Técnicas que utilizam como base a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Quando se pretende realizar experimentos com isoenzimas, muitos cuidados devem ser tomados em relação à estocagem das amostras e análise dos dados. As amostras devem ser frescas ou congeladas. Para executar a técnica de eletroforese (montagem do gel e coloração histoquímica) é necessária muita prática, assim como a interpretação da migração diferencial dos alelos nos géis.

Técnicas que utilizam como base a Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR)

Após a utilização das isoenzimas como marcadores moleculares, o segundo grande marco na sistemática molecular foi a descrição do método de amplificação do DNA in vitro, desenvolvido por

Kleppe et al. (1971) e posteriormente aprimorado por Mullis (Figura 13.2). A amplificação de uma sequência curta de DNA in vitro (cerca de 300 pares de bases) foi feita primeiramente com o uso de um fragmento da enzima DNA polimerase I (fragmento de Klenow) de bactérias Escherichia coli. A enzima foi utilizada para a polimerização de novas fitas de DNA a partir de uma fita molde de um dado organismo. Desta maneira, Kleppe et al. (1971) conseguiram quadruplicar a quantidade inicial do material genético inicialmente colocado na reação.

Figura 13.2 - Ao DNA extraído de cada espécime, colocados em tubos individualmente, são

acrescentados os reagentes necessários à PCR: tampão (para estabilizar o pH da reação), primers

(que se anelarão às fitas de DNA molde em suas regiões complementares), Taq polimerase (enzima

que sintetizará as cópias do DNA molde), dNTPs (nucleotídeos que serão incorporados pelas enzimas

polimerase às novas fitas) e cloreto de magnésio (co-fator da Taq polimerase, para seu bom

funcionamento). Estas reações são colocadas em um termociclador, onde são submetidas a diferentes

ciclos de temperatura, para a desnaturação da dupla-fita de DNA (para a abertura da dupla-fita; de 94 a

96º C), anelamento dos primers (encaixe em sua região complementar na fita-molde de DNA; de 45 a

65º C) e extensão (para a síntese das novas fitas de DNA; a 72º C). Este ciclo de temperatura se

repete de 20 a 35 vezes. No segundo ciclo são produzidas duas cópias da região alvo, flanqueada

pelos primers. Ao fim de 30 ciclos, mais de um bilhão de cópias da região alvo são produzidas.

Contudo, esta descoberta não recebeu muita atenção da comunidade científica, pois apresentava muitas limitações. Para cada ciclo posterior à desnaturação da dupla fita do DNA alvo, uma nova alíquota da polimerase precisava ser adicionada. Como os ciclos de desnaturação térmica da dupla fita de DNA ultrapassam os 90º C, a desnaturação da polimerase de E. coli era inevitável. A necessidade da adição da enzima a cada ciclo impossibilitava a automação do processo, aumentava consideravelmente a chance de contaminação da reação, além de dificultar em muito o trabalho.

Mullis (1985) resolveu o problema da desnaturação da dupla fita do DNA alvo ao utilizar uma DNA polimerase termorresistente extraída da bactéria Thermus aquaticus na amplificação do DNA. Esta nova polimerase, “Taq polimerase”, possui temperatura ótima quase duas vezes maior que a de E. coli. Seu emprego revolucionou a técnica de PCR, possibilitando um grande avanço nos estudos de biologia molecular de um modo geral, e rendeu a Mullis o Prêmio Nobel de Química de 1993.

Durante a década de 80 foram desenvolvidas diversas técnicas moleculares baseadas na PCR capazes de fornecer informações sobre o genótipo dos indivíduos analisados: RAPD, PCR-RFLP, análise de microssatélites e o sequenciamento de DNA. A capacidade de amplificação de determinados genes a partir de apenas quantidades ínfimas de material biológico possibilitou a análise genética de amostras secas (espécimes alfinetados de coleções entomológicas, por exemplo), mal preservadas, ou muito antigas.