Sequenciamento de DNA

Um exemplo de como estes marcadores podem ser úteis em monitoramentos de áreas tratadas com inseticidas é o trabalho feito por Richer et. al (2007), com populações de T. infestans dos Andes bolivianos (a 2700 metros de altitude). Sabe-se que em regiões bolivianas de baixa altitude (principalmente no Chaco), é comum encontrar casas tratadas com inseticidas sendo reinfestadas por populações silvestres ou recrudescentes de T. infestans. Contudo, não se sabia como as populações de altitude se comportavam, isto é, se as populações silvestres poderiam recolonizar as casas tratadas com inseticidas ou não. A realidade local era que duas das nove casas de um vilarejo dos Andes bolivianos, previamente tratadas, foram recolonizadas por T. infestans. Com o objetivo principal de se descobrir qual seria a fonte de reinfestação, foram analisados 111 espécimes provenientes de seis microrregiões, sendo cinco silvestres (dentre elas duas de transição, modificadas pelo ser humano) e uma domiciliar. Para a análise, foram utilizados 10 loci de microssatélites.

Os resultados levaram Richer et al. (2007) a concluir que os espécimes das três microrregiões silvestres não modificadas pelo ser humano eram representantes de uma população panmítica, que não transfere genes para as populações presentes nas duas microrregiões de transição, nem para a domiciliada. Da mesma forma, os indivíduos presentes nas duas microrregiões de transição não eram responsáveis pela reinfestação dos domicílios. Além dos dados moleculares, foi observado que em regiões de altitude T. infestans praticamente não voa. Como em regiões de altitude o ar é rarefeito e a temperatura é baixa, as populações de T. infestans só se locomovem por caminhadas pelas áreas não modificadas pelo ser humano. As regiões com pouca cobertura vegetal ou completamente desmatadas são desfavoráveis para sua sobrevivência e, portanto, populações de áreas silvestres não transitam até as áreas modificadas pelo ser humano. Desta forma, tanto as duas populações das regiões de transição quanto a população domiciliada estariam isoladas. A reinfestação dos domicílios foi, na verdade, consequência do recrudescimento de populações de insetos locais resistentes ao inseticida ou que tenham sobrevivido devido a deficiências técnicas do controle vetorial. Esta descoberta foi muito importante para o sistema de vigilância de vetores local, pois indicava que o tratamento com inseticidas das casas infestadas poderia ser eficaz.

A facilitação do acesso aos microssatélites pode ser de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de controle e vigilância dos vetores de Chagas. Talvez isto esteja mais próximo do que se imagina: até 2005, apenas em dois trabalhos publicados com triatomíneos tinham sido utilizados loci de microssatélites. Nos últimos cinco anos, o número de publicações com esses marcadores subiu para 10.

Sequenciamento de DNA

Esta técnica pode ser considerada como a mais informativa para estudos em sistemática molecular. Por utilizar como matéria-prima o conteúdo genético propriamente dito, os nucleotídeos, o sequenciamento de DNA é objetivo e aplicável em qualquer nível taxonômico, desde que se escolha a região gênica adequada.

No genoma animal é possível encontrar mais de 1011 pares de nucleotídeos, que podem constituir regiões mais conservadas entre as espécies (i.e. codificam proteínas essenciais à sobrevivência do organismo) ou menos conservadas. Existem dois genomas distintos: o nuclear (herdado do pai e da mãe) e o mitocondrial (de herança materna).

O genoma nuclear pode ser dividido, de maneira simples, em éxons e íntrons. Os éxons são regiões codificantes de aminoácidos e geralmente muito conservadas. A baixa taxa de mutação se deve ao eficiente mecanismo de reparo do núcleo (proofreading). Quando a DNA polimerase insere no genoma nuclear erroneamente um nucleotídeo e não faz a correção, existem proteínas de reparo que “revisam” esses nucleotídeos inseridos nos éxons e identificam os possíveis erros. Caso exista algum, exonucleases clivam a região complementar errada e a polimerase refaz de maneira correta o fragmento.

Nem todas as mutações resultarão na produção de um aminoácido diferente do original, pois o código genético é degenerado (redundante), ou seja, mais de um códon codifica um mesmo aminoácido (são

64 códons que codificam para 20 aminoácidos; Tabela 13.1). Dependendo da localização desta mutação, a substituição nucleotídica é sinônima. Na maioria das vezes, a substituições na 3a posição do códon não altera o aminoácido. Quando a mutação ocorre na 1a posição, a codificação de poucos aminoácidos não é alterada, enquanto que qualquer mutação de 2a posição de códon obrigatoriamente implicará na codificação de um novo aminoácido. Devido a estes fatores, as mutações ocorrem com maior frequência na 3a posição do códon, seguidas pelas de 1a e 2a posições.

Tabela 13.1 - Aminoácidos produzidos e respectivos códons.

1 mesmo havendo alteração na primeira base do códon, o aminoácido é inalterado; 3 mesmo havendo alteração na terceira base do códon, o aminoácido é inalterado; U - uracila; C - citosina; A - adenina; G- guanina; Phe - Fenilalanina; Leu - Leucina; Ile - Isoleucina; Met - Metionina; Val - Valina; Ser - Serina;

Pro - Prolina; Thr - Treonina; Ala - Alanina; Tyr - Tirosina; His - Histidina; Gla - Glutamina; Asn -

Asparagina; Lis - Lisina; Asp - Ácido aspártico; Glu - Ácido glutâmico; Cys - Cisteína; Trp - Triptofano;

Arg - Arginina; Gly - Glicina.

A maioria das mutações é desvantajosa, i.e. prejudica a aptidão do indivíduo. Essas mutações são removidas da população por seleção natural purificadora. As demais podem ser neutras (a maioria) ou vantajosas. As neutras não interferem na aptidão do organismo e sua frequência oscila, de geração em geração, na população. As vantajosas são selecionadas positivamente e aumentarão de frequência na população.

O sequenciamento de regiões dos éxons é utilizado, por exemplo, em estudos filogenéticos de espécies mais distantes. Os íntrons são as regiões não codificantes do genoma e, por sofrerem menor pressão seletiva (uma vez que suas sequências não codificam proteínas), são mais variáveis que os éxons. A análise de íntrons pode ser utilizada para taxonomia alfa, filogenia entre espécies próximas e até para genética de populações. Os espaçadores ribossomais internos ITS-1 e ITS-2, localizados entre as regiões 18S e 28S, também são bons marcadores para esses tipos de estudo, tendo sido utilizado para filogenia de espécies do gênero Panstrongylus (Marcilla et al. 2002), taxonomia alfa e filogenia dos complexos T. phyllosoma (Martínez et al. 2006) e T. dimidiata s.l. presentes no México (Tamay-Segovia et al. 2008, Herrera-Aguilar et al. 2009) e genética de populações de T. rubrovaria na Argentina, Brasil e Uruguai (Pacheco et al. 2007).

O genoma mitocondrial não apresenta íntrons e é formado por um único cromossomo circular, contendo genes codificadores de proteínas estruturais e funcionais responsáveis pela respiração celular. Por não possuir mecanismo de reparo do DNA, sua taxa de evolução é cerca de 10 vezes mais rápida do que a do genoma nuclear, tornando-o mais indicado para estudos populacionais e filogeográficos. O marcador mitocondrial mais utilizado em sistemática molecular de triatomíneos é o gene citocromo b (cyt b). A partir do sequenciamento de fragmentos do cyt b, pelo menos três complexos de espécies crípticas já foram descobertos, como T. brasiliensis s.l. (Monteiro et al. 2004, Almeida et al. 2008, Mendonça et al. 2009), R. robustus s.l. (Lyman et al. 1999, Monteiro et al. 2003, Pavan & Monteiro 2007) e T. rubida (Pfeiler et al. 2006). O cyt b também foi utilizado em estudos populacionais com as espécies T. infestans (Giordano et al. 2005), R. prolixus (Fitzpatrick et al. 2008) e T. dimidiata (Blandón-Naranjo et al. 2010). Neste último com T. dimidiata, os autores demonstraram que o cyt b é mais variável que o ITS-2. Todos os 58 espécimes provenientes de sete localidades da Costa Rica apresentaram a mesma sequência para o marcador nuclear, ao passo que o cyt b revelou um polimorfismo de 10,17% nas sequências produzidas. Os resultados indicam que o cyt b é o melhor marcador (em relação ao ITS-2) para estudos populacionais.

Existem ainda genes mitocondriais que são mais conservados, como aqueles codificantes das subunidades ribossomais 12S e 16S, e que podem ser úteis em estudos filogenéticos com espécies mais distantes. Estes marcadores já foram utilizados em estudos filogenéticos com espécies do gênero Triatoma (Garcia & Powell 1998), espécies pertencentes à Subfamília Triatominae (Hypša et al. 2002) ou ainda à Família Reduviidae (Weirauch & Munro 2009).

Com a exceção dos genes 12S e 16S, o uso dos demais genes mitocondriais em estudos filogenéticos para inferir relacionamentos distantes não é indicado (a menos que sejam excluídas da análise as

terceiras posições de códons), por haver eventos de homoplasia entre as sequências (Figura 13.8). Marcadores mitocondriais também não são aconselháveis em estudos sobre híbridos, devido a problemas de introgressão.

Figura 13.8. Evento de homoplasia. Este é um exemplo de duas sequências pertencentes a duas

espécies filogeneticamente distantes. Note que em dez nucleotídeos, seis diferem entre as sequências.

Desta maneira, não há como garantir que os nucleotídeos iguais são conseqüentes de mesma

ancestralidade ou apenas eventos de homoplasia. No caso do sítio marcado com o retângulo, o

nucleotídeo presente em ambas as sequências é o mesmo, entretanto suas origens são distintas pois

sofreram diferentes eventos mutacionais. Para obter a adenina nesta posição, a linhagem da sequência

1 sofreu três eventos de mutação e sua origem inicial era uma timina. Já a linhagem da sequência 2

sofreu apenas um único evento mutacional, alterando uma citosina por uma adenina.

Até a década de 70, pesquisadores utilizavam as proteínas como modelo para estudos evolutivos. As primeiras tentativas de sequenciar o DNA foram pouco promissoras, com a análise de pequenos fragmentos de 15 a 20 pares de base. Os cientistas só começaram a ter acesso diretamente a fragmentos maiores em 1977, após as descobertas de Maxam & Gilbert, e de Sanger et al. sobre novas técnicas de sequenciamento do DNA.

O método de Sanger et al. (1977) consiste na amplificação pela PCR de um fragmento de DNA utilizando um par de primers, e uma posterior reação, que inclui DNA polimerase, nucleotídeos (dinueleotídeos ou dTPs, formados por dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e nucleotídeos modificados e radioativamente marcados (dideóxinucleotídeos ou ddTPs, formados por ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP).

Para que os dTPs se unam para formar uma fita de DNA, cada nucleotídeo tem em sua extremidade 3’ um grupamento hidroxila (OH). No caso dos ddTPs, não existe este grupamento livre, logo nenhum

outro nucleotídeo poderá ser incorporado à fita (Figura 13.9a, b). A reação de sequenciamento de Sanger é separada em quatro tubos, sendo que em cada tubo se coloca os quatro dTPs, DNA polimerase, os primers e um dos quatro ddTPs (num tubo coloca-se o ddATP, em outro o ddCTP, e assim sucessivamente). Desta forma, ao fim da reação, existirão sequências desde o tamanho mínimo até o tamanho máximo do fragmento de DNA amplificado, sempre com um ddTP no fim da fita. Isto porque existem bilhões de cópias do fragmento amplificado e os ddTPs serão incorporados a fita com

os dTPs em todas as posições nucleotídicas do fragmento (Figura 13.9c). Estes produtos são submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida (a reação de cada tubo contendo os quatro ddTPs é colocada em poços distintos do gel) e analisados em autorradiografias. Os fragmentos com menor tamanho (i.e. regiões com menor quantidade de pares de bases amplificadas) passam mais rapidamente pela malha do gel e, portanto, migram para a porção inferior. Por conseguinte, os

fragmentos maiores migram mais lentamente, e ficam na região superior do gel (Figura 13.9d). A análise da sequência é feita manualmente e despende muito tempo.

Figura 13.9. (A) Fórmula estrutural dos dinucleotídeos (dNTPs; guanina, citosina, adenina e timina) ligados para a formação de uma fita de DNA. Note que suas estruturas são ligadas no grupamento

hidroxila (OH, mostrado com uma seta) em sua porção inferior, onde o hidrogênio (H) é liberado e se

liga ao fósforo (P) da estrutura de outro nucleotídeo. (B) Fórmula estrutural contendo dinucleotídeos

(guanina e citosina) e um dideoxinucleotídeo (ddTPs; adenina). Note que, ao contrário dos

dinucleotídeos, o dideóxinucleotídeo contém apenas um hidrogênio (H, mostrado com uma seta) em vez de um grupamento hidroxila em sua porção inferior. Desta forma, não há como outro nucleotídeo

ser incorporado à fita de DNA. (C) Durante a reação de sequenciamento, aleatoriamente são

incorporados dNTPs e ddTPs. Toda vez em que um ddTP é incorporado à fita (marcados com

asterisco), não há como incorporar um novo nucleotídeo. Ao fim da reação, serão obtidas fitas de DNA

contendo desde 1 pb até o tamanho máximo do fragmento. (D) Método de Sanger, no qual é aplicada

em cada poço de um gel de poliacrilamida uma reação contendo todos os dNTPs e apenas um dos

ddTPs (dATP, dTTP, dGTP ou dCTP). Ao fim da eletroforese e revelação do gel, é possível reconhecer

a sequência do fragmento, fazendo a leitura do menor fragmento (mais distante da origem, marcada

com um traço branco) até o maior fragmento (menor distância da origem). (E) Método de

seqüenciamento utilizando um sequenciador automático capilar. Por capilaridade, os menores

fragmentos chegam mais rapidamente ao laser ótico e suas fluorescências são “traduzidas” em

nucleotídeos por um computador.

O surgimento dos sequenciadores automáticos na década de 90 facilitou a análise de sequências de DNA, pois em apenas quatro horas era possível sequenciar fragmentos de até 1.500 bases (ou 1,5Kb). Nestes equipamentos são utilizados produtos de reação semelhantes aos de Sanger, só que em vez de colocar separadamente os quatro ddTPs radioativamente marcados, são colocados todos os ddTPs marcados com fluorescência num mesmo tubo. As amostras são aplicadas em placas de 96 poços e submetidas à eletroforese em capilares de um sequenciador automático (processo semelhante àquele de análise dos microssatélites). Conforme os fragmentos chegam à “janela de detecção”, um laser faz a leitura da fluorescência (cada nucleotídeo emite uma fluorescência distinta) e um programa de

computador “traduz” esse pico de fluorescência em um nucleotídeo (Figura 13.9e).

A automação do sequenciamento e o rápido avanço da tecnologia propiciaram maior acessibilidade a esta técnica e, consequentemente, o aumento de seu uso na sistemática molecular. A criação de bancos públicos de sequências na internet, como o GenBank, possibilitaram a comparação de dados gerados por laboratórios de todo o mundo e um maior acúmulo do conhecimento biológico.

As análises por sequenciamento de loci mitocondriais e nucleares foram muito importantes para descobertas de espécies crípticas e monitoramentos de áreas tratadas com inseticidas. Até 1992 existia a dúvida se R. robustus era uma espécie válida e diferente de R. prolixus, uma vez que não existia sequer um locus isoenzimático capaz de separá-las. Sob o ponto de vista epidemiológico, este seria o pior cenário possível, pois admitia a possibilidade de existência de livre fluxo gênico entre populações silvestres e domésticas. Um dos trabalhos mais relevantes para a resolução desse impasse taxonômico foi o de Lyman et al. (1999), cuja análise de sequências de um fragmento de um gene mitocondrial (cyt b) foi crucial para a constatação de que R. robustus era uma espécie distinta de R. prolixus. Esta descoberta sacramentava uma questão muito relevante: que o fluxo gênico entre populações silvestres e domésticas não era tão comum como se imaginava. R. robustus era estritamente silvestre e R. prolixus era uma espécie majoritariamente doméstica, existindo apenas poucas evidências sobre a existência de populações silvestres de R. prolixus na Venezuela. Mais tarde, a partir de um fragmento maior de cyt b, Monteiro et al. (2003) constataram que não só R. robustus era uma espécie válida, como compreendia um complexo de quatro espécies crípticas (chamadas de R.

robustus I, II, III e IV; Figura 13.10).

Figura 13.10. Distribuição geográfica de R. prolixus e das quatro espécies crípticas de R. robustus (I, II,

III e IV). Note que R. prolixus, R. robustus I e R. robustus IV são simpátricas na Venezuela, ao passo

que R. robustus II, III e IV são alopátricas por todas as suas áreas de distribuição.

A questão epidemiológica relevante que ainda restara, se R. prolixus também poderia ser encontrado no ambiente silvestre, só foi respondida em 2008, quando Fitzpatrick et al., utilizando o mesmo fragmento de cyt b que Monteiro et al. (2003), analisaram a diversidade nucleotídica das sequências de 551 espécimes de 34 populações de R. prolixus pertencentes a seis departamentos venezuelanos. Os autores puderam constatar que existiam populações de R. prolixus silvestres e que os eventos de colonização das casas por populações silvestres não eram frequentes. Contudo, análises populacionais mais apuradas em microescala geográfica (utilizando microssatélites) indicaram que em cinco ecótopos de dois departamentos da Venezuela existia o fluxo gênico entre as populações de palmeiras e as domiciliadas. Esta descoberta aponta que ações tradicionais de controle vetorial, como aplicação de inseticidas no interior das casas, serão ineficazes nestas regiões.

Outro complexo de espécies confirmado com o uso do sequenciamento foi o de T. brasiliensis s.l. Até 1956, acreditava-se na existência de três subespécies de Triatoma brasiliensis: T. brasiliensis brasiliensis Neiva, 1911, T. b. melanica Neiva & Lent, 1941 e T. b. macromelasoma Galvão, 1956. Em 1979 Lent & Wygodzinsky sinonimizaram as três subespécies como T. brasiliensis, considerando que as diferenças entre as três eram apenas cromáticas. Quase 20 anos depois, foi descrita uma nova forma cromática encontrada em Juazeiro, na Bahia. Os resultados de oito loci isoenzimáticos das quatro formas cromáticas de T. brasiliensis (Costa et al. 1997) indicavam que apenas àquela anteriormente nomeada de T. b. melanica apresentava valores de distância genética interespecíficos quando comparada com as demais formas cromáticas. Portanto, T. b. melanica deveria ser elevada à categoria de espécie.