Pcr-Rflp

Figura 13.4. A técnica de RAPD é considerada dominante, pois não há como diferenciar os fenótipos

de bandas do homozigoto dominante (++) e do heterozigoto (+-). O homozigoto recessivo (--) não

apresentará nenhuma banda. Nos géis (fenótipo), à esquerda o padrão de tamanho das bandas e à

direita o fragmento.

Devido à subjetividade da análise e aos problemas com a reprodutibilidade dos resultados, periódicos científicos conceituados desencorajam a submissão de artigos nos quais se tenha utilizado exclusivamente a técnica de RAPD. Com a diminuição dos custos associados ao sequenciamento de DNA, uma técnica muito mais informativa, o RAPD caiu em desuso.

Se as premissas inerentes à técnica de RAPD forem respeitadas e os problemas de reprodutibilidade minimizados, esta técnica pode ser útil na determinação do limite entre espécies filogeneticamente próximas (estudos de taxonomia alfa). O trabalho de Jaramillo et al. (2001) é um bom exemplo da aplicabilidade do RAPD na taxonomia alfa de triatomíneos. Neste estudo os autores constataram que as populações silvestres de Rhodnius da região de Tolima, na Colômbia, antes identificadas como R. prolixus, representavam na realidade uma espécie nova, R. colombiensis.

PCR-RFLP

O polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição, ou RFLP (sua sigla em inglês), é uma técnica relativamente simples e de baixo custo que, ao contrário do RAPD, consiste na amplificação pela PCR de uma região do DNA conhecida e subsequente corte. Utilizando-se um par de primers complementares a sítios específicos do DNA, amplifica-se a região-alvo. Posteriormente, as cópias desta região-alvo são digeridas por enzimas extraídas de bactérias chamadas endonucleases de restrição. Essas endonucleases reconhecem e cortam sítios específicos (normalmente de quatro a seis pares de base) da região-alvo, gerando fragmentos que podem ser separados por tamanho após eletroforese em gel de agarose (ou poliacrilamida). Milhares de endonucleases de restrição já foram isoladas e maiores informações a respeito destas enzimas podem ser encontradas na base de dados REBASE. Mas como é possível uma enzima digerir regiões homólogas do DNA de diferentes espécies e gerar fragmentos de tamanhos distintos? Isto se deve aos eventos de mutação que podem ocorrer

nos sítios de clivagem das enzimas de restrição. (Figura 13.5).