. ______, funcionário do serviço de importação)

2. CARACTERIZAÇÃO DA MERCADORIA A SER IMPORTADA

Espécie: ______ (camundongos) Quantidade:

______

Finalidade: [ ] [ ] Abate [ ] ______

Reprodução

No caso de sêmen ou [ ] [ ] Uso em embrião: Comercialização rebanho

próprio

País de procedência: ______ País de

trânsito:

______

Exportador: ______

(nome do estabelecimento e localização)

3. TRANSPORTE

Meio de transporte: Local de embarque: ______

______

No caso de transporte [ x ] vôo de linha regular, misto aéreo: ou carga

[ ] vôo fretado (charter)

Local de preferência para desembarque: Rio de Janeiro, RJ

4 . DESTINO DOS ANIMAIS

Estabelecimento: ______ - ______

(instituição) (laboratório)

______

(setor)

Endereço: ______

Município: ______ Estado: ______

5. LOCAL PARA REALIZAÇÃO DE QUARENTENA OU

ISOLAMENTO E PREMUNIÇÃO (quando requerida)

Estabelecimento: ______ - ______

(instituição) (laboratório)

______

(setor)

Endereço: ______

Município: ______ Estado: ______ Veterinário responsável: ______

Endereço: ______

Telefone: ______ Fax: ______

6. DOCUMENTOS ANEXOS

( ) Fatura proforma

( x ) Certificado de registro genealógico e/ou genealogia, com

dados oficiais de desempenho zootécnico dos genitores, de

performance individual e/ou da progênie

( x ) Relação dos animais

( ) Licença de importação do IBDF (original + quatro cópias)

( ) Licença de importação da Sudepe (original + quatro cópias)

7. CONTATO PARA ESCLARECIMENTOS E OUTROS FINS

( x ) O importador ( x ) Outro - Nome: ______ Endereço: ______

Cidade: ______ Estado: ___ CEP: ______ Telefone: ______ Fax: ______ E-mail: ______

______

(Local e data)

Assinatura do importador ou seu representante autorizado

DECLARAÇÃO INSTITUCIONAL

Declaramos que a ______(Instituição) está importando matrizes das linhagens isogênicas de camundongos (Mus musculus) abaixo relacionadas, que se destinam a reprodução para expansão de uma colônia dessa cepa, de modo a produzir o número de animais necessários para a realização de experimentos de ______(natureza dos experimentos), no laboratório ______(identificação do setor usuário). Esses animais se caracterizam por ______(descrever o tipo de animal, deficiências genéticas, etc.) e serão utilizados para______ (objetivo do trabalho). Serão portanto usados exclusivamente em atividades de pesquisa básica, em experimentos que visam a elucidar ______.

Informamos que os animais são certificadamente isentos de doenças específicas de roedores, portanto em perfeito estado de higidez, e que o Laboratório ______(local de destino dos animais), onde serão mantidos os animais, possui instalações adequadas para o desenvolvimento de trabalhos com animais de laboratório, propiciando a obtenção de resultados confiáveis na pesquisa biomédica.

Especificação dos animais

 

Linhagem Quantidade Sexo Obs.

 

______

Local e data

______

Assinatura do responsável na instituição

Tradução CENTRO DE PESQUISA DE ANIMAIS DE

LABORATÓRIO UNIVERSIDADE ______

Endereço: ______

Certificado de Saúde Animal

Embarque de animais Data: ______ De: Pesquisador cedente: ______

Universidade/Instituição : ______

Endereço : ______

Para: ______

______

______

Conteúdo Número Espécie Cepa Sexo Cor

embarcado:

3 camundongo C57BL6 fêmeas preta 3 camundongo C57BL6 machos preta

Declaração de sáude dada pelo veterinário: os animais descritos acima foram examinados e encontram-se em aparente boa saúde e visualmente livres de evidência de doenças transmissíveis de significado de saúde pública. Estes animais são destinados a uso somente em pesquisa. Estes animais ou seus produtos não podem ser usados para fins comerciais.

Assinado: Diretor do Biotério cedente

Problemas com o embarque? Por favor, chame o Departamento de Serviços Veterinários pelos tels. ______