Doença de Chagas: Manual para Experimentação Animal
10.4 Manutenção e obtenção dos diferentes estágios evolutivos em laboratório
Tabela 6 – Algumas linhagens de camundongos utilizadas para
estudos da doença de Chagas experimental
Linhagem Haplotipo Complexo H - 2 Outros loci
genéticos
K Ab Aa Eb Ea D Thy-CD5 CD8 CD45
1
Linhagens
comuns
C57BL/6 b b b b b - b 2 2 2 2 C56BL/10 b b b b b - b 2 2 2 2 BALB/c d d d d d d d 2 2 2 2 C3H/HeJ k k k k k k k 2 1 1 2 CBA/J k k k k k k k 2 1 2 2 DBA/2 d d d d d d d 2 1 1 2 AKR/J k k k k k k k 1 2 1 2 ASW/Sn s s s s s s s 2 2 2 nd C57BR k k k k k k k 2 2 2 2 Linhagens
congênicas
BALB.B b b b b b - b 2 2 2 nd BALB.K k k k k k k k 2 2 2 nd B10.BR k k k k k k k 2 2 2 nd B10.D2 d d d d d d d 2 2 2 nd B10.Q q q q q q - q 2 2 2 nd B10.S s s s s s - s 2 2 2 nd C3H.SW b b b b b - b 2 1 1 nd
Adaptado de Klein (1986) e de Klein et al. (1990)
10.4 - Manutenção e obtenção dos diferentes
estágios evolutivos em laboratório
Helene Santos Barbosa O Trypanosoma cruzi é um flagelado da Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae, caracterizado por ter um único flagelo e uma única mitocôndria, na qual se situa o cinetoplasto, uma organela especializada que contém DNA. É de fácil identificação e deve ser apenas diferenciado de Trypanosoma rangeli, um flagelado nãopatogênico que circula em humanos nas Américas Central e do Sul, transmitido por alguns vetores que também transmitem T. cruzi. Para uma revisão detalhada da biologia celular do parasita, que foge ao perfil desta publicação, referimos De Souza (1984, 1989).
Como discutido acima, T. cruzi não é uma população homogênea mas composta de um pool de cepas que circulam nos ciclos doméstico e silvestre. Essa variação se reflete na morfologia, na virulência, nas curvas de parasitemia e mortalidade e na sensibilidade a drogas. A composição antigênica já foi bem estudada para várias cepas por abordagens bioquímicas e imunoquímicas. Reações cruzadas e antígenos cepa-específicos já foram detectados. Sondas moleculares para seqüências conservadas tanto do DNA do cinetoplasto como do nuclear são usadas para a detecção do parasita por PCR e também vêm sendo aplicadas para a tipagem de cepas.
Todo o ciclo do T. cruzi pode ser estudado in vitro, pois é, entre os tripanosomas patogênicos, um dos mais fáceis de ser mantido em laboratório. Já foram descritos diversos métodos para a obtenção dos diferentes estágios do parasita e estes podem ser cultivados em meios artificiais acelulares não definidos, meios acelulares definidos e em vários tipos celulares. O estudo da ultra-estrutural entre as várias formas ou estágios evolutivos do parasita, aponta diferenças morfológicas à semelhança das observações em microscopia óptica
(para revisão De Souza, 1984). A Figura 1 mostra aspectos morfológicos das diferentes formas do ciclo evolutivo do T. cruzi ao nível de microscopia óptica e eletrônica. Estas formas são identificadas pela posição relativa do cinetoplasto em relação ao núcleo.
Figura 1 – Aspectos morfológicos das diferentes formas evolutivas
do Trypanosoma cruzi ao nível de microscopia óptica (A, C, E) e eletrônica (B, D, F). A: epimastigotas (setas) cultivadas em meio LIT
apresentam forma alongada com cinetoplasto anterior ao núcleo.
Algumas formas tripomastigotas podem ser vistas (*) tendo como
caráter diferencial a presença de um cinetoplasto terminal ou
subterminal, com núcleo alongado. B: epimastigotas apresentando
núcleo (N), cinetoplasto (C) em forma de barra contido na matriz de
uma mitocôndria (*), microtúbulos subpeliculares (setas), flagelo
emergindo da bolsa flagelar, associado com o corpo basal (cabeça de seta). C: amastigotas, obtidas de cultura de células da linhagem
J774G8 apresentam forma arredondada ou ovóides (setas) com
cinetoplasto próximo ao núcleo. D: amastigotas apresentam forma
arredondada ou oval com cinetoplasto em forma de barra e flagelo
curto (não mostrado). E: tripomastigotas isoladas do sangue de
camundongo infectado. Os parasitas têm a forma de C ou U, com
extremidade afilada, o cinetoplasto grande e redondo com posição
terminal ou subterminal, núcleo alongado e flagelo que corre ao
longo do corpo do parasita sendo livre na extremidade. F:
tripomastigotas apresentando cinetoplasto esférico (C) em forma de
cesta com estrutura especial semelhante a cristas ordenadas
horizontalmente dentro de uma mitocôndria, bolsa flagelar (BF) de
onde emerge o flagelo (F) aderido ao corpo do parasita.
• Epimastigotas: apresentam um longo e grande corpo, núcleo
esférico, cinetoplasto (em forma de bastão) anterior ao núcleo,
bolsa flagelar em posição anterior ao núcleo, com flagelo livre e
presença de citóstoma. Podem ser cultivados em meio de
cultura, sendo o meio LIT o mais utilizado.
• Tripomastigotas metacíclicos: apresentam corpo fino, núcleo
fusiforme, flagelo ao longo de todo o corpo do parasita,
cinetoplasto (em forma esférica) na extremidade posterior do
parasita, conseqüentemente posterior ao núcleo. A
metaciclogênese, processo de transformação de formas
epimastigotas em tripomastigotas metacíclicas, deve-se a um
estresse nutricional imposto pelas condições físico-químicas da
parte posterior do trato digestivo do inseto, e é um passo crucial
durante o ciclo de vida do T. cruzi. Esse processo pode ser
simulado em cultivo in vitro do parasita a 27ºC, utilizando-se
tanto meio complexo como meio quimicamente definido. A
possibilidade de se obter grandes quantidades de
tripomastigotas metacíclicos in vitro com propriedades
biológicas similares às das formas derivadas do inseto facilita o
estudo com T. cruzi quanto a antígenos, receptores de
superfície estágio-específicas, expressão diferencial dos genes,
mecanismos moleculares de regulação morfogenética, entre
outros. Tripomastigotas derivados de metaciclogênese natural
também podem ser obtidos em laboratório, a partir da infecção
de triatomíneos e da coleta da urina contaminada.
• Amastigotas: apresentam forma arredondada, com
cinetoplasto em forma de bastão, um flagelo curto visível
apenas à microscopia eletrônica e presença de citóstoma.
Podem ser obtidas quando da ruptura de células infectadas ou
da diferenciação in vitro em meio definido.
• Tripomastigotas: originários do sangue ou recém-liberados de
células também podem ser obtidos em laboratório.
Todas as formas tripomastigotas, bem como as amastigotas, provenientes de diversas origens, mantêm sua capacidade de invasão em culturas de células de mamíferos, o que pode ser facilmente reproduzido in vitro em laboratório, tanto para fins de obtenção de parasitas e seus produtos metabólicos, como para fins de experimentação da interação parasito-célula. A penetração do T. cruzi pode levar de 5 minutos até 48 horas, a depender da origem do tripomastigota, da cepa do parasita e do tipo e da espécie da célula hospedeira. Durante a penetração há a formação de um vacúolo em torno do parasita, cuja membrana é lisada em até 20 horas. Livres no citoplasma da célula hospedeira, os tripomastigotas se diferenciam em amastigotas, iniciando-se a fase de divisão celular, em ciclos reprodutivos consecutivos, até tomar todo o espaço disponível na célula, quando provavelmente, também por estresse nutricional, é induzida nova diferenciação para formas tripomastigotas que são liberadas quando a célula hospedeira é por fim lisada pelos parasitas.
Descreveremos a seguir os protocolos utilizados para a obtenção dos diversos estágios evolutivos do T. cruzi.
10.4.1 Cultivo de epimastigotas em meio LIT
Meio LIT (liver infusion tryptose)*
NaHPO .7H O 11,6 g 4 2
NaCl 4 g KCl 0,4 g Glicose 2,2 g Triptose 5 g Caldo de infuso de fígado 5 g Extrato de levedura 15 g Hemina 25 mg/20 ml Tris Base 0,1
N
Soro fetal bovino 100 ml Penicilina 200.000 U Estreptomicina/gentamicina 50 mg
H O qsp 1.000 ml 2
*Camargo (1964)
• dissolver as substâncias, sob agitação, em aproximadamente
850 ml de H O destilada. Ajustar o pH para 7,2-7,5 com HCl. 2
Adicionar o soro fetal bovino, completar o volume para 1.000 ml
e inativar todo o meio a 68ºC por 60 minutos. Filtrar
sucessivamente, com membranas de 1,2 mm, 0,45 mm e 0,2
mm (não estéreis) e filtrar estéril com membrana de 0,2 mm;
• o meio deve ser distribuído em garrafas estéreis e mantido a
4ºC (caso seja usado dentro de duas semanas) ou congelados
a -20ºC por vários meses. Para controle da esterilidade do
meio, recolher duas alíquotas em tubos com roscas, deixando
um a temperatura ambiente e outro na geladeira.
Inóculo e manutenção do parasita
Material
• estufa com controle de temperatura na faixa de 26-28ºC
• erlenmeyer de 250 ml
Inoculação e crescimento
• o inóculo inicial em meio LIT deve ser de 7,5 x 106
parasitas/ml em erlenmeyer com 50 ml de meio. As culturas de
T. cruzi são mantidas de 26-28ºC. Atenção especial deve ser
dada à aeração da superfície/volume de meio. Sob estas
circunstâncias não é necessária a agitação durante o cultivo;
• durante os primeiros quatro dias de cultivo ocorre a fase de
multiplicação ou crescimento celular, emergindo então para a
fase estacionária, quando a população alcança 15 x 108
parasitas/ml. Durante a fase logarítmica de multiplicação há
predominância maciça de formas epimastigotas, sendo muito
rara a presença de formas metacíclicas. O número de formas
metacíclicas eventualmente introduzidas com o inóculo inicial
permanece constante;
• quando a cultura atinge sua fase final de crescimento
exponencial, em torno de 72-96 horas, o número de
tripomastigotas metacíclicos aumenta alcançando seu nível
mais alto, com 3-4 x 107 parasitas/ml;
• se as culturas forem mantidas permanentemente em fase
logarítmica de crescimento pelo subcultivo diário, o pico de
formas metacíclicas não ocorre e sua quantidade é
insignificante. Se, por outro lado, os epimastigotas forem
transferidos para um meio de cultura fresco no final da fase
exponencial, mas antes de ocorrer evolução para formas
metacíclicas, um pequeno número de metacíclicos pode ser
encontrado no meio. Após a segunda passagem nestas
condições, a proporção de metacíclicos decai;
• epimastigotas na fase logarítmica de crescimento ou no início
do plateau podem ser usadas como inóculo para cultivar novas
culturas.
10.4.2 Obtenção de tripomastigotas sangüíneos
Utilizam-se camundongos infectados e no dia em que a parasitemia é máxima para a cepa de T. cruzi em estudo, faz-se o sacrifício dos animais, sangria por punção cardíaca e separação dos tripomastigotas por centrifugação diferencial. Para se saber o dia em que os animais devem ser sacrificados é necessário o acompanhamento da parasitemia, feito através da sangria dos animais pela cauda (ver Capítulo 13). Uma vez estabelecidos os inóculos e o modelo experimental, a cinética de parasitemia é extremamente reprodutível, permitindo o conhecimento prévio do dia em que a parasitemia alcança seu pico. Para camundongos Swiss infectados com 105 tripomastigotas sangüíneos da cepa Y é no sétimo dia pós-infecção. Para cada par de linhagens de camundongo e de parasita esse dia precisa ser pré-estabelecido. O procedimento para inoculação e punção cardíaca dos animais no pico da parasitemia está no Capítulo 13. Descreveremos então o procedimento para separação e purificação dos tripomastigotas sangüíneos após a obtenção do sangue infectado.
Separação de tripomastigotas sangüíneos por centrifugação diferencial
Material
• câmara anestésica com éter
• placa de cortiça e agulhas
• citrato de sódio a 3.8%
• meio DME com 10% de soro fetal bovino
• seringas de 1 ml
• algodão ou gaze
• álcool a 70%
• isopor com gelo
• centrífuga clínica (de preferência refrigerada)
• banho-maria
• microscópio óptico
• câmara de Neubauer
• pipeta Pasteur
• micropipeta para 5-10 µl
Método
• anestesiar os camundongos em câmara de éter e fixá-los com
alfinetes em uma placa de cortiça;
• retirar, por punção cardíaca, com auxílio de uma seringa, o
sangue com citrato de sódio a 3,8% (cerca de 0,4
ml)/camundongo; colocar o sangue infectado em tubos com
rosca, conservando-os em gelo (4ºC) durante a sangria; manter
a seringa e a agulha com resíduos de sangue protegidos por
algodão ou gaze embebidos em álcool a 70% no intervalo entre
uma sangria e outra. Os animais deverão ser imediatamente
armazenados em um saco plástico para posterior descarte,
segundo as normas descritas no Capítulo 8;
• após a sangria de todos os animais, centrifugar a 1.200 rpm
de 10-15 min e deixar em repouso na estufa a 37ºC, por 15 min;
• retirar o sobrenadante e centrifugar a 3.500 rpm por 10-15
min;
• desprezar o sobrenadante e acrescentar cerca de 6 ml de
meio DME contendo 10% de soro fetal bovino;
• colocar em banho-Maria a 37ºC, para induzir a formação de
grumo de plaquetas;
• retirar o grumo e centrifugar a 3.500 rpm de 10-15 min; Obs:
se não houver formação de grumo, centrifugar à baixa rotação
(2.000 rpm/10 min).
• desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento
contendo os parasitas em 1 ou 2 ml de meio DME, fazer
diluição de 1/100 e contar em câmara de Neubauer.
Obs: todo o material com sangue infectado deverá ser
desprezado em um recipiente contendo solução desinfetante e
nesta solução permanecer no mínimo por 24 h, para posterior
lavagem.
10.4.3 Metaciclogênese in vitro
Composição e preparo dos meios TAU e TAU-3AAG
Meio TAU* m M g/l de meio NaCl 190 11,10 KCl 17 1,26
MgCl 2 0,407 2
CaCl 2 0,294 2
Tampão fosfato pH 6,0 8 0,294
NaHCO 0,6 0,005 3
*Contreras et al. (1985)
Para preparo do meio TAU3AAG, acrescentar
mM g/l de meio
Glicose 10 1,80 I-Prolina 10 1,17 Glutamato de sódio 50 8,456 Aspartato de sódio 2 0,31
Método
• manter epimastigotas em meio LIT com passagens semanais;
• ressuspender parasitas provenientes de meio LIT após seis a
oito dias de cultivo, (percentual de tripomastigotas inferior a 5%)
numa concentração de 5 x 108 parasitas/ml em um volume total
de 10 ml de meio TAU;
• incubar por 2 h a 28ºC;
• proceder a contagem dos parasitas (em meio TAU) para o
inóculo em meio TAU3AAG, cuja concentração não deverá
ultrapassar 3-5 x 106 parasitas/ml;
• incubar os parasitas em 10 ml de TAU3AAG em garrafas de
cultura (25 cm2); homogeneizar e deitá-las rapidamente;
• manter as garrafas sem agitação por três a quatro dias a
28ºC, observando diariamente as garrafas em microscópio
invertido;
• no quarto dia de incubação os parasitas são coletados
virando-se a garrafa lentamente e evitando a contaminação
com os epimastigotas presentes na nata que se forma
principalmente na superfície do meio. Invertendo-se a garrafa, a
nata, por tensão superficial, fica retida na parte inferior da
mesma. Os tripomastigotas são recolhidos, centrifugados a
10.000 rpm a 5ºC por 15 min e o sedimento contendo os
parasitas é ressuspenso em 1 ml de meio de cultura (Contreras
et al., 1985).
Avaliação da eficiência da metaciclogênese
• após 6 horas em meio TAU3AAG, uma drástica redução no
número de parasitas pode ser observada em decorrência da
adesão dos epimastigotas ao fundo (substrato) da garrafa. Após
24 horas (sem agitação) a cultura já apresenta três fases
distintas: na parte inferior encontram-se várias formas
epimastigotas aderidas ao substrato, à meia altura alguns
tripomastigotas metacíclicos e na parte superior encontra-se
uma nata onde vários epimastigotas estão fixados formando
rosetas ou mesmo isolados. A percentagem de tripomastigotas
vai aumentando à meia altura do meio até o quarto dia,
proveniente da transformação de epimastigotas em
tripomastigotas que resulta na sua liberação do substrato.
Como nem todos os epimastigotas irão se aderir ao substrato,
haverá sempre um percentual de epimastigotas ao final do
ensaio;
• no quarto dia de incubação, a percentagem de formas
tripomastigotas deverá estar na faixa de 80%. Alguns fatores
podem interferir na metaciclogênese: (a) a idade das culturas
em meio LIT; (b) o percentual de formas tripomastigotas e
esferomastigotas em meio LIT (deverá ser inferior a 5%); (c) o
inóculo de parasitas em meio TAU3AAG (concentração máxima
de 5 x 106/ml); (d) a altura do meio nas garrafas durante a
metaciclogênese (não deve ultrapassar 10mm); (e) ausência de
agitação das garrafas (é importante permitir a adesão dos
epimastigotas à superfície do frasco, à semelhança do que
ocorre no intestino do barbeiro, para que ocorra a
metaciclogênese).
10.4.4 Obtenção de tripomastigotas e amastigotas a partir de cultura de células
10.4.4.1 Preparo de meios
Meio DMEM*
Meio liofilizado 10,15 g Nitrato férrico 0,0001 % Estreptomicina 100 U/ml Penicilina 100 mg/ml Soro fetal bovino 10 mL
H O DDD qsp 1 L 2
*Dulbecco's modified Eagle's medium
Preparo do meio
• trabalhar com 90% do volume de água destilada, que
corresponde ao volume final do meio. Usar agitador magnético
durante a mistura dos componentes;
• adicionar o conteúdo do frasco à água destilada, misturando
na temperatura de 15 a 30ºC;
• completar o volume com água destilada e adicionar aos
poucos NaHCO (em pó), ajustando o pH do meio, para 0,2-0,3 3
abaixo do valor final desejado (7,2). Após ajuste do pH, manter
o recipiente fechado até a filtragem do meio;
• adicionar o nitrato férrico, os antibióticos e o soro fetal bovino;
• filtrar o meio com membrana de 0,2 mm de poro;
•distribuir em garrafas, podendo o meio estéril ser congelado;
Obs: o pH geralmente aumenta 0,1-0,3 após a filtração.
Meio 199
Meio liofilizado g 10,15 Estreptomicina 100 U/ml Penicilina 100 mg/ml Soro fetal bovino 10 ml
10 ml H O DDD qsp 1 l 2
Preparo do meio
• mesmo procedimento utilizado para o meio DMEM.
10.4.4.2 Linhagens celulares
• para obtenção de formas tripomastigotas será descrito o
procedimento utilizado para células L-A9, uma linhagem celular
de fibroblastos transformados;
• para obtenção de formas amastigotas será descrito o
procedimento utilizado para células J774G8, uma linhagem
celular semelhante a macrófago derivada de um célula reticular
de sarcoma de camundongos Balb/C.
Manutenção de linhagens
• as células são cultivadas em frascos de vidro ou de plástico de
250 ml (inóculo 5x106 células por garrafa) a 37ºC em meio
DMEM ou 199 suplementado com 10% de soro fetal bovino
(SFB) a pH 7,2, sendo este trocado a cada dois dias;
• após seu crescimento, as células da linhagem L-A9 devem ser
tripsinizadas por incubação por 1-3 min/37ºC com solução
contendo 0,1% tripsina, 0,02% verseno e PBS na razão 1:1:3.
Esta incubação é interrompida pela adição de DMEM+5% SFB
mantendo-se o tubo em banho de gelo. As células são então
centrifugadas (1.000 g/5 min) e o sedimento ressuspenso em
novo meio. Após contagem desta suspensão as células são
plaqueadas;
• durante o crescimento da linhagem J774G8, algumas das
células se destacam da superfície da garrafa. Essas células na
fase líquida da cultura são usadas para iniciar as subculturas e
como fonte para culturas novas.
10.4.4.3 Obtenção de tripomastigotas
Infecção das células L-A9 para obtenção de tripomastigotas (Carvalho & De Souza, 1983)
• a infecção é feita com tripomastigotas sangüíneas (ver item
13.3.2) ressuspensos em solução salina ou meio de cultura em
razão parasita/célula hospedeira entre 3-5;
• os parasitas que não entram nas células hospedeiras nas
primeiras 24 h de interação (37ºC), são removidos por troca de
meio;
• a depender da cepa de parasita utilizada, deverá previamente
ser realizado um estudo cinético no período de dois a doze
dias, para acompanhamento do ciclo do parasita, visando
determinar o dia de liberação máxima de tripomastigotas no
sobrenadante. Este monitoramento deve ser feito, diariamente,
por plaqueamento das células, fixando-se as lamínulas em
solução de Bouin e corando com solução de Giemsa
• utilizando-se a cepa Y, o isolamento de tripomastigotas é feito
a partir da coleta do sobrenadante de células LA-9 após seis a
sete dias de infecção;
• o sobrenadante é centrifugado a 500 g por 10 min e deixado a
37ºC por 30 min; o sedimento que contém células hospedeiras
é desprezado. O sobrenandante é, a seguir, centrifugado a
1.000g por 10 min, para obtenção dos parasitas que devem ser
ressuspensos em meio de cultura, e sua concentração ajustada
para 1,5 x 108 células/ml;
• para manutenção da produção de tripomastigotas em cultura
de células, os repiques são realizados com parasitas
provenientes das próprias culturas.
Purificação de tripomastigotas com gradiente de metrizamida
• o sedimento final contendo parasitas e células hospedeiras é
ressuspenso em 2 ml de meio 199 e colocado no topo do
gradiente de metrizamida (0,01M tampão fosfato, pH 7,2 com
2% SFB) preparado em duas concentrações: 10 e 15%;
• o material é centrifugado a 1.000 g por 20 min em um rotor
horizontal;
• os tripomastigotas puros são encontrados na interface de 10 e
15% do gradiente de metrizamida.
Avaliação de rendimento
• a linhagem LA-9 libera grande quantidade de tripomastigotas no sobrenadante após seis a sete dias de cultivo. Poucos amastigotas são vistos no sobrenadante dessas culturas. Com a utilização dessas células é possível se obter cerca de 6.5 x 107 parasitas por garrafa (250 ml). A purificação de amastigotas com metrizamida não interfere com a infectividade desses parasitas.
10.4.4.4 Obtenção de amastigotas
Infecção das células J774G8 para obtenção de amastigotas (Carvalho & De Souza, 1983)
• a infecção é feita com tripomastigotas sangüíneas (ver item
13.3.2) ressuspensos em solução salina ou meio de cultura na
razão parasita/célula hospedeira entre 3-5;
• para o isolamento de amastigotas, o sobrenadante de células
J774G8 está, seis a oito dias após a infecção, com formas
tripomastigotas sangüíneas ou provenientes de cultura de
células. O sobrenadante nesta fase contém aproximadamente
>70% de amastigotas;
• procede-se à centrifugação do sobrenadante a 1.000 g por 5
min e ressuspende-se em meio 199 para a concentração de 1,5
x 108 parasitas/ml.
Purificação de amastigotas com gradiente de metrizamida
• o sedimento final contendo parasitas e células hospedeiras é
purificado resusspendendo-se este em 2 ml de meio 199; é
colocado no topo do gradiente de metrizamida (0,01M tampão
fosfato, pH 7,2 com 2% SFB) preparado em três concentrações:
15, 17 e 21%;
• o material é centrifugado a 1.000 g por 20 min em uma
centrífuga clínica com rotor horizontal. Os amastigotas puros,
após a centrifugação, são encontrados na interface de 15 e
17% do gradiente de metrizamida.
Avaliação de rendimento
• células J774G8 infectadas com tripomastigotas sangüíneos da
cepa Y apresentam tendência de se romperem antes de
começar a diferenciação de amastigotas para tripomastigotas.
Após seis a sete dias de cultivo, grande quantidade de
amastigotas é liberada no meio de cultura. Em algumas células
o ciclo intracelular é completado e formas tripomastigotas são
liberadas no meio. As células hospedeiras que permanecem
intactas contêm muitos parasitas intracelulares com formas em
divisão, que podem ser liberadas pela passagem em seringas
com agulha. Esse método permite a obtenção de 2 x 107
parasitas/ml de meio de cultura. A purificação de amastigotas
com metrizamida não interfere com a infectividade desses
parasitas.
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