Desenvolvimento de um estudo em sistemática molecular de triatomíneos

Apenas um estudo foi feito até o momento para separar espécies crípticas de triatomíneos com base na metodologia de PCR Multiplex (Pavan & Monteiro 2007). Neste estudo, foi desenvolvida uma metodologia capaz de separar R. prolixus, R. robustus I e o grupo R. robustus II-IV. Isto é importante, pois R. prolixus é morfologicamente indistinguível das quatro espécies de R. robustus s.l. E para complicar ainda mais, R. prolixus, R. robustus I e R. robustus IV ocorrem em simpatria em

determinadas regiões da Venezuela (Figura 13.10).

O método consiste em poucas etapas metodológicas de baixo custo para se identificar corretamente as espécies. É necessário apenas se extrair o DNA do espécime, fazer uma reação de PCR e analisar o produto em uma eletroforese em gel de agarose. Na PCR, ao invés de se utilizar apenas um par de primers que flanqueiem uma mesma região do gene mitocondrial cyt b das quatro espécies, utilizam-se primers espécie-específicos que amplificam fragmentos de tamanhos distintos (R. robustus II-IV -

239pb; R. prolixus - 285pb; e R. robustus I - 349pb; Figura 13.11).

Figura 13.11. Multiplex para separar R. prolixus e as espécies de R. robustus. Para que fossem

gerados fragmentos de tamanhos distintos, foram desenhados um primer F universal (que se anela em

uma região do DNA conservada em todas as espécies) e primers R espécies-específicos (R1, R2 e R3), que são complementares às sequências nucleotídicas contidas apenas naquela(s) espécie(s).

Neste caso, o fragmento F-R1 de 239pb será amplificado apenas em R. robustus II, III e IV; o

fragmento F-R2 de 285pb apenas em R. prolixus; e o F-R3 de 349pb será amplificado apenas em R.

robustus I. Após a PCR, as espécies poderão ser facilmente identificadas por visualização de uma

eletroforese em gel de agarose de acordo com o tamanho das bandas produzidas. Não há qualquer

problema em não ser possível distinguir bandas de R. robustus II, III e IV uma vez que, por serem

alopátricas, as localidades geográficas onde foram encontradas serão suficientes para que as espécies

sejam separadas.

Desenvolvimento de um estudo em sistemática molecular de triatomíneos Qualquer estudo sobre sistemática molecular de triatomíneos deve começar com a elaboração de uma pergunta bem definida e cientificamente relevante. Em seguida, deve-se pensar em qual desenho experimental (que marcador[es], estratégia amostral e métodos analíticos utilizar) melhor responderá sua pergunta. Além disso, é aconselhável conhecer um pouco sobre a ecologia e distribuição geográfica da espécie a ser estudada para que a busca pelos insetos seja feita adequadamente. Onde são encontrados? Nas copas de palmeiras? Em ocos de árvores? Embaixo de pedras? Dentro de casas?

Para isso, é recomendável que se faça um bom levantamento bibliográfico para determinar o que já foi descoberto, o que ainda está por ser e o que é ainda controverso. Abaixo, temos alguns exemplos de perguntas relacionadas à sistemática de triatomíneos e ao controle vetorial. A melhor técnica molecular a utilizar e abrangência geográfica necessária para cada tipo de trabalho são também apresentadas

(Tabela 13.2).

Tabela 13.2 - Guia de auxílio para desenho experimental, envolvendo uma pergunta científica

relacionada à sistemática molecular de triatomíneos.

Pergunta Abrangência Locais de Número Técnica a ser Marcador Tipo de científica geográfica amostragem mínimo de empregada molecular análise

indivíduos

coletados

1) Será que Macroescala Por toda a Três indivíduos Sequênciamento cyt b (ou COI) Filogeográfic esta espécie distribuição por localidade; de DNA. e ITS-2 nominal geográfica 30 indivíduos representa um conhecida da de cada complexo de espécie. suposta espécies espécie. crípticas?

2) Qual o grau Macroescala Um ou mais De um a cinco Sequenciamento cyt b, COI, Filogenética

de pontos dentro indivíduos por de DNA 12S, 16S e relacionamento da localidade por ITS-2 para entre as distribuição espécie. especies mais espécies geográfica Escolher proximamante estudadas? conhecida de criteriosamente relacionadas.

cada espécie um (ou mais) 18S e 28S

outgroups para as

menos

relacionadas.

3) A qual _ Pontual Um Sequencia- cyt b e ITS-2 código de espécie este mento de DNA barras de indivíduo ou PCR DNA / pertence? Multiplex Comparação

do tamanho

das bandas

do multiplex

4) A Microescala Casas Trinta Microssatélites Análise de no Populaciona reinfestação infestadas, indivíduos por mínimo 10 das casas é peridomicílios localidade. loci feita por e ambientes Amostrar antes populações silvestres de aplicar silvestres ou próximos às inseticidas nas recrudes- casas casas e de centes? seis em seis

meses após a

aplicação por,

no mínimo, um

ano.

5) As Microescala Casa(s) com Cinquenta Microssatélites Análise de, no Populaciona populações populações indivíduos por mínimo, 10 resistentes à resistentes e localidade. loci inseticidas casas Amostrar de estão cruzando adjacentes. seis em seis com meses por, no populações mínimo, dois não anos. resistentes?