Ueber Pebrine und verwandte Mikrosporidien. Ein Beitrag zur Kenntnis der brasilianischen Sporozoen. Erste Mitteilung

Sobre a pebrina e microsporídios

afins. Uma contribuição ao

conhecimento dos esporozoários

brasileiros*

 

Primeira comunicação

A seguir começamos a divulgação dos resultados que obtivemos num estudo aprofundado da pebrina e tipos aparentados de microsporídios. Pela dificuldade do tema, não conseguimos dominá-lo completamente mesmo depois de muito trabalho, o que nos impediu de publicá-lo até agora. No entanto, os resultados que conseguimos, novos ou divergentes dos anteriores, justificam a publicação.

Além do interesse prático para a sericicultura, são principalmente as seguintes condições que tornam a pebrina interessante para nós: em primeiro lugar, trata-se de um dos poucos processos parasíticos nos quais considera-se comprovada a transmissão hereditária; em segundo, atualmente todas as esporoses e, em especial, as que não são completamente conhecidas, oferecem interesse para a pesquisa parasitológica, e, em terceiro, na busca por parasitas desconhecidos passou-se a discutir a ação dos microsporídios como parasitas celulares, principalmente nos tumores malignos.

O primeiro impulso para esse trabalho veio através de uma observação, feita por um de nós há 15 anos, na ocasião do seu primeiro estudo sobre esporoses. Tratava-se da ocorrência, desde então muitas vezes comprovada e em São Paulo quase regular, de uma espécie de pebrina em uma borboleta nativa e abundante na região (a Brassolis astyra Godt). Nas inúmeras lagartas, pupas e borboletas de outro tipo examinadas naquela época não foi possível encontrar novamente essa ou outra espécie. Em contrapartida, encontrou-se um microsporídio semelhante em um pequeno peixe (Girardinus sp.).

Por falta de material para comparação ficou a dúvida, se a Nosema bombycis, de formato muito parecido, é idêntica ou apenas semelhante, e se ela era infecciosa para o bicho-da-seda.

Somente há um ano e meio retomamos esse problema. Conseguimos não somente encontrar abundante material da Brassolis astyra, mas também, durante as experiências de transmissão para outras espécies, descobrimos uma espécie nova, diferente e bem característica. Em conseqüência, foram feitos novamente inúmeros exames, que revelaram um grande número de microsporídios aparentemente diversos, os quais ocorrem, em maior parte, nos lepidópteros, enquanto uma espécie foi encontrada em ortópteros (Periplaneta) e outra em aracnídeos (Hydrachne sp.). Com as espécies de lepidópteros foram feitas novas experiências de transmissão.

Nesse meio tempo foram introduzidas, também em São Paulo, lagartas de bicho-da-seda e o Dr. Alfonso Splendore conseguiu obter um bom número de ovos saudáveis da Bombyx mori. A cultura daí obtida foi utilizada em experimentos de infecção. Um outro material apropriado aos experimentos de infecção encontramos na Pieris monuste L. (segundo Holland), que, sem estar ela própria infectada, podia ser facilmente contaminada; também uma cultura de Attacus eurota serviu para fins de exame.

Posteriormente, obtivemos através do Dr. Achille Splendore, da Itália, bichos-da-seda infectados com pebrina, que nos forneceram material para comparação e também para bem-sucedidas experiências de transmissão.

Como só existiam poucas especificações em relação à técnica de fixação e coloração, bem como sobre a utilização de reagentes, dedicamo-nos minuciosamente a essas questões, o Dr. Splendore ocupando-se de muitas experiências demoradas. Foi possível, pelo menos para determinados estágios, encontrar métodos satisfatórios de coloração, apresentando-se entre as diversas espécies pequenas diferenças; outros estágios são, sem dúvida, pouco ou nada apropriados para a utilização de corantes. Para evitar possíveis equívocos, fomos obrigados a nos familiarizar com a anatomia microscópica dos insetos; além disso, tivemos também de determinar as espécies dos hospedeiros; por causa da carência de literatura correspondente, isso só pôde ser feito lentamente, com demoras e dificuldades. Porém, a confiança nos resultados obtidos aumentou em virtude da autonomia dos trabalhos e da necessidade, que se impôs, de repetir freqüentemente determinadas experiências.

A seguir vamos aprofundar os pontos remanescentes:

1. Multiplicidade e caracterização das espécies de acordo com

sua forma, tamanho e ocorrência.

2. Comportamento aos reagentes, métodos de fixação e

coloração.

3. Histórico de desenvolvimento, infecção espontânea e

transmissão artificial. A questão da hereditariedade.

4. Sobre a classificação das espécies Nosema e a posição dos

microsporídios no sistema.

 

1. Multiplicidade das espécies Nosema.

Caracterização das formas observadas

Para os corpúsculos de Cornalia 1 constantemente encontrados na doença do bicho-da-seda, conhecida como pebrina ou gatina, parece ser mais adequado o nome de Nosema, introduzido por Nägeli, do que Glugea, denominação mais tarde escolhida por Thélohan. Se bem que utilizado originalmente apenas para uma fase do desenvolvimento, que segundo nossa concepção corresponde ao esporo permanente, mantivemos esse como nome genérico para todo o organismo correlacionado. Para a família utilizamos o nome microsporídios, atribuído por Balbiani, já que a unificação com os mixosporídios proposta por Thélohan baseia-se em observações que não podemos confirmar com o material de que dispomos. Os microsporídios caracterizam-se, segundo nossa concepção, menos por seu diminuto tamanho do que pela não comprovação da existência de filamentos polares e cápsulas; daí por que não podemos juntá-los aos mixosporídios sob a denominação de cnidosporídios. Formas semelhantes, mas com cápsulas polares nítidas ou invisíveis e filamentos evidentes (segundo Gurley, feno- ou criptocistos [sic]) poderiam ser agregadas aos mixosporídios ou consideradas como uma família à parte; apesar de intensa busca, até agora não conseguimos encontrar essas formas e nunca as vimos pessoalmente.

Como até agora tinha sido descrito apenas um reduzido número de microsporídios, nada permitia adivinhar que (como queremos acreditar) seu número de espécies fique pouco atrás daquele dos mixosporídios fenocísticos [sic].

O número mínimo e constante de esporos fez Gurley destacar dois grupos de um terceiro, no qual o número é variável e indeterminado e, geralmente, muito grande (na realidade, são espécies Nosema).

Diferenças morfológicas só foram encontradas ocasionalmente, como por J. Pfeiffer; parece-nos que a maioria dos observadores autônomos era de opinião que as formas ocorridas em diversas classes e ordens poderiam ser compreendidas como espécies diversas, principalmente quando diferiam também morfologicamente; em contrapartida, eles só reconheciam uma espécie entre os lepidópteros, a pebrina ou Nosema bombycis. Balbiani, que alegava ter infectado com ela a Liparis neustria, e que a L. chrysorrhoea não era infectável, deixou de mencionar que, na abundante e sociável lagarta não ocorre espontaneamente nenhuma espécie semelhante à Nosema, apesar de essa possibilidade ser bastante razoável. Também Pfeiffer, que transferiu a pebrina observada na Attacus pernyi para a Plusia gamma, não se pronunciou sobre a ausência de pebrina nesta espécie e não diferenciou a Nosema da Attacus da Nosema bombycis, embora observe que a primeira não se apresenta disseminada da mesma maneira nas lagartas.

Apenas nesta região, encontramos aproximadamente dez tipos morfologicamente diversos de Nosema bombycis em lepidópteros; além disso, observamos nos (menos bem examinados) insetos, aracnídeos e peixes, uma nova espécie afim e, no entanto, diversa. Daí admitir-se que, com o aumento dos observadores e a dilatação dos círculos de ação, poderiam ser descobertas inúmeras formas novas.

Para a determinação das espécies utilizaremos, por enquanto, apenas os chamados corpos pebrinos, ou seja, os esporos de propagação ou permanentes, já que as outras formas, por diversos motivos, não são convenientes para a classificação.

Em virtude do tamanho reduzido e da estrutura simples dos esporos permanentes, devemos levar em consideração, como nas bactérias, outras características que não propriamente as morfológicas, como, por exemplo, a resposta aos reagentes, a colorabilidade, a ocorrência e a localização em cada hospedeiro e, finalmente, o resultado das experiências de infecção.

Apesar de a forma e o tamanho dos esporos individuais variarem um pouco na maioria das espécies, os resultados que nos proporcionaram até agora têm sido bastante satisfatórios, pois os valores médios e proporções de cada dimensão nitidamente se distinguem entre si. Apesar disso, vemos essa classificação apenas como provisória. Nas circunstâncias apresentadas parece ser impossível nomear as espécies apenas pelas características dos esporos, que apresentam principalmente diferenças numéricas; por isso seguimos um método, hoje em dia bastante desaprovado, de atribuir a denominação da espécie ao nome do primeiro hospedeiro no qual foi descoberta.

Para a orientação dos esporos partimos dos seguintes pontos de vista:

Cada um dos esporos aqui observados possui duas pontas com cantos mais ou menos arredondados, que designamos como pólos; onde ocorre uma diferença nítida, valerá como pólo dianteiro o mais pontiagudo, com a extremidade livre de vacúolos, e o outro como pólo traseiro. Através dos dois será traçado o diâmetro maior ou o eixo bipolar. Perpendicular ao meio deste encontram-se os eixos equatoriais no plano equatorial. O maior diâmetro, coincidente ou paralelo com o diâmetro equatorial, valerá como largura. Nos esporos regularmente constituídos, o plano cortado pelos dois pólos forma duas metades simétricas; não existe, então, nenhuma diferença entre o diâmetro de largura e o de espessura. Se existir alguma diferença, então o maior diâmetro, perpendicular ao eixo longitudinal, valerá como largura, correspondendo à posição que o corpo é levado a adotar. O diâmetro perpendicular à largura será considerado como espessura. A linha que liga um pólo a outro pela superfície externa é denominada de meridiano; se estiverem curvadas em todo comprimento teremos uma forma oval regular ou irregular, conforme as metades separadas através do equador sejam idênticas entre si ou não. A forma oval irregular toma então o formato de pêra, que pode ser regular ou irregular. No primeiro caso a parte central terá a forma de cone e as extremidades (calotas polares) serão abauladas. Se a parte central for cilíndrica, teremos assim uma forma cilíndrica-oval curta ou menos estendida. As descrições referem-se sempre ao tipo médio, sem levar em conta pequenas diferenças, quando essas só ocorrem em esporos isolados.

Falamos de polimorfia somente quando, numa mesma espécie, ocorrem variações regulares e podemos desprezar pequenas diferenças nas dimensões se as proporções permanecerem as mesmas.

Fornecemos, a seguir, uma lista das espécies Nosema observadas, seus hospedeiros e algumas informações sobre suas formas de vida. Como algumas espécies são largamente difundidas, certas observações poderão estar repetidas; também estamos dispostos a ceder material àqueles que se interessam pelo assunto.

No exame dos lepidópteros nos dedicamos mais às lagartas; poucas espécies foram encontradas em insetos completos.

Lista dos hospedeiros nos quais as espécies Nosema foram observadas:

I. Lepidoptera

A. Borboletas (Rhopalocera)

1) Brassolis astyra 2 Godt.) Lagarta muito encontrada em ninhos

coletivos sobre palmeiras. Uma espécie de Nosema encontrada

quase constantemente: N. astyrae.

2) Dione juno Cram. Lagarta abundante e sociável sobre

Passiflora edulis. Uma espécie muito abundante: N. junonis.

3) Dione vanillae L. Lagarta menos abundante, esporádica

sobre Passiflora edulis, 3 espécies.

I. Nosema vanillae α Não muito abundante.

II. Nosema vanillae β. Mais ou menos abundante.

III. Nosema vanillae γ. Não muito abundante.

4) Danais erippus L. Muito propagada em zonas mais quentes.

Lagartas não raras, mas sempre esparsas (como também os

ovos) sobre a Asclepias curassavica. Uma espécie de Nosema

erippi. Bastante abundante.

5) Danais gilippus L. Espécie muito semelhante à anterior,

também na sua forma de vida. Uma espécie de Nosema,

provavelmente idêntica à N. erippi. Pouco abundante.

6) Mechanites lysimnia Fabr. Lagarta esparsa sobre Passiflora

edulis. Uma espécie de Nosema lysimniae. Bastante

abundante.

7) Catopsilia eubule. Uma espécie, Nosema eubules. Borboleta

abundante mas raramente infectada. Nenhuma larva

examinada.

B. Mariposas (Nocturna)

8) Lophocampa flavostica, Bombycidae Gram. Lagarta sociável,

abundante sobre Senecio brasiliensis. Uma espécie, Nosema

lophocampae. Bastante abundante.

II. Ortoptera

9) Periplaneta americana, Blattidae. Inseto doméstico comum

que acompanha o ser humano em todas as zonas quentes.

Uma espécie, Nosema periplanetae. Muito abundante.

Além disso foram encontradas algumas espécies de pebrina bastante esparsas e que, por isso, foram pouco estudadas. Citamos as seguintes:

1) Uma espécie de Nosema, que se diferencia das

anteriormente citadas por causa do seu tamanho considerável,

encontrada uma vez numa borboleta pertencente aos pierídeos.

2) Uma espécie, semelhante a Nosema lophocampae, uma vez,

num bombicídeo desconhecido. (Apenas uma borboleta

examinada.)

3) Uma espécie, diferente da N. periplanetae, em Gryllotalpa sp.

4) Uma Nosema, provavelmente da própria espécie, em uma

espécie de hidracnídeos.

Resta-nos acrescentar as informações sobre a classe dos

Peixes

10)Girardinus sp, ciprinodonte, continha uma espécie, Nosema

girardini. Freqüente, mas nem sempre abundante na pele,

musculatura, intestinos seroso e mucoso.3

De acordo com a forma, as espécies se agrupam da seguinte maneira: A. Esporos Monomórficos

I. Forma Ovóide

Não foi encontrada uma forma regular, com calotas polares simétricas, pois a extremidade traseira era sempre mais rombuda. De resto, as seguintes espécies apresentavam uma forma oval simétrica bilateral, cuja largura maior coincidia com o plano equatorial:

1) Nosema vanillae a.a Comprimento 2,5-2,75m, largura 0,85-

1,30m (Fig. 1).

2) N. astyrae. Comprimento 4-4,5m, largura 2,5-3m (Fig. 2).

II. Forma Ovocilíndrica

3) N. periplanetae. Comprimento 5-6m, largura 2,5-3,5m (Fig.

3). Aqui pode ser incluída, provavelmente, também a forma de

uma espécie de pierídeo.

III. Forma de Pêra

Simetria bilateral, mas não antero-posterior. O maior diâmetro da largura está próximo ao pólo traseiro.

4) N. girardini. Comprimento 2-2,5m, largura maior 1-1,5m (Fig.

4).

Aqui pode ser incluída também, provavelmente, a forma de uma

espécie de hidracnídeo.

B. Esporos bi e polimorfos

I. Ovais e de formato ovocilíndrico mais ou menos estendido

5) N. lophocampae. Comprimento 3,5-4m, largura 1-2m. Forma

predominantemente ovocilíndrica (Fig. 5).

6) N. vanillae g.g Comprimento 3,5-6m, largura 2-3m. Forma

predominantemente ovocilíndrica estendida (Fig. 6).

7) N. erippi. Comprimento 3-3,5m, largura 1,5-2,5m. Forma

irregular oval e ovocilíndrica (Fig. 7).

8) N. vanillae b.b Comprimento 2,5-3,5m, largura 1-2m. Forma

oval e ovocilíndrica mais ou menos comprida (Fig. 8).

9) N. junonis. Comprimento 3,5-8m, largura 1-2m. Forma oval e

ovocilíndrica mais ou menos estendida (Fig. 9).

II. Forma oval e de pêra

10) N. lysimniae. Comprimento 4-6m, largura 2-2,5m. Forma

oval e de pêra (Fig. 10).

III. Outras formas parcialmente irregulares

11) N. bombycis. Comprimento 3,5-5m, largura 1,5-2,5m.

Diversos, em parte forma irregular oval e ovocilíndrica. Também

observada em uma N. bombycis de outra origem (Fig. 11).

12) N. eubules. Comprimento 2-5m, largura 1-2,5m. Diversas

formas: oval, ovocilíndrica e de pêra (Fig. 12).

Quanto aos demais, indicamos as figuras anexas que, em uma ampliação de 1.250 vezes, reproduzem exatamente as proporções.

Para determinação das borboletas nacionais baseamo-nos no livro escrito em português por A. Mabilde, sobre as borboletas do Rio Grande. Além disso, descrevemos algumas espécies segundo W. J. Holland, The Butterfly Book, Nova York, 1898. Infelizmente, as nomenclaturas dos dois não são idênticas. Uma resolução sobre os pontos conflitantes retardaria muito esta publicação, por isso adiamos a questão para uma época mais oportuna.

Em anexo fornecemos algumas informações sobre a localização das citadas espécies Nosema e as conseqüências do seu parasitismo para os hospedeiros.

Os corpúsculos da pebrina são encontrados não apenas nos locais da sua formação, mas também em outras regiões do corpo para onde são transportados pela corrente sangüínea ou pelas células migratórias. A sua localização, naturalmente, só poderá ser determinada no primeiro caso, podemos reconhecê-lo pelo fato de que os esporos ainda se apresentam nos agrupamentos originais. A metamorfose completa dos lepidópteros conduz a uma disseminação extensa, de maneira que a localização somente poderá ser estudada nas lagartas, ao passo que a transformação incompleta na Periplaneta não tem essas conseqüências.

Nos lepidópteros, a formação dos esporos permanentes dá-se principalmente no intestino e nos tubos de Malpighi, e depois nas glândulas sexuais e sericígenas. No intestino é atingida primeiramente a camada epitelial e logo a infecção se estende às fibras musculares bem como às ramificações da traquéia, abastecedoras do intestino. Apenas quando o processo está muito generalizado é que podemos encontrá-los nas adiposidades e em outros músculos [sic]. Esporos transportados individualmente são observados em quantidade crescente por todo o corpo, permitindo reconhecer a infecção mesmo em insetos vivos, através do exame microscópico das asas.

Na Periplaneta, são acometidos principalmente os tubos de Malpighi e, em segundo lugar, o vizinho intestino. Mas a infecção parece não se estender mais adiante. Na Gryllotalpa observamos a localização no intestino médio. A propagação na Girardinus já foi discutida anteriormente.

Uma conseqüência fatal da infecção natural foi observada somente na pebrina do bicho-da-seda. Nesta e na Brassolis astyra uma atrofia incomum da lagarta indica uma infecção muito intensa, não produzindo, em outras espécies, nenhum sintoma visível. Parece-nos que uma longa permanência do hospedeiro no estágio larvar determina, por um lado, a capacidade de rápida propagação da correspondente espécie de microsporídios e, por outro, os efeitos prejudiciais desse processo infeccioso geralmente benigno.

Na Dione juno, apesar da extensão da infecção, vimos muitas vezes um transcurso completamente normal da metamorfose, ao passo que pupas da Brassolis astyra, fortemente infectadas, morriam facilmente. Não se obteve nenhum casulo das lagartas de bicho-da-seda mais afetadas. Além disso, é provável que a infecção da pebrina possa reduzir a resistência a outras perniciosidades.

 

* Trabalho de Adolpho Lutz e Alfonso Splendore realizado no Instituto Bacteriológico do Estado de São Paulo e publicado em 1902, com o título “Üeber Pebrine und verwandte Mikrosporidien. Ein Beitrag zur Kenntnis der brasilianischen Sporozoen. Erste Mitteilung,” CentralBlatt für Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten (Jena), v.33, n.2, p.150-7, 1 figura. Dois anos depois viria a lume, no mesmo periódico, um complemento, e, em 1908, uma segunda comunicação dos mesmos autores, intitulada “Üeber Pebrine und verwandte Mikrosporidien. Zweite Mitteilung,” (v.46, n.4, p.311-5; 1 prancha com figuras numeradas 29 a 40). Esses trabalhos são reeditados adiante, nesse mesmo volume. O trabalho de 1902 foi traduzido para o italiano: “Pebrina e microsporidi simiglianti. Contribuizione alla conoscenza degli Sporozoari brasiliani,” Revista di Patologia vegetale (v.10, 1903), editada em Portici. Ao texto ora reeditado incorporamos as correções de erros de impressão, revisão e nomenclatura consignados por Lutz no complemento a esta primeira comunicação publicado em 1904, no CentralBlatt für Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten (ver adiante, neste mesmo volume). [N.E.]

1 “Corpúsculos de Cornalia” é a tradução literal de “Cornalia'schen Körperchen”. Emílio Cornalia foi um naturalista (1824-1882) que dirigiu o Museu de História Natural de Milão. [N.E.]

2 De acordo com Mabilde. [N.A.]

3 Segundo as fontes que consultamos, os peixes não têm o intestino subdividido como os mamíferos. A divisão assinalada por Adolpho Lutz não parece ter respaldo na literatura ictiológica. [N.E.]