Microssatélites

Figura 13.5. Análise da PCR-RFLP. Após a amplificação pela PCR de uma região mitocondrial de 700

pares de base (pb), o produto foi submetido à clivagem por uma enzima de restrição. Esta

endonuclease só clivará o fragmento se encontrar uma região nucleotídica específica (de 3 a 8

nucleotídeos), chamada sítio de clivagem. Neste caso, o haplótipo “EA” sofreu eventos de mutação

neste sítio e a endonuclease não clivou o fragmento de 700pb. No caso de “EB”, a endonuclease

encontrou o sítio de clivagem numa região a 250pb do início do fragmento total. Em “EC”, este mesmo sítio foi reconhecido a 330pb após o início. Desta forma, após a eletroforese dos produtos, foi possível

separar as três espécies pelo perfil de bandas (“EA” - uma banda de 700pb; “EB” - uma banda de

250pb e outra de 450; e “EC” - uma banda de 330pb e outra de 370pb).

Este método pode ser aplicável na detecção de espécies (taxonomia alfa), mas seu uso deve ser evitado em estudos populacionais e filogenéticos. O problema do seu uso em estudos populacionais é que as sequências de indivíduos da mesma espécie serão muito parecidas (ou mesmo idênticas) entre si, inclusive nos sítios de clivagem reconhecidos pelas endonucleases. Isso comprometerá a detecção de variabilidade. Já no caso de estudos filogenéticos, o problema deve-se a limitação de se usar padrões fenotípicos de bandas em um gel para inferir o grau de parentesco entre espécies.

A técnica de PCR-RFLP foi empregada em apenas três trabalhos (Tartarotti & Ceron 2005, Naegele et al. 2006, López et al. 2007), e com o barateamento dos custos do sequenciamento de DNA, a tendência é a de que ela caia em desuso em muito pouco tempo.

Uma aplicabilidade relativamente simples, porém útil do PCR-RFLP, está na diagnose molecular de espécies com morfologia semelhante, como fizeram Naegele et al. (2006). Para quem não é especialista em morfologia de triatomíneos, a diferenciação entre Rhodnius pictipes e Rhodnius stali pode não ser trivial. Através da amplificação do segundo espaçador interno ribossomal (ITS-2), os autores conseguiram separar as duas espécies utilizando duas das onze endonucleases testadas.

Seria interessante se um método simples, de baixo custo e de rápida execução como o PCR-RFLP fosse utilizado para a detecção de espécies crípticas. Contudo, o baixo polimorfismo detectado na análise dificulta a aplicação do PCR-RFLP nestes casos.

Microssatélites Em 1987 surgiu uma nova forma de se genotipar espécimes. A descoberta de regiões hipervariáveis do DNA, ou sequências “satélites”, contribuiu para o avanço nos estudos intraespecíficos (ou populacionais).

O termo “satélite” foi criado nos anos 60, para descrever uma fração do DNA que apresentava um sobrenadante de densidade distinta das demais quando submetido à centrifugação em gradiente. Esta região era caracterizada por apresentar repetições sequenciais (in tandem) de nucleotídeos, chamados motifs (de 10-50pb). Posteriormente, regiões repetitivas de motifs um pouco menores (10 a 30pb) foram descobertas e denominadas de “minissatélites”. Finalmente, em 1981, regiões com repetições sequenciais de um a seis pares de bases foram encontradas e denominadas “microssatélites”.

Mas como essas regiões de repetição sequencial são originadas? As células são estruturas complexas e requerem um perfeito sincronismo entre organelas e enzimas para funcionarem corretamente e responder bem aos estímulos externos. Neste “espetáculo microscópico”, todos os participantes parecem bem orquestrados e à prova de erros. Mas nem sempre é assim. O esforço repetitivo de uma ação pode induzir o erro. Charles Chaplin foi genial em sua atuação no filme “Tempos Modernos” (1936), mostrando como um trabalhador de uma fábrica pode enlouquecer após muitas horas de jornada de trabalho executando a mesma tarefa – aparafusar porcas. Se, ao sair da fábrica, por ventura visse objetos semelhantes a porcas, como botões de camisa, Chaplin não pensava duas vezes e tentava “aparafusá-los” também. Dentro das células, as enzimas DNA polimerase podem ter seus momentos de Charles Chaplin e se equivocarem durante a fase de replicação do DNA. Estes momentos são chamados de “escorregadas da polimerase”.

A replicação do DNA é um processo de duplicação do material genético. Uma das fitas (fita mãe) é usada como molde para a síntese de uma fita complementar (fita filha). A enzima DNA polimerase é responsável pela leitura da fita mãe e encaixe do nucleotídeo complementar correto na nova fita. Contudo, em regiões de repetição (chamadas de satélites), a polimerase tende a errar com uma maior frequência, às vezes incorporando repetições nucleotídicas a mais, como também deixando de

incorporá-las devidamente (Figura 13.6). Estes “erros” são normalmente corrigidos pelo mecanismo de reparo do núcleo (proofreading). Ocasionalmente, porém, alguns destes erros passam despercebidos e permanecem no genoma. Quando as “escorregadas da polimerase” ocorrem em células germinativas, esses “erros” são herdados pela próxima geração.

Figura 13.6. “Escorregadas” da DNA polimerase. Neste exemplo de uma região de microssatélites,

quatro espécimes foram coletados. A região de microssatélites ancestral continha quatro repetições dos nucleotídeos “CA”. Contudo, apenas um espécime continha o mesmo numero de repetições “CA” que o

ancestral. Devido às escorregadas da polimerase, foram incorporadas novas repetições nas

sequências dos outros três espécimes (uma na segunda sequência, três na terceira e quatro na quarta

sequência).

Tão logo se percebeu que a variabilidade alélica destas regiões de repetição exibia codominância e segregava mendelianamente, os microssatélites passaram a substituir as isoenzimas em estudos

populacionais (Figura 13.7). Para analisar os microssatélites, é necessário amplificar pela PCR os loci que contenham regiões de microssatélites. A esta reação de PCR, é acrescentado um par de primers específicos que flanqueiem a região de repetição. Após a amplificação dos fragmentos pela PCR, os alelos de cada locus são analisados em um sequenciador automático. Os primers utilizados na reação são marcados com fluorescência para que as regiões de microssatélites amplificadas sejam detectadas.

Figura 13.7. Co-dominância dos marcadores microssatélites. É possível separar os fenótipos

resultantes do homozigoto e do heterozigoto. Neste caso, os alelos apresentam uma diferença de dois

pares de base em relação aos tamanhos, devido à incorporação em uma das fitas de DNA de uma

repetição “CT”.

No interior do sequenciador ocorre uma espécie de eletroforese. Ao invés das amostras percorrerem um gel de poliacrilamida, elas são aplicadas em uma placa de 96 poços (cada poço contendo uma amostra individual). Para cada poço, existirá um capilar preenchido por um polímero específico. A eletroforese se inicia após a aplicação de um campo elétrico aos capilares que fará com que as moléculas de DNA migrem pelo seu interior até chegarem a uma “janela de detecção”. Os alelos menores migram mais rápido que os maiores e à medida que vão passando por esta “janela”, são estimulados por um laser de árgon e emitem a fluorescência. Uma série de lentes (espelhos) direciona e foca as emissões fluorescentes num espectrógrafo, onde serão separadas em função do comprimento de onda. Na medida em que os alelos marcados passam pelo laser, um computador compara o tamanho do alelo amplificado com um padrão para que seja determinado o seu tamanho. Ao final da reação, um arquivo de saída mostrará os picos de fluorescência contendo os tamanhos dos dois alelos de cada locus.

As grandes desvantagens ao utilizar estes marcadores são o alto consumo de tempo e dinheiro para encontrar regiões de repetições nucleotídicas in tandem no genoma e desenvolver novos primers que flanqueiem estes loci. Já existem caracterizados e descritos primers para R. pallescens (10 loci), R. ecuadoriensis (6 loci), R. prolixus (20 loci), R. robustus (10 loci), T. brasiliensis (6 loci), T. dimidiata (8 loci), T. infestans (19 loci) e T. pseudomaculata (6 loci; Harry et al. 1998, 2008a, 2008b, 2009, Anderson et al. 2002, García et al. 2004, Marcet et al. 2006, Fitzpatrick et al. 2009).

Análises moleculares vêm sendo utilizadas há mais de trinta anos com o objetivo de estudar relações intraespecíficas, mas para que se tenham estudos genealógicos ou genético populacionais mais refinados, torna-se necessária a utilização de marcadores altamente polimórficos, como os

microssatélites. A partir dos resultados desses marcadores codominantes (Figura 13.7), é possível estimar o fluxo gênico entre populações de forma mais apurada, e consequentemente, avaliar as capacidades de dispersão de triatomíneos.