Práticas de Microbiologia (2ª edição)
Métodos de controle do crescimento microbiano
O crescimento celular pode ser controlado por diferentes métodos. O
Quadro 3.1 resume os principais métodos químicos e físicos usados para controle do crescimento dos microrganismos.
Existe uma variação muito grande em termos de sensibilidade entre os microrganismos e os endósporos de procariotos aos métodos físicos e
químicos de controle descritos neste capítulo. A Figura 3.4 detalha, em ordem decrescente de resistência a esses agentes, os príons, os microrganismos e os endósporos. Os príons são uma proteína simples. Não são considerados seres vivos porque não têm genoma, mas são infecciosos e causadores de sérios distúrbios, por isso são alvos dos processos de desinfecção e esterilização. São resistentes a radiações ionizantes e ultravioleta que degradam os ácidos nucleicos, óxido de etileno, proteases e também procedimentos tradicionais de esterilização. Só podem ser inativados com solventes como benzeno, hipoclorito sódico (20°C, 1 hora) e hidróxido sódico 2 N.
Quadro 3.1 Métodos físicos e químicos de controle dos microrganismos.
Métodos físicos
■ Temperatura
■ Radiação
■ Filtração
■ Dessecação/desidratação
■ Remoção de O2
■ Vibração ultrassônica
Métodos químicos
■ Desinfetantes
■ Antissépticos
■ Preservativos usados em alimentos
Figura 3.4 Crescimento dos microrganismos por ordem decrescente de resistência.
Métodos físicos
Os métodos físicos são muito utilizados para promover a descontaminação, a desinfecção e a esterilização. Os métodos frequentemente empregados para atingir esses objetivos usam como princípio o calor, a radiação e a filtração.
O Quadro 3.2 enumera os principais deles e suas aplicações.
▶ Temperatura
■ Calor úmido e seco
O calor é um dos mais importantes métodos usados para controle do crescimento e para eliminar os microrganismos. É o principal método de eleição por ser seguro, de baixo custo e não formar produtos tóxicos. Acima da temperatura ideal de crescimento, o calor vai promover a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular e
morte (Figura 3.5).
O calor seco elimina os microrganismos também por processo de oxidação. O calor úmido na forma de vapor tem maior poder de penetração e elimina as formas vegetativas dos procariotos, vírus e fungos e seus esporos. A morte pelo calor é uma função exponencial que ocorre à medida que a temperatura se eleva. O tempo de redução decimal (valor D) é o tempo de exposição necessário a uma determinada temperatura para reduzir a um décimo o número original de microrganismos viáveis (para matar 90% deles). Quanto maior a temperatura, menor será o valor D (↑ temperatura – ↓ D). Deste modo, são necessárias rápidas exposições a temperaturas altas
para uma grande redução no número de microrganismos viáveis. A Figura
3.6 mostra o valor D para temperaturas diferentes em uma mesma população bacteriana.
Quadro 3.2 Métodos físicos de controle do crescimento.
Agente Método Mecanismo de ação Uso
Calor Autoclave Desnaturação de Vidrarias, meios de cultura,
proteínas roupas de cama
hospitalares,
bandagens, curativos,
artigos hospitalares
termorresistentes
Pasteurização Desnaturação de Alimentos: cerveja, leite,
proteínas queijos etc.
Estufa Desnaturação de Instrumentos metálicos,
proteínas e oxidação pós, óleos e vidrarias
Flambagem Desnaturação de Esterilização de alças e
proteínas e oxidação agulhas microbiológicas
Apertização Desnaturação de Alimentos
proteínas
Baixas Refrigeração Diminuição do Preservação de alimentos
temperaturas metabolismo, taxa de
crescimento e
atividade enzimática
Congelamento Diminuição do Preservação de alimentos
metabolismo, taxa de
crescimento e
atividade enzimática,
formação de cristais
Radiação Ultravioleta Formação de dímeros de Controle microbiológico
timina no DNA em superfícies, uxos
laminares
Ionizante Formação de radicais Esterilização de plásticos,
livres que dani cam produtos farmacêuticos
moléculas e ácidos e preservação de
nucleicos alimentos
Filtração Filtros para ar HEPA Retenção de partículas Controle microbiológico
maiores que 0,3 mm em uxos laminares,
salas de cirurgia e
enfermarias especiais.
Filtros para Retenção de partículas Esterilização de meios de
líquidos maiores que 0,25 mm cultura e outras
(procariotos) substâncias termolábeis
Dessecação/ Defumação Remoção da água por Conservação de carnes
desidratação calor
Lio lização Remoção da água por Preservação de culturas e
congelamento rápido, alimentos
com nitrogênio líquido,
a vácuo. Água
congelada passa por
sublimação
Vibração Limpador Elimina os Limpeza de equipamentos,
ultrassônica ultrassônico microrganismos aparelhos
através de vibrações odontológicos,
sonoras de alta tratamento de esgoto
potência
Remoção de Empacotamento a Remoção do oxigênio. Preservação de alimentos
oxigênio vácuo Usado na indústria de
alimentos para leite
em pó, café e
enlatados. Elimina
microrganismos
aeróbios
HEPA: high-efficiency particulate arrestance ( ltro de ar com alta e ciência na separação de
partículas).
Figura 3.5 Efeito do calor nas proteínas, mostrando sua desnaturação.
Todos os microrganismos são sensíveis ao calor; entretanto, os endósporos bacterianos, em razão de características peculiares na sua estrutura, são mais resistentes. São estruturas bastante desidratadas, com 10 a 30% de água no protoplasma, em contraste com as células vegetativas que possuem 70%. Essa desidratação ocorre durante o processo de esporulação. Esse baixo teor de água reduz a quantidade de água associada a proteínas do core, estabilizando-as e evitando a desnaturação térmica. Os endósporos bacterianos acumulam minerais como Ca2+, Mg2+, Mn2+, os quais estão localizados no core. Esta mineralização está associada ao baixo teor de água. Outros fatores de proteção são as pequenas proteínas ácidas solúveis (PPAS), um grupo de proteínas que se liga ao DNA, protegendo-o, e a síntese de ácido dipicolínico, o qual forma uma estrutura semelhante a um gel. Em suma, os principais alvos do calor úmido identificados são as PPAS, a mineralização e a desidratação. Por outro lado, o calor seco atua mais no DNA causando perdas de bases como ocorre na depurinização e nas mutações. O papel do ácido dipicolínico é menos definido, mas mutações nos genes que codificam esse composto aumentam o conteúdo de água do endósporo e, em consequência, diminuem sua resistência ao calor.
Figura 3.6 A. Efeito da temperatura em uma população de bactérias. O tempo de redução decimal (D) foi obtido em três temperaturas diferentes. Na temperatura de 70°C, o valor de D é de 3 minutos; a 60°C, de 12 minutos; e a 50°C, de 42 minutos. B. Tempo de redução decimal para um procarioto mesófilo e outro termófilo. Um mesófilo exposto a 110°C por menos de 20 segundos resultou na redução decimal (a), enquanto para o termófilo a mesma temperatura levou 10 minutos para atingir a redução decimal (b).
Por causa dessas características, para os endósporos serem destruídos, são necessárias temperaturas acima de 100°C, com tempos variáveis que dependem da espécie de procarioto. As formas vegetativas das bactérias são mais facilmente eliminadas (60 a 70°C). Os esporos de fungos são forma de reprodução e de dispersão das espécies. Podem ser eliminados em temperaturas que variam de 60 a 70°C. As formas vegetativas dos fungos são destruídas na faixa de 50 a 60°C.
Na temperatura de 100°C, por exemplo, os endósporos do Clostridium botulinum levam 5,5 horas para serem eliminados, ao passo que na temperatura de 121°C bastam 4 a 5 minutos.
Métodos que empregam o calor úmido
▶ Autoclave. Equipamento que emprega o vapor d’água sob pressão que produz a temperatura mínima de 121°C. Quanto maior a pressão da autoclave, maior a temperatura. Quando o vapor em fluxo livre, a 100°C, é colocado sob uma pressão de 1 atmosfera acima da pressão do nível do mar, isto é, cerca de 15 libras de pressão por polegada quadrada (psi), a temperatura sobe para 121°C. Aumentando a pressão para 20 psi, a temperatura sobe para 126°C. Existem diferentes tipos de autoclaves, as quais podem ser horizontais, verticais, elétricas ou a gás. Uma grande variedade de modelos e tamanhos de autoclave existem no mercado, de acordo com os objetivos. O equipamento é constituído por um recipiente metálico com tampa hermeticamente fechada e válvulas de segurança e ajuste de pressão e um manômetro para controle da temperatura.
Esse método destrói as formas vegetativas e esporuladas de procariotos e fungos, promovendo a esterilização. Já os príons, por serem agentes extremamente resistentes aos métodos de desinfecção e esterilização utilizados habitualmente, são uma exceção. Na autoclave, o mínimo recomendado para os príons é 134°C por 1 hora para eliminar a maioria dos príons. O príon 362 K do scrapie pode ser eliminado por autoclavação por 15 minutos/130°C. A utilização de formaldeído em concentração de 10 minutos reduz o título de príons em 30 vezes, sendo um adjuvante interessante no tratamento térmico. Entretanto, a legislação brasileira proíbe o uso de formaldeído e de paraformaldeído para desinfecção e esterilização (Resolução no 91, de 28 de novembro de 2008, da Anvisa).
Segundo recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) e da União Europeia (UE), os tratamentos que asseguram completam inativação dos príons, rotineiramente usados desde 1995 no centro de esterilização de materiais em hospitais, incluem:
■ Tratamento físico: calor úmido no tempo de 20 minutos de exposição à
temperatura de 133°C, à pressão de 3 bars (1 bar = 14 psi)
■ Tratamento químico: 1 hora na presença de uma solução concentrada de
hidróxido de sódio
■ Tratamento químico: 1 hora na presença de uma solução concentrada de
hipoclorito de sódio a 50%.
A autoclavação é um método muito usado em laboratórios, hospitais,
clínicas odontológicas (Figura 3.7A e B) e de estética, entre outras similares. O ar normalmente dificulta uma esterilização eficaz, impedindo o contato direto do agente esterilizante (vapor) com o material, o que torna menos eficiente sua penetração. Por esse motivo as autoclaves possuem mecanismos para remover o ar, o que pode ser obtido por gravidade ou por vácuo. Entretanto, autoclaves sem sistemas de remoção do vapor também são muito usadas, por exemplo em laboratórios de pesquisa. Neste caso, o material pode ser seco posteriormente em outro tipo de equipamento, como, por exemplo, estufas.
Os tipos de autoclaves são:
■ Autoclave gravitacional. O ar é removido por gravidade e sai por uma
válvula na parte inferior da câmera à medida que o vapor é injetado. O
aquecimento é feito de fora para dentro. É um processo lento e que
permite a permanência de ar residual. Após a autoclavação, o material é
seco na própria autoclave (Figura 3.8)
■ Autoclave com sistema de vácuo. O ar é previamente removido por
vácuo. Quando o vapor entra, penetra instantaneamente os artigos na
ausência de ar residual. O vácuo pode ser feito através de uma bomba
de sucção em um único pulso (alto vácuo) ou por meio de injeções e
retiradas rápidas do vapor (alto vácuo com ciclo pulsátil). Este último
sistema é o mais eficaz porque é difícil obter níveis adequados de vácuo
em um único pulso.
Artigos, líquidos, meios de cultura, vidrarias, curativos e outros materiais termorresistentes devem ser esterilizados por esse método, que é o mais eficaz. Em hospitais, os artigos são colocados em invólucros especiais para esterilização, como papel grau cirúrgico, papel kraft com pH 5 a 8, filme de poliamida entre 50 e 100 micra de espessura. O tempo de esterilização depende do tipo e da quantidade do material. Por exemplo, para grandes pacotes de roupa, o tempo de processamento é de 60 minutos.
Não deve ser usado papel-alumínio, por ser resistente ao calor. A Figura 3.9 ilustra a central de material esterilizado do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
Figura 3.7 A. Autoclave usada em clínica odontológica. B. Autoclave hospitalar. O material é seco posteriormente.
Figura 3.8 Autoclave hospitalar gravitacional com a porta fechada (A) e com a porta aberta (B), do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
O monitoramento da eficiência da autoclavação pode ser realizado por testes semanais com o uso de um indicador biológico (Bacillus stearothermophilus) em fitas termossensíveis ou em culturas (ver adiante tópico Testes de validação, indicadores químicos e indicadores biológicos). Podem também ser usadas fitas de papel crepe como indicador da eficácia da esterilização para monitorar a temperatura da autoclave ou fitas de papel
de filtro 3M (Figura 3.10). Devem-se registrar controles da pressão interna e externa das câmeras, da pressão negativa e temperatura a cada ciclo de esterilização, da temperatura interna e os defeitos a cada esterilização.
Figura 3.9 Armazenamento de material esterilizado na autoclave (calor úmido) ou óxido de etileno de centro cirúrgico do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
▶ Apertização. Trata-se de um método muito utilizado na indústria para preservar alimentos da contaminação microbiana em embalagens de lata, vidro e até embalagens flexíveis. Os alimentos apertizados mais comuns são as conservas vegetais (ervilha, milho, tomate, feijão, cogumelo, palmito, cenoura, aspargo, alcachofra), frutas enlatadas ou compotas (abacaxi, pêssego, figo, pera), pescado (sardinha, atum, marisco), carnes (bovina, fiambrado, frango), sopas e derivados de frutas (geleias e doces em massa). O processamento ocorre em temperaturas de 115 a 125ºC, sob pressão de vapor, em autoclave, de modo que os alimentos não percam sua qualidade.
Figura 3.10 Caixa de ponteiras para micropipetas vedada com fita termossensível, antes da autoclavação (A) e depois da autoclavação (B), indicando que houve esterilização pelo aparecimento das marcas negras na fita termossensível 3M comercial (C). Após autoclavação, se o aparelho estiver com a temperatura adequada, a faixa amarelo-clara central fica com marcas pretas.
▶ Pasteurização. Método muito usado na indústria de alimentos que só podem ser submetidos ao calor em condições controladas para não desnaturar os nutrientes. O nome é uma homenagem a Louis Pasteur, por ter desenvolvido um método que empregava aquecimento leve prevenindo a deterioração da cerveja e do vinho sem alterar o sabor dos produtos. Na pasteurização ocorre redução no número dos microrganismos pela exposição breve a uma temperatura relativamente alta. Não esteriliza. Existem basicamente três tipos:
■ Ultra-alta temperatura (UHT, ultra-high temperature) → (141°C/2
segundos)
■ Alta temperatura (HTST, high temperature, short time) → (72°C/15
segundos)
■ Baixa temperatura (LTH, low temperature heating) → (63°C/30
minutos).
Como exemplos de alimentos pasteurizados podemos citar o leite e a cerveja. No leite podem aparecer bactérias patogênicas como a Brucella, agente etiológico da brucelose; a Coxiella burnetii, que causa uma pneumonia atípica; a Mycobacterium bovis, agente da tuberculose em bovinos; e a Salmonella. A indústria de laticínios emprega rotineiramente um teste para determinar se o produto foi pasteurizado, que é o teste da fosfatase alcalina, uma enzima presente no leite que é inativada após a pasteurização. Para o leite, é muito empregado o método de pasteurização UHT (leite longa vida), que lhe permite ser armazenado sem refrigeração. O método HTST mata os patógenos e diminui as contagens de microrganismos do leite, mas este deve ser conservado sob refrigeração. A pasteurização, portanto, aumenta o tempo para consumo do produto (tempo
de prateleira) e torna-o seguro. A Figura 3.11 mostra um pasteurizador de uma indústria de laticínios.
▶ Água em ebulição. É o vapor d’água livre (100°C/20 minutos), que destrói as formas vegetativas e alguns endósporos (dependendo do tempo usado e da espécie de bactéria). A maioria dos endósporos e alguns vírus, como o da hepatite, podem sobreviver 30 minutos na fervura. Não é um método de esterilização, apenas permite o controle do crescimento microbiano.
Figura 3.11 Pasteurizador para alimentos.
Métodos que empregam o calor seco
▶ Estufa e fornos. Têm menor poder de penetração que o calor úmido e usam temperaturas e tempos maiores. A característica comum entre os métodos é a ausência de umidade, o que torna o processo menos eficiente e demorado.
Na literatura são citados diferentes tempos e temperaturas necessários para esterilização. Alguns autores recomendam 2 horas a 170°C para inativação do vírus da hepatite C em artigos contaminados com esse microrganismo. Outros recomendam três tempos-temperaturas gerais: 180°C/30 minutos, 170°C/60 minutos ou 160°C/2 horas. Neste capítulo vamos empregar as indicações de uso do Ministério da Saúde, que recomenda o uso de estufas e fornos para artigos e materiais que não podem ser autoclavados, como óleos, pós, caixas de instrumentos cirúrgicos e
metais. O Quadro 3.3 resume estas indicações de uso contidas no manual Processamento de artigos e superfícies em estabelecimentos de saúde, do Ministério da Saúde (1994).
Na estufa, o material é aquecido por condução e por convecção. O calor seco não é corrosivo para objetos metálicos e afiados e não desgasta a
superfície dos vidros (Figura 3.12).
Os materiais e artigos a serem esterilizados por esse método podem ser enrolados em material adequado ao uso em autoclaves, como papel grau cirúrgico, papel crepado e poliamina, entre outros, ou colocados diretamente em caixa de metal para instrumental ou outro material compatível com a autoclave.
Quadro 3.3 Tempo e temperatura para esterilização de artigos e substâncias segundo recomendações do Ministério da Saúde.
Materiais Temperatura (°C) Tempo (minutos)
Aço inoxidável e outros metais* 160 120
170 60
Vaselina líquida e outros óleos (altura 160 120
de 0,5 cm)
Pós (100 g) 160 120
*Para metais, é necessário validar o processo.
Figura 3.12 Estufa de secagem de material e esterilização. (Foto: Instituto de Microbiologia Paulo de Góes.)
Para monitorar, devem ser realizados testes semanais usando o Bacillus
subtilis (ver adiante Quadro 3.6) e usadas fitas termossensíveis apropriadas para o calor seco.
▶ Flambagem. Ocorre combustão completa dos microrganismos em alças e agulhas microbiológicas, as quais são aquecidas diretamente na
chama do bico de Bunsen até ficarem rubras (Figura 3.13).
▶ Incineração. É a combustão completa para descontaminação de material hospitalar de uso descartável (luvas, material plástico) e lixo contaminado em geral, tanto hospitalar como de laboratórios. Animais de experimentação, quando do descarte, também devem ser incinerados.
■ Baixas temperaturas
A baixa temperatura é um método de controle dos microrganismos porque causa diminuição na taxa de crescimento e na atividade enzimática. Entretanto, pode não causar a morte celular. Os microrganismos patogênicos são geralmente mesófilos (não crescem a 5°C), embora existam exceções como certas amostras de Clostridium botulinum, que crescem a 5°C.
Métodos que empregam baixa temperatura
O efeito das baixas temperaturas sobre os microrganismos depende do microrganismo e da intensidade da aplicação.
Figura 3.13 A. Alça e agulha de inoculação microbiológica. B. Alça sendo flambada até ficar rubra na chama do bico de Bunsen. (Foto: Instituto de Microbiologia Paulo de Góes.)
▶ Refrigeração. Nos refrigeradores comuns (2 a 7°C) a taxa metabólica da maioria dos microrganismos é tão reduzida que eles não podem se reproduzir. A refrigeração comum tem mais efeito bacteriostático; entretanto, microrganismos psicrófilos, como as pseudômonas, crescem lentamente em baixas temperaturas, alterando o sabor dos alimentos após algum tempo. O método é usado para a preservação de alimentos durante período limitado de tempo.
▶ Congelamento. Usado para preservar alimentos nas residências e na indústria alimentícia. O congelamento rápido tende a tornar os micróbios dormentes, mas não necessariamente os mata. O congelamento lento faz com que cristais de gelo se formem e cresçam, rompendo as estruturas celular e molecular das bactérias. Em alimentos há a possibilidade de sobrevivência de microrganismos. O congelamento de alimentos é feito em torno de 17 a 18°C abaixo de zero, o que retarda o crescimento das bactérias, impedindo a deterioração dos alimentos. Os freezers domésticos, com temperatura entre –14 e –17°C, possibilitam o emprego desse método. Já no setor industrial, o congelamento pode ser feito muito rapidamente, porque é possível obter temperaturas bem mais baixas (–45°C, –80°C, – 195°C).
Quanto mais rápido for o congelamento, melhor, pois assim se formam menos cristais. Estes causam uma ruptura celular que gera forte exsudação, havendo grande perda de nutrientes e peso.
▶ Radiação
As radiações constituem um método eficaz para reduzir ou eliminar os microrganismos. Existem vários tipos de radiações eletromagnéticas, como os raios X e outras radiações ionizantes, ultravioleta, feixes de elétrons e micro-ondas.
■ Radiação ionizante
Raios X com comprimento de onda de 0,1 a 40 nm e radiação gama (γ) com comprimentos ainda menores são radiações ionizantes porque possuem energia para retirada dos elétrons das moléculas, ionizando-as (formando íons). Um “rad” (radiation absorbed dose) é uma unidade antiga de energia de radiação absorvida por grama de tecido (100 erg/g). A unidade SI (Sistema Internacional de Unidades) é o “gray” (1 Gy = 100 rad), um milirrad é um milésimo do rad. Muitos procariotos são mortos pela absorção de 0,3 a 0,4 milirrad de radiação, e os poliovírus são inativados por 3,8 milirrads. Os seres humanos não podem receber mais do que 50 rads.
A principal molécula ionizada é a água, com a formação de radicais tóxicos que levam a perda de elétrons por várias moléculas e formação de radicais livres. A ação mais prejudicial é no DNA, mas atinge outras moléculas como proteínas, levando à morte celular:
H2O → H2O+ + e–
H O+ + H O → H O+ + OH• (radical hidroxila) 2 2 3
e– + H – 2 O → OH + H• (radical hidrido)
Existem várias fontes de radiação, incluindo aparelhos de raios X, tubos de raios catódicos e nuclídeos radioativos. Essas fontes produzem raios X ou raios γ. As principais fontes de radiação gama-ionizante comercial são o cobalto 60 e o césio 137.
A radiação é rotineiramente usada para processos de esterilização e descontaminação de suprimentos médicos e de produtos alimentícios. Nos EUA, a Food and Drug Administration aprovou o uso de radiação para suprimentos médicos, materiais descartáveis de laboratório e em tecidos para enxertos. A radiação gama é mais usada para a esterilização de materiais plásticos, suprimentos médicos, materiais descartáveis e alimentos termolábeis (em que não permanecem resíduos de radiação), como hambúrgueres e frango. A radiação ionizante é extremamente perigosa, com alto poder de penetração, por isso exige normas técnicas que regulamentem seu uso, o qual requer supervisão da Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN).
Por ser um método de alto custo, no Brasil prevalece nos hospitais a esterilização por óxido de etileno (ver adiante tópico Métodos químicos).
■ Radiação ultravioleta
Essa radiação não ionizante tem sua atividade microbicida na faixa de comprimento de onda 240 a 280 nm, sendo 260 nm o comprimento mais efetivo para eliminar microrganismos.
É um tipo de radiação mutagênica, que leva à formação de dímeros de timina, os quais impedem a ação da DNA polimerase. Tem ação microbicida mas baixo poder de penetração, por isso seu uso é recomendado apenas em superfícies (não atravessa sólidos, muito pouco em líquidos). É muito eficaz na inativação dos vírus e perde sua eficiência na presença de matéria orgânica. Em hospitais, sua ação é limitada à destruição dos microrganismos no ar e em superfícies. Estudos realizados nos EUA demonstraram que a luz UV nas salas cirúrgicas diminuiu as taxas de infecção de 3,8 para 2,9% nas infecções pós-operatórias. Entretanto, seu uso em outros locais, como quartos de isolamento, não é recomendado, por provocar eritemas e ceratoconjuntivite em pacientes. É muito usado em laboratórios de pesquisa e clínicos e em salas de cirurgia, nos fluxos
laminares ou superfícies em geral (Figura 3.14). A luz UV é usada para desinfetar vacinas e outros produtos médicos. A luz solar possui radiação ultravioleta, mas em comprimentos de onda mais curtos; ademais, a radiação mais efetiva para eliminar os procariotos é filtrada pela camada de ozônio.
■ Micro-ondas
É a radiação com os maiores comprimentos de onda do espectro eletromagnético (1 nm a 1 m). As frequências dos fornos de micro-ondas são sincronizadas para combinar níveis de energia em moléculas de água. No estado líquido, as moléculas de água absorvem rapidamente a energia do micro-ondas, liberando-a para o alimento na forma de calor. Materiais que não contêm água permanecem frios (papel, porcelana, plástico), enquanto os que a contêm ficam quentes. A condução de energia em metais produz descargas e faíscas, o que impede seu uso em micro-ondas. Os micro-ondas caseiros não podem ser usados para esterilizar. Para tanto, existem fornos capazes de esterilizar meios de culturas, como o sistema MicroClave®, que permite a esterilização rápida de meio e soluções microbiológicas (pode esterilizar 1,2 ℓ de meio em 6,5 minutos).
Figura 3.14 Câmera de fluxo laminar com luz ultravioleta para desinfecção de superfície, muito usada em microbiologia. (Foto: Instituto de Microbiologia Paulo de Góes.)
▶ Filtração
A filtração pode ser usada para esterilizar gases e líquidos sensíveis ao calor. Os filtros são compostos por grande variedade de materiais sintéticos, como celulose, acetato, amianto, policarbonato, Teflon® ou outro material sintético com poros de 0,2 a 0,25 μm, que impedem a passagem de bactérias, menos Mycoplasma sp. Entretanto, existem diferentes tamanhos
de poros de acordo com o tipo de filtragem que se deseja (Quadro 3.4). A
Figura 3.15 mostra a filtração de um meio de cultura termolábil, usando filtros metálicos com sistemas de membrana esterilizante Seitz e MilliporeTM.
O uso da filtração é recomendado para materiais termolábeis em solução e na descontaminação do ar, em fluxos laminares e sistemas de ventilação nos quais o controle microbiológico seja especialmente importante, como salas de cirurgias e enfermarias de tuberculosos e unidades de queimados. Nesse caso, o ar é passado em filtros HEPA que removem todos os microrganismos maiores que 0,3 μm. Para verificar a quantidade de microrganismos em um ambiente, usa-se o amostrador de ar
(Figura 3.16). Existem vários modelos – que devem estar de acordo com a Resolução da Anvisa no 9, de 16 de janeiro de 2003 – destinados a verificar o grau de contaminação em ares de interior e que podem ter de 1 até 6 ciclos (número de placas de Petri). Pela legislação é permitido até 750 unidades formadas de colônias (UFC)/m3 em relação a fungos. Para
bactérias não existe nenhuma padronização. A Figura 3.17 mostra resultado obtido com o mostrador de ar Air Ideal® de 1 ciclo (1 placa de Petri).
Quadro 3.4 Tamanhos de poros de membranas filtrantes em relação aos microrganismos que podem atravessá-las.
Tamanho do poro (mm) Partículas ltráveis
5 Leveduras, procariotos, vírus e moléculas
3 Algumas leveduras, procariotos, vírus e moléculas
1,2 Maioria dos procariotos, vírus e moléculas
0,45 Alguns procariotos, vírus e moléculas
0,22 Vírus e moléculas
0,10 Alguns vírus (médios)
0,05 Pequenos vírus e moléculas
0,025 Vírus muito pequenos e moléculas
Figura 3.15 Meio de cultura esterilizado por filtração. O ar é removido por uma bomba a vácuo ligada a um kitasato.
▶ Dessecação
Os métodos que utilizam como princípio a dessecação removem a água, e, como os microrganismos necessitam dela para o seu crescimento, esses procedimentos são eficazes para o controle do crescimento microbiano. O mais usado é a liofilização.
■ Liofilização
É o congelamento rápido do material sob N2 e posterior remoção da água por sublimação, sendo convertida diretamente do estado sólido para o gasoso. Esse método, bacteriostático e menos destrutivo que o congelamento, evita que as células fiquem danificadas pela expansão dos cristais de gelo. É usado na indústria de alimentos (café, leite) e na
preservação de culturas bacterianas (Figura 3.18).
Figura 3.16 Sistema de amostragem de ar para a detecção de microrganismos no ar. Modelo Air Ideal®, bioMérieux. (Foto: Prof. Marco Antônio Miguel e Sergio E. Fracalanzza)
Figura 3.17 Placa de Petri com colônias de microrganismos (bactérias e fungos), coletada com o amostrador de ar Air Ideal®. (Foto: Prof. Marco Antônio Miguel.)
■ Defumação
Consiste na diminuição do teor de água por exposição de alimentos (carnes, peixes) durante horas ou dias à fumaça de madeira em combustão.
Figura 3.18 Liofilizador. Aparelho que emprega congelamento rápido e posterior sublimação da água. (Foto: Instituto de Microbiologia Paulo de Góes.)
▶ Remoção do oxigênio
Método muito usado na indústria de alimentos (café, enlatados), previne o crescimento de microrganismos aeróbios. No caso do café, usa o empacotamento a vácuo. Deve-se tomar cuidado, entretanto, com a presença de microrganismos anaeróbios capazes de esporular em alimentos enlatados. Neste caso, é melhor esterilizar pelo calor antes da remoção de
O (115°C/5 minutos). 2
▶ Vibração ultrassônica
Consiste em vibrações sonoras de alta frequência que levam a rompimento de células, despolimerização de compostos e quebras do DNA. Não esteriliza.
Métodos químicos
São substâncias químicas de origem natural ou sintética usadas para eliminar ou inibir o crescimento dos microrganismos. A resposta dos microrganismos aos agentes químicos varia em relação a fatores como pH, temperatura, presença de matéria orgânica, fase de multiplicação e mesmo presença de outros agentes químicos. A resistência aos agentes pode ser uma propriedade intrínseca do microrganismo ou adquirida, normalmente as bactérias gram-negativas são mais resistentes que as gram-positivas. Por sua ação nos microrganismos, podem apresentar:
■ Efeito estático (bacteriostático, fungistático ou virustático): inibição do
crescimento. Em condições normais os microrganismos voltam a
crescer
■ Efeito microbicida (bactericida, fungicida, virucida): morte do
microrganismo.
Os agentes químicos podem ser usados para descontaminação, desinfecção, antissepsia ou esterilização. Têm maior efeito nas células vegetativas por terem metabolismo ativo, e variações na sua ação ocorrem de acordo com concentração da substância e tempo de contato, pH, temperatura, tipo de microrganismo e presença de material orgânico (possível inativação da substância). Os agentes podem ser desinfetantes e antissépticos. Todos variam em relação à toxicidade seletiva, sendo que alguns não possuem toxicidade seletiva e outros a possuem em diferentes graus.
Os antibióticos, agentes químicos para controle dos microrganismos na clínica médica, não serão tratados neste capítulo. Neste último grupo todos possuem toxicidade seletiva com alvos específicos nos microrganismos, alvos que não estão presentes em células humanas e animais ou que possuem composição química diferente.
▶ Desinfetantes
Compostos químicos que podem matar ou inibir o crescimento dos microrganismos são usados em superfícies e objetos inanimados. Existem métodos para avaliar a eficácia desses desinfetantes: o coeficiente fenólico (CF) e o método da diluição de uso, este atualmente mais usado.
▶ Coeficiente fenólico. É um processo clássico, cujo objetivo é realizar uma comparação da atividade germicida de determinado desinfetante-teste com a atividade do fenol em condições padronizadas
(Figura 3.19).
O cálculo do CF se faz da seguinte maneira:
Exemplo:
Diluição efetiva do desinfetante-teste → 1:100
Diluição correspondente do fenol → 1:50
CF = 100/50 = 2.
Conclusão: o desinfetante-teste é duas vezes mais efetivo que o fenol.
Bactérias usadas nesse teste: Staphylococcus aureus ou Salmonella typhi.
▶ Método da diluição de uso. Mais usado atualmente, determina a concentração apropriada do desinfetante sem comparar com nenhum outro desinfetante-padrão, como o método do fenol. Ele faz uma comparação de
diferentes desinfetantes entre si (Figura 3.20).
■ Método padrão da diluição de uso para a avaliação da
atividade bactericida de desinfetantes1
Diluição aceitável → morte dos microrganismos em pelo menos 59 de cada 60 cilindros testados, em 10 minutos.
Microrganismos usados nesse teste:
■ Staphylococcus aureus ATCC 6538
■ Salmonella choleraesuis ATCC 10708
■ Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442.
▶ Antissépticos
Antissépticos são agentes químicos para uso tópico em tecidos vivos. Não podem ser ingeridos. Existem testes de toxicidade que são feitos em culturas de células para verificar o nível de toxicidade.
Figura 3.19 Teste da determinação do coeficiente fenólico (CF). As soluções de fenol e do desinfetante-teste são diluídas e inoculadas com a cultura do microrganismo por determinados intervalos de tempo. Após esse procedimento, a viabilidade da cultura é avaliada em placas de Petri com meio de cultura sem os desinfetantes.
Figura 3.20 Método da diluição de uso. Neste método, cilindros de aço inox são contaminados com a bactéria-teste e colocados na presença de diluições do desinfetante. Após 10 minutos, os cilindros são adicionados em meio de cultura para avaliar sua viabilidade.
▶ Índice de toxicidade (I). É uma medida da toxicidade seletiva do antisséptico. Os testes são feitos em culturas de células e visam verificar a toxicidade do agente químico. O índice é calculado pela seguinte fórmula, sendo que o ideal é que ele não ultrapasse 1,0, pois deve ser mais tóxico à bactéria que ao tecido:
Exemplo:
Antisséptico-teste em células de músculo cardíaco (aves): maior diluição que mata as células de músculo cardíaco em 10 minutos → 1:1.000
Antisséptico-teste em Staphylococcus aureus: maior diluição que mata as bactérias em 10 minutos → 1:10.000
I = 1.000/10.000 = 0,1
(Exemplo: iodo = 0,2; o ideal é não ultrapassar 1,0, deve ser mais tóxico para a bactéria que para o tecido.)
▶ Agentes químicos | Desinfetantes e antissépticos
■ Agentes alquilantes
Promovem a alquilação de grupos –COOH, –OH, –SH e –NH2 de enzimas e ácidos nucleicos, inativando-os. Em virtude da capacidade de romperem ácidos nucleicos, podem causar câncer e não devem ser usados em situações nas quais possam afetar células humanas. O glutaraldeído, o formaldeído e a β-propiolactona são usados em soluções aquosas, e o óxido
de etileno, na forma gasosa (Figura 3.21).
▶ Glutaraldeído. O mecanismo de ação é a alquilação (entra como substituto) dos grupos sulfidrila, hidroxila, carbonila e grupo amino,
alterando o DNA e a síntese proteica (ver Figura 3.22). Pode ser usado para desinfecção e tem amplo espectro e ação esporicida, promovendo desinfecção de alto nível em artigos termossensíveis (2%/30 minutos),
como equipamentos de anestesia gasosa e outros (ver Quadro 3.5). Não é indicado para desinfecção e descontaminação de superfícies. Seu uso em estabelecimentos de saúde é limitado, por causa dos vapores irritantes, pelo odor desagradável e pelo potencial cancerígeno. O limite de exposição permitido é 1 ppm/30 minutos. Exige o uso de equipamento de proteção individual (EPI). Seu uso é indicado quando não se pode usar vapor ou óxido de etileno.
Figura 3.21 Estrutura dos agentes alquilantes: formaldeído; glutaraldeído; óxido de etileno e β-propiolactona.
Figura 3.22 Descontaminação de material (balde da esquerda) e desinfecção (balde da direita) de artigos hospitalares usando glutaraldeído, no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
A presença de matéria orgânica diminui sua eficácia, embora continue ativo.
Pode ser usado para esterilização por imersão (2%/10 horas, tempo de acordo com o fabricante) a frio de artigos críticos termossensíveis, como
enxertos de acrílico etc. (ver Quadro 3.5). A temperatura não deve ser maior que 25°C. A solução deve ser descartada ao final do dia ou antes de se
verificar alteração no seu aspecto ou depósitos (Figura 3.22).
Quadro 3.5 Agentes químicos de controle do crescimento microbiano e recomendações de uso.
Categoria Mecanismo de Agente Uso
ação químico
Agentes Alquilam grupos Glutaraldeído Desinfetante
alquilantes
–COOH, –OH e – Artigos termossensíveis,
NH2 equipamentos de anestesia
gasosa, conexões e acessórios de
respiradores arti ciais,
endoscópios de bra óptica,
artigos não descartáveis,
metálicos ou corrosivos com
hipoclorito, instrumental
odontológico, equipamentos de
aspiração
Óxido de etileno Esterilizante
Usado para esterilizar marca-passos,
próteses, instrumentos de
hemodinâmica, acessórios e
respiradores, transdutores,
materiais de borracha (luvas
cirúrgicas, cânula endotraqueal),
de plástico (cateteres, equipos) e
com bra óptica, como os
utilizados em laparoscopia,
artroscopia
Ortoftalaldeído Desinfetante de alto nível
Material hospitalar, endoscópios
exíveis
Fenóis Desnaturam Fenol, alquil Desinfetante
proteínas fenóis (orto,
Usado para desinfecção de
meta e
superfícies, artigos metálicos e de
paracresóis)
vidro
etc.
Derivado com Antisséptico
cloro:
Em sabões, sprays, cosméticos etc.
hexaclorofeno
Biguanidas Dani cam Clorexidina Antisséptico
membrana
Para peles e mucosas
citoplasmática
Halogênios Oxidam grupos – Cloro e Desinfetante
SH, –NH 2 de compostos
proteínas clorados Utilizado na desinfecção hospitalar e
da água. Em hospitais, é usado
para unidades de diálise,
hemodiálise, bancos de sangue,
laboratórios, lactários e qualquer
superfície contaminada
Iodo Desinfetante
Ampolas de vidro, termômetros,
estetoscópios, otoscópios,
superfície externa de
equipamentos metálicos, partes
metálicas de incubadoras, macas,
camas, equipamentos metálicos
de cozinhas, bancadas etc.
Antisséptico
Tecidos e feridas
Agentes Danos na Cloreto de Desinfetante
surfactantes: membrana benzalcônio
Usado em superfícies e
quaternários citoplasmática
equipamentos na área de
de amônio
alimentação
Peroxigênios Agentes Peróxido de Desinfetante
oxidantes. hidrogênio
Usado para artigos semicríticos,
Ação na
lentes e equipamentos de
membrana ventilação respiratória
citoplasmática,
Esterilizante
no DNA e em
outros Indústria de alimentos para ltros e
componentes tubulações. Na forma de plasma
celulares esterilizante para tecidos e
líquidos, instrumentos de metal,
endoscópios, câmeras de vídeo,
des briladores, equipamento de
terapia para radiação
Antisséptico
Irrigação de feridas profundas inibe
o crescimento de anaeróbios
Ácido peracético Desinfetante
Grande variedade de materiais e
instrumentos
Ozônio Desinfetante
Desinfecção da água
Alcoóis Desnaturação de Alcoóis etílico e Desinfetante
proteinase, isopropílico
Ampolas de vidro, termômetros,
desorganização
estetoscópios, otoscópios,
dos lipídios de
superfície externa de
membrana
equipamentos metálicos, partes
metálicas de incubadoras, macas,
camas, equipamentos metálicos
de cozinhas, bancadas etc.
Antisséptico
Tecidos e feridas
Metais pesados Desnaturação de Nitrato de prata, Germicida ou antisséptico
proteínas sul to de
Mucosas
cobre
Corantes Inibe a síntese da Violeta de Germicida
parede celular genciana
Para a levedura Candida albicans
(cristal
violeta)
No Brasil, o informe técnico no 4/07 da Anvisa, intitulado Glutaraldeído em estabelecimentos de assistência à saúde. Fundamentos para a utilização, estabelece as normas para uso desse agente. Alguns fatos comprometeram o uso de glutaraldeído para esterilização. Em 2007, ocorreu um surto de micobactérias no Brasil, principalmente associadas a procedimentos de videocirurgia, que levou a questionamentos sobre a eficácia do glutaraldeído. Posteriormente, estudos de pesquisadores brasileiros identificaram a possível resistência do Mycobacterium massiliense ao glutaraldeído, lembrando que essa espécie foi a principal envolvida no surto ocorrido no país. Com o objetivo de conter o surto, medidas foram aplicadas pelo governo, como a proibição da esterilização química líquida pela Anvisa, por meio da Resolução no 8, de 27 de fevereiro de 2009). Essa resolução se aplica a procedimentos cirúrgicos e diagnósticos por videoscopias, com penetração de pele, mucosas adjacentes, tecidos subepiteliais e sistema vascular, cirurgias abdominais e pélvicas convencionais, cirurgias plásticas com o auxílio de ópticas, mamoplastias e procedimentos de lipoaspiração. O glutaraldeído é eficaz contra a Mycobacterium tuberculosis, o que fez com que a Anvisa exigisse, dos fabricantes de quaisquer saneantes para desinfecção de artigos semicríticos, testes de eficácia germicida contra esses microrganismos. Na Resolução no 33 de 2010, a Anvisa determinou que “fica proibido o registro de novos produtos saneantes na categoria ‘esterilizantes’ para aplicação sob a forma de imersão”. Posteriormente, na Resolução no 31, de 4 de julho de 2011, esses conceitos foram revalidados, permitindo o uso exclusivo em equipamentos que realizam esterilização por ação físico-química ou em produtos para uso exclusivo em dialisadores e linhas de hemodiálise, ambos devidamente registrados na Anvisa. Portanto o uso do glutaraldeído para esterilizar é restrito, mas pode ser empregado como desinfetante e descontaminante.
▶ Formaldeído (CH2O). Como citado anteriormente, a legislação brasileira proíbe o uso de formaldeído e paraformaldeído para desinfecção e esterilização (Resolução no 91, de 28 de novembro de 2008, da Anvisa). Em outros países onde seu uso é permitido, eles podem ser agentes
esterilizantes ou desinfetantes (ver Figura 3.21). Têm ação sobre bactérias gram-positivas e negativas, fungos, vírus, micobactérias e endósporos bacterianos. A solução e o vapor do formaldeído são extremamente irritantes para membranas mucosas dos olhos, do nariz e do sistema respiratório. Os sintomas incluem desde ardor, lágrimas e tosse até cefaleia intensa, insônia, fraqueza e taquicardia. Em virtude de sua alta toxicidade, seu uso deve ser evitado, e, quando isso não for possível, deve-se sempre usar EPI. O formaldeído é considerado potencialmente carcinogênico.
▶ Ortoftalaldeído (OPA). É similar ao glutaraldeído mas não requer ativação. Não é corrosivo e promove desinfecção de alto nível. Tem baixa ação esporicida e atividade superior à do glutaraldeído para micobactérias. Não irrita os olhos nem passagens nasais e tem excelente estabilidade em uma ampla gama de pH (pH 3 a 9). Seu odor é quase imperceptível. Uma desvantagem é que cora proteínas de cor cinza, inclusive pele exposta, por isso exige uso de equipamentos de proteção. Suas soluções degradam-se após ser submetido à iluminação UV e à exposição ao ar.
▶ Óxido de etileno (ETO) (C2H4O). Gás incolor, com grande poder de penetração, e mutagênico, o óxido de etileno é misturado com gases inertes liquefeitos, como o freon (difluormetano) e o CO2, para diminuir o risco de inflamabilidade. Os vapores do óxido de etileno são tóxicos para pele, olhos, membranas e mucosas, além de serem cancerígenos.
É indicado para artigos termossensíveis exemplificados no Quadro 3.5. A esterilização se processa em condições padronizadas de tempo de exposição (3 a 4 horas), temperatura (50 a 60°C), umidade relativa (40 a 60%), concentração do gás (500 a 600 mg/ ℓ ) e embalagem (papel grau cirúrgico combinado com filme de plástico de propileno com poliestireno ou polietileno com poliéster). É necessário o uso de EPI. Exige treinamento do pessoal com controle de exames bioquímicos de sangue. Existe monitoramento biológico para esse tipo de esterilização. O indicador usado
é o Bacillus subtilis var. niger (Quadro 3.6). A Figura 3.23 ilustra uma esterilizadora de óxido de etileno.
■ Fenóis
O fenol (ácido carbólico) e seus derivados fenólicos são agentes
desnaturantes de proteínas (Figura 3.24). Os derivados possuem alterações na estrutura do fenol que aumentam a ação antimicrobiana e diminuem a toxicidade. Por exemplo: alquilfenóis (orto-, meta- e paracresóis).
Quadro 3.6 Indicadores biológicos usados em diferentes métodos de esterilização.
Método de esterilização Indicador biológico
Calor úmido Bacillus stearothermophilus
Calor seco Bacillus subtilis
Radiação gama Bacillus pumilus
Óxido de etileno Bacillus subtilis
Filtração Pseudomonas diminuta
Figura 3.23 Máquina esterilizadora de óxido de etileno. (Foto: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.)
Figura 3.24 Estrutura do fenol e derivados.
O fenol é mais usado para desinfetar superfícies e culturas que serão descartadas. Entretanto, dependendo da sua concentração, pode ter diferentes níveis de ação:
■ Fenol 0,5 a 1%: antisséptico
■ Fenol 5%: desinfetante.
O fenol promove uma desinfecção de nível médio, intermediário ou baixo. Pode ser usado para descontaminação de superfícies hospitalares, artigos metálicos e de vidro. Para superfícies, recomenda-se a exposição durante 10 minutos, e para artigos, 30 minutos.
Em hospitais não é recomendado para artigos que entrem em contato com o trato respiratório, alimentos, berçários e objetos de látex, acrílico e borrachas (são danificados).
As diluições a serem preparadas seguem as instruções do fabricante. São absorvidos por material poroso. Para artigos imersos, antes de se iniciar a contagem, deve-se friccionar com esponja, escova etc. Nas superfícies, após a contagem do tempo, deve-se passar pano úmido com água.
No lisol, o derivado usado é o ortofenol. O creosoto possui uma mistura de derivados do fenol e é usado para prevenir o apodrecimento de postes de madeira, cercas etc.; entretanto, é irritante para a pele e carcinogênico. A adição de halogênios às moléculas de fenol aumenta sua eficácia. O hexaclorofeno e o diclorofeno são fenóis halogenados que inibem os estafilococos e fungos na pele. O hexaclorofeno a 3% tem ação antisséptica. Foi muito usado em sabões, cosméticos, desodorantes e sprays para higiene feminina. O uso excessivo de hexaclorofeno pode causar lesões neurológicas. Por ser absorvido através da pele, circula no sangue e atinge o cérebro. Um exemplo trágico é o do talco infantil contendo essa substância, que matou 40 bebês na França em 1972. Atualmente, o hexaclorofeno ainda é usado com muita cautela em unidades hospitalares porque é eficaz na prevenção da disseminação de infecções por estafilococos.
■ Biguanidas
A clorexidina é um composto clorado, semelhante ao hexaclorofeno, que é eficaz contra vários micróbios, mesmo na presença de matéria
orgânica (Figura 3.25). É muito usada no controle da densidade microbiana em pele e mucosas, e, combinada com detergente ou álcool, também é usada para a escovação cirúrgica das mãos e na preparação pré-operatória de pacientes. Em áreas pré-cirúrgicas é usada uma solução com 4% de clorexidina contendo 4% de álcool. Possui baixa toxicidade, mas deve-se evitar contato com os olhos para impedir lesões. A clorexidina, que possui efeito bactericida e atua lesando a membrana citoplasmática, é efetiva contra formas vegetativas de procariotos, fungos, mas não é esporicida. Os únicos vírus afetados são os que possuem envelope lipídico.
■ Halogênios
▶ Cloro e compostos clorados. Agentes que oxidam grupos –SH e –NH2 de enzimas, inibindo-as e inativando ácidos nucleicos, são eficazes contra vírus, bactérias gram-positivas e gram-negativas, fungos, micobactérias, todos os tipos de vírus e endósporos. O ácido hipocloroso (HOCl), formado pela adição de cloro ou hipoclorito de sódio e outros compostos clorados na água, é a forma mais efetiva do cloro, pois tem carga neutra e se difunde tão rapidamente quanto a água através da célula. Em razão da carga negativa, o íon hipoclorito (OCl–) não pode penetrar livremente o microrganismo. São mais ativos em valores de pH igual ou inferior a 7.
São usados na desinfecção hospitalar e de água (alimentação, piscinas). Em hospitais, são indicados para desinfecção de nível médio de artigos e superfícies e também para a descontaminação de superfícies durante 10
minutos com 1% de cloro ativo (10.000 ppm) (ver Quadro 3.5). Para lactários, cozinhas, depósitos de água e oxigenoterapia e artigos não metálicos, indicam-se 60 minutos com 0,02% de cloro ativo (200 ppm). Apresentam como vantagem a permanência de atividade residual. O uso desse produto é limitado pela presença de matéria orgânica que inativa o composto; tem também capacidade corrosiva (para metais e mármores) e descolorante. Sua instabilidade também se deve por ser afetado pela luz solar, por temperatura acima de 25°C e pH ácido. É corrosivo para metais, tem odor desagradável e pode causar irritabilidade nos olhos e mucosas. Os artigos submetidos até a concentração de 0,002% não precisam de enxágue. As soluções devem ser guardadas em lugares fechados, escuros e frescos. Na presença da água, o hipoclorito de sódio e o cloro formam o ácido hipocloroso, a forma mais ativa e desinfetante dos compostos clorados, conforme as fórmulas a seguir:
Figura 3.25 Estrutura da clorexidina.
■ Hipoclorito de sódio (NaOCl):
NaOCl + H 2O → NaOH + HOCl
HOCl ↔ H+ OCl–
■ Cloro (Cl2):
Cl – 2 + H 2 O → HOCl + H + + Cl
HOCl ↔ H+ OCl–
Entre os compostos clorados incluem-se o hipoclorito de cálcio e o hipoclorito de lítio, usado para desinfetar equipamentos de fábricas de laticínios e utensílios de restaurantes, e o hipoclorito de sódio (água sanitária), muito usado como desinfetante doméstico e alvejante, desinfetante em fábricas de processamento de laticínios, alimentos e em sistemas de hemodiálise. Excepcionalmente, pode grosseiramente substituir a cloração municipal quando a qualidade da água é duvidosa. Duas gotas em 1 ℓ de água, ou 4 gotas, se a água estiver turva, com um armazenamento de 30 minutos antes do consumo, resultam em eficiente ação desinfetante. As cloraminas (cloro e amônia) são usadas como desinfetantes, antissépticos ou agentes de sanitização. Efetivas na presença de matéria orgânica, são utilizadas como desinfetantes de louças e utensílios, para tratar equipamentos de fábricas de laticínios. A amônia em geral é misturada com o cloro nos sistemas municipais de tratamento de água, para formar as cloraminas que controlam o sabor e o odor causados pela reação do cloro com compostos nitrogenados na água. Como são menos germicidas que o cloro, uma quantidade de cloro deve ser adicionada para assegurar a presença do cloro na forma de ácido hipocloroso.
▶ Iodo (I 2). Agente químico usado como desinfetante ou antisséptico, é um forte agente oxidante (complexa e inativa proteínas) e pode ser usado na forma de álcool iodado com 0,5 a 1,0% de iodo livre em álcool etílico 77% (v/v), o que corresponde a 70% em peso. Tem ação contra células vegetativas, endósporos, vários fungos e alguns vírus.
Um mecanismo proposto para a ação antimicrobiana é aquele em que o iodo se combina com o aminoácido tirosina, encontrado em várias proteínas
e enzimas, inibindo suas funções (Figura 3.26).
O iodo também oxida grupos sulfidrila (–SH) de certos aminoácidos importantes para manter a estrutura das proteínas. Está disponível como uma tintura em solução de álcool aquoso e como iodóforos, nos quais o iodo se combina com uma molécula orgânica, da qual o iodo é liberado lentamente. Os iodóforos não mancham e são menos irritantes do que o iodo. Produtos comerciais conhecidos são o Betadine® e o Isodine®, que são povidonas-iodo.
Figura 3.26 Um dos mecanismos propostos para a ação antimicrobiana do iodo: o iodo se liga à tirosina, formando a di-iodotirosina.
Os artigos em que pode ser usado estão descritos no Quadro 3.5. Não é recomendado para metais que não resistam à oxidação, como cromo, ferro, alumínio, nem para materiais que mancham, como plásticos. Ao deixar o artigo ou superfície em contato com o iodo, deve-se removê-lo por fricção com álcool.
É considerado excelente antisséptico, um dos mais antigos e efetivos. Utiliza-se em soluções a 2% em água ou em solução alcoólica para antissepsia de tecidos e tratamento de feridas. Pode também ser usado como sabonete de iodo.
■ Quaternários de amônio
Os quaternários de amônio (QUATS) são desinfetantes surfactantes, detergentes iônicos, derivados da amônia. Possuem quatro grupos orgânicos ligados a um átomo de nitrogênio do íon amônio, NH + 4. A geração vai da primeira, que tem como representante os cloretos de alquil dimetil benzila amônio, até a quarta, envolvendo o cloreto de dialquil dimetil amônio.
Considerados desinfetantes de baixa toxicidade e classificados com atividade de baixo nível, são ativos contra alguns fungos e vírus não lipídicos e mais efetivos contra bactérias gram-positivas que contra gram-negativas. P. aeruginosa, E. coli e Salmonella typhimurium são resistentes à sua ação. Não apresentam ação letal para micobactérias e endósporos. Grande variedade desses produtos está disponível como agentes desinfetantes. Esses compostos, em soluções concentradas, podem causar efeitos tóxicos por todas as vias de exposição, seja por inalação, por ingestão ou via dérmica, levando a queimaduras na pele e em mucosas ou toxicidade sistêmica, porém exposição em concentrações diluídas não provoca irritação. Como exemplo, podemos citar o cloreto de benzalcônio e
a cetrimida (Figura 3.27).
Figura 3.27 Estrutura dos QUATS: íon amônio; cloreto de benzalcônio e cetrimida.
Sua capacidade de limpeza está relacionada à parte positivamente carregada, o cátion da molécula. Além de bactericidas, são também fungicidas, viruscidas para vírus envelopados e ativos contra amebas. Seu alvo é a interface da membrana citoplasmática com o meio polar ao redor. Um problema sério é que auxiliam o crescimento de certas bactérias, como as Pseudomonas. Sua eficácia é reduzida na presença de sabões, íons cálcio ou magnésio, detergentes aniônicos e substâncias porosas como a gaze. Promovem a desinfecção de baixo nível, e o tempo de exposição é de 30 minutos. Os QUATS são muito usados para superfícies e equipamentos em áreas de alimentação em hospitais e em indústrias. Ao serem aplicados, devem ser friccionados sobre a superfície. São bons agentes desinfetantes e sanitizantes para uso doméstico e em hospitais, e também são usados contra algas e fungos em piscinas, reservatórios de água em indústria, entre outros tipos de uso. Como antissépticos, a cetrimida e o cloreto de benzalcônio podem ser usados para limpeza de ferida, pele e queimaduras.
■ Sabões
Detergentes e sabões são agentes tensoativos ou surfactantes capazes de reduzir a tensão de superfície entre as moléculas de um líquido. Produzidos a partir da reação de gorduras e óleos com uma base alcalina (geralmente hidróxido de sódio ou de potássio), dão origem a um sal de ácido carboxílico. Têm pouco valor como antissépticos, mas removem mecanicamente os micróbios pela esfregação, e suas propriedades alcalinas moderadas ajudam a destruir os microrganismos. Quando aplicados na pele, os sabões e os detergentes rompem a camada oleosa desta, em um processo denominado emulsificação (e com relação a óleos, agem em geral do mesmo modo). Adicionalmente, os sabões podem conter lauril sulfato de sódio, outro surfactante originado de fontes sintéticas ou naturais (ácidos graxos do coco ou palma) e produzido a partir do ácido láurico, cuja função é de agente espumante e desengordurante. O lauril sulfato de sódio é comumente encontrado em outros produtos de higiene pessoal, como pastas de dentes e xampus.
■ Peroxigênios
São agentes químicos oxidantes, tais como o peróxido de hidrogênio, o ácido peracético e o ozônio.
▶ Peróxido de hidrogênio (H2O2). O peróxido de hidrogênio é usado há muito tempo como agente esterilizante na indústria de alimentos para filtros e tubulações, e, em razão de sua eficácia, passou a ser aplicado em outras áreas, inclusive na prática hospitalar para antissepsia de ferimentos. Usado como desinfetante líquido e antisséptico, é um agente antimicrobiano eficaz quando utilizado isoladamente (3 a 6%) ou em associação com o ácido peracético (0,2%). Em artigos semicríticos, é considerado um desinfetante de alto nível. Possui baixa toxicidade e não é inativado por matéria orgânica. É incompatível com borracha, tecidos e metais (alumínio, ferro, chumbo, titânio, níquel, cromo, prata, zinco e manganês), mas recomendado para lentes e equipamentos de ventilação respiratória. Destrói os radicais hidroxila livres, tendo ação na membrana lipídica, no DNA e em outros componentes celulares. É ativo contra bactérias, incluindo micobactérias, vírus, fungos e endósporos. Também é usado na desinfecção de lentes de contato, porém, como o composto irrita os olhos, os produtos com esse fim passam por uma segunda etapa, em que, após a remoção do peróxido, é adicionada ao sistema de limpeza a catalase, uma enzima que destrói o peróxido de hidrogênio. Os kits de limpeza podem ainda ter um sistema único contendo um anel de platina capaz de decompor o peróxido após a desinfecção da lente de contato.
É usado como antisséptico (3%), mas não pode ser usado para feridas abertas, pois é rapidamente degradado em água e oxigênio gasoso pela ação da enzima catalase que está presente em células humanas. Entretanto, é útil para irrigar feridas profundas nas quais a liberação de oxigênio, por causa de sua degradação pela catalase, impede o crescimento de microrganismos anaeróbios. O peróxido de benzoíla é outro agente usado para tratar feridas contaminadas com anaeróbios e em produtos antiacne, por atuar em bactérias anaeróbias que infectam o folículo piloso.
■ Gás plasma ou plasma esterilizante de peróxido de hidrogênio. Definido como o quarto estágio da matéria, o plasma é produzido a altas temperaturas e em decorrência de um campo eletromagnético. É composto por nuvens de elétrons, íons e moléculas neutras. O sistema de esterilização utiliza o peróxido de hidrogênio como gás substrato. É um processo rápido que ocorre em baixa temperatura. A energia da radiofrequência (RF) ioniza o peróxido, produzindo o plasma, que tem radicais reativos como os hidroperóxidos e as hidroxilas, que interagem com a membrana celular, incapacitando a multiplicação microbiana. Quando a energia é desligada, os radicais se convertem em moléculas de H 2O e O2 como produtos finais. Requer apenas energia elétrica e usa ampolas de peróxido de hidrogênio para produzir o gás. Trata-se de um método inovador. O plasma destrói os microrganismos, incluindo os endósporos. Apresenta alto custo inicial e processa tecidos e líquidos. Usado para vários tipos de materiais como alumínio, aço inoxidável, vidro, polistireno, polipropileno, neopreno etc., recomenda-se o uso para instrumentos de metal, endoscópios, câmeras de vídeo, desfibriladores, equipamento de terapia por radiação, entre outras aplicações. Disponível no mercado há o sistema Sterrad®, da Johnson’s Medical Devices, com três modelos.
▶ Ácido peracético (CH CO • OOH). Esse agente pode ser usado 3 em baixas concentrações (0,001 a 0,2%), possui rápida atividade contra microrganismos, procariotos, inclusive endósporos, fungos e vírus. Considerado desinfetante de níveis intermediário e alto, decompõe-se em produtos não tóxicos (água, oxigênio e peróxido de hidrogênio). É efetivo na presença de matéria orgânica e corrosivo e abrasivo para cobre, latão, aço, bronze, alumínio e materiais galvanizados. O nome comercial do produto é Steris. Tem um ciclo rápido de esterilização (30 a 45 minutos/50 a 55°C), e compatível com grande quantidade de materiais e instrumentos e não tem nenhum efeito tóxico. Usado em equipamentos médicos e de processamento de alimentos, é muito pouco afetado pela presença de matéria orgânica.
▶ Ozônio (O ). Forma altamente reativa do oxigênio, que é gerada 3
quando este é passado através de descargas elétricas de alta voltagem. É frequentemente usado para suplementar o cloro na desinfecção da água. Apresenta a vantagem de ser um microbicida sem contaminantes, porém seu uso em água é mais caro que o cloro, sem atividade residual. Em contrapartida, o ozônio é 50% mais eficaz e pode agir 3.000 vezes mais rápido que o cloro. O uso do ozônio tem crescido muito nos últimos anos como agente antimicrobiano, inclusive na clínica médica e veterinária. Em 1997, cientistas especialistas em alimentos declararam que o ozônio foi reconhecido como seguro (generally recognized as safe – GRAS), e atualmente ele é usado e aplicado no saneamento e na desinfecção de alimentos, além da água. O ozônio pode, efetivamente, matar vírus, bactérias, fungos e parasitas, incluindo aqueles que causam deterioração de alimentos ou doenças humanas.
■ Alcoóis
Promovem a desnaturação de proteínas e desorganização dos lipídios de membrana. São indicados para desinfecção de níveis baixo ou intermediário. Os alcoóis etílico e isopropílico são os principais desinfetantes utilizados em serviços de saúde, podendo ser aplicados em superfícies ou artigos por meio de fricção. Os alcoóis na concentração 60 a 90% são excelentes bactericidas, principalmente para as formas vegetativas. Atuam também sobre células de Mycobacterium tuberculosis, sobre alguns fungos e vírus lipofílicos. Sua indicação é para desinfecção de artigos e superfícies, e o tempo de exposição recomendado é de 10 minutos. Como evapora, não é aconselhado imergir os materiais no álcool. É incompatível com acrílicos, borrachas e tubos plásticos, podendo danificar o cimento das lentes dos equipamentos ópticos. Extremamente inflamável, deve ser guardado em áreas ventiladas. As proteínas se desnaturam mais facilmente na presença da água, e por isso as soluções são preparadas em soluções aquosas. Com o uso repetido, pode causar despigmentação da pele e hiperbilirrubinemia neonatal, logo seu uso não é recomendado em berçários. É poluente ambiental, e por sua toxicidade oral, é proibido utilizá-lo em áreas de contato com alimentos.
O álcool etílico possui maior ação germicida, menores custo e toxicidade do que o isopropílico, que, por sua vez, tem maior ação para os
vírus hidrofílicos (Figura 3.28).
■ Metais pesados
Os metais pesados usados em agentes químicos são o selênio, o mercúrio, o cobre, a prata e o zinco.
O nitrato de prata (AgNO3) já foi muito usado para prevenir infecções oftálmicas por gonococos em bebês na hora do parto, mas depois foi substituído por antibióticos. Por sua vez, o sulfato de zinco pode ser usado em colírios. Os compostos mercuriais orgânicos fazem reação com grupos – SH de enzimas, precipitando-as, porém, apesar de bacteriostáticos, não são mais usados por sua alta toxicidade, inclusive com uso proibido pela Anvisa. Entre os compostos que já foram comercializados se encontram mercurocromo (merbromina) e merback (acetomeroctol).
O sulfeto de selênio elimina fungos, incluindo esporos. Preparações contendo selênio são usadas para tratar micoses de pele. A adição desse composto a xampus combate a caspa, que tem como um dos causadores um fungo.
■ Corantes
Alguns corantes podem ser usados, como o azul de metileno, que inibe o crescimento de algumas bactérias, e o cristal violeta, conhecido como violeta de genciana, que bloqueia a síntese de parede celular, impedindo o
crescimento de bactérias gram-positivas (Figura 3.29). Podem também ser usados para tratar infecções por protozoários, como Trichomonas, e leveduras, como a Candida albicans.
■ Glucoprotamina
Substância multicomponente, com atividade sinergistíca, a glucoprotamina atua destruindo a parede e a membrana celular. Resultante da reação de conversão do ácido l-glutâmico com a cocopropileno-1,3-diamina, é uma substância de aspecto similar à cera, não volátil e de fácil solubilidade em água, não teratogênica, não mutagênica e biodegradável. Também não é corrosiva nem tóxica. O espectro de atuação estende-se a todas as classes de bactérias, incluindo as micobactérias, fungos e algumas classes de vírus. Sua concentração de uso é de 0,5 a 1%.
Figura 3.28 Estrutura química do álcool etílico e do álcool isopropílico. Como antisséptico, é um agente desidratante. Tem maior ação em células vegetativas que em endósporos, e sua eficácia aumenta após diluição a 70% em água.
Figura 3.29 Estrutura química da violeta de genciana.
▶ Testes de validação, indicadores químicos e indicadores biológicos
Testes de validação são programas desenvolvidos para assegurar a reprodutibilidade e a confiabilidade do processo, garantindo resultados satisfatórios e segurança. A validação verifica a eficiência do equipamento ou o processo, ou seja, se o equipamento cumpre as especificações para ele exigidas. Os indicadores químicos apenas ajudam a monitorar o processo
com as fitas termossensíveis (ver Figura 3.10). Os indicadores biológicos são bactérias empregadas para verificar a eficiência do processo de esterilização colocadas em locais estratégicos. Como exemplo temos o Sterikon® Bioindicator, que emprega o Bacillus stearothermophilus para
verificar a eficácia da autoclavação (Figura 3.30). Depois dos
procedimentos, são colocados em meios de cultura e incubados (Figura
3.31). Não existem testes padronizados com indicadores para todos os
métodos de esterilização. O Quadro 3.6 enumera alguns indicadores usados para certos tipos de esterilização.
Figura 3.30 Indicador biológico Sterikon® com cultura de Bacillus stearothermophilus para monitorar eficácia da autoclavação.
Figura 3.31 Aparelho para incubar as amostras-padrão recolhidas após o processo de autoclavação e colocadas em meio de cultura, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho.
▶ Substâncias químicas usadas como preservativos de alimentos
O uso de preservativos químicos nos alimentos é um método para prevenir a decomposição dos alimentos e o crescimento de patógenos.
■ Ácidos orgânicos
Ácidos acético, cítrico, láctico, propiônico, benzoico, sórbico ou seus sais são efetivos no controle do crescimento microbiano. O ácido propiônico é eficaz contra fungos filamentosos e usado em bolos, cafés e vários tipos de queijos. O ácido acético é efetivo contra fungos e bactérias. Já os benzoatos são muito usados como preservativos em sucos de frutas, geleias, molhos, margarinas etc.
A maioria dos procariotos é inibida por acidez. Processos microbianos como fermentações sofrem interrupção em pH 4 a 5. Alguns alimentos enlatados usam pH menor de 4 a 5 e temperatura de 100°C/10 minutos. Em pH ácido diminui a resistência térmica. Os endósporos de Clostridium botulinum, por exemplo, não germinam. Picles e sucos também podem ser colocados a 100°C em pH 3.
■ Nitratos e nitritos
Combinam-se com prótons e formam ácido nitroso e óxido nítrico, substâncias fortemente oxidantes, desestabilizando proteínas e a membrana. Causam a inibição de várias bactérias, inclusive de Clostridium botulinum. Como desvantagem, causa reações com grupos amina e forma nitrosamina (compostos químicos cancerígenos). São usados na “cura” de carnes, como bacon e presunto e preservam seu tom vermelho.
■ Gás sulfeto, metabissulfito, SO 2
Causam a redução de pontes dissulfeto. São usados em sucos, vinhos e
frutas secas. O Quadro 3.7 mostra alguns agentes usados na preservação de alimentos.
■ Adição de sal e açúcar
O meio hipertônico provoca a redução da quantidade intracelular de água. Altas concentrações de açúcares, sais ou outras substâncias criam esse meio que retira a água dos microrganismos por osmose. A perda da água interfere na função da célula e, eventualmente, acarreta a morte celular, embora tenha mais um efeito bacteriostático. Usado para fabricação de picles e outros alimentos, em que a salmoura tem efeito bactericida, exceto se houver contaminação por halófilos. Usa-se NaCl 14 a 25% para curagem de carnes, peixes, e açúcar 50% para frutas em conserva e geleias.
Quadro 3.7 Compostos químicos usados na preservação de alimentos.
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