Seção 2 | Prática

Figura 5.10 Escala de McFarland. Quantidades crescentes de sulfato de bário fornecem turvações crescentes.

 

 

Atividade metabólica

 

Este método considera que a quantidade de produtos excretados através do metabolismo microbiano é proporcional ao número de células presentes. O produto a ser medido pode ser um ácido, proteínas, DNA ou outro

produto metabólico qualquer, por exemplo, o CO . O método também 2 exige, para a contagem, uma curva-padrão para cada microrganismo estudado, onde será relacionado o número de células conhecido com a quantidade determinada do produto excretado.

 

SEÇÃO 2 | PRÁTICA

 

Técnica do esgotamento para a obtenção de cultura pura |

Contagem de bactérias pelo método das diluições em placas Objetivos

 

■ Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de cultura pura

■ Treinar o aluno na execução da técnica de esgotamento

■ Mostrar ao aluno os diversos métodos de contagem de microrganismos

■ Treinar o aluno na execução da contagem de bactérias pelo método das

diluições em placas.

 

Material

 

■ Tubos contendo suspensão mista de Serratia marcescens + Micrococcus

luteus (diluição adequada)

■ Placas de ágar simples

■ Alça de inoculação

■ Lâminas

■ Bateria para a coloração de Gram

■ Tubos de ágar simples inclinado

■ Tubos com salina estéril

■ Tubos contendo suspensão de E. coli para contagem

■ Pipetas para inoculação

■ Tubos contendo 9 m ℓ de salina estéril para o preparo das diluições

sucessivas

■ Agitador vórtex para homogeneização das diluições.

 

Procedimentos

 

▶ 1a etapa. Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido).

1. Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia marcescens +

Micrococcus luteus) a ser distribuída pelo professor.

Flambar a alça e retirar com ela uma pequena porção (gota) da 2.

suspensão mista de bactérias; semeá-la sobre a superfície de um meio

sólido (ágar simples) em placa. A semeadura deve ser feita por estrias,

de acordo com o esquema da Figura 5.3, na seguinte sequência (técnica

do esgotamento): 1a operação – colocar a pequena porção do inóculo na

superfície do meio e passar a alça em zigue-zague sem tocar no meio já

semeado, cobrindo um terço da placa. 2a operação – mudar a direção do

estriamento para a segunda região da placa, com o mesmo cuidado da

região 1, cobrindo outro terço. 3a operação – mudar a direção do

estriamento para a parte final do meio, sem tocar a superfície já

semeada.

3. Incubar as placas à temperatura ambiente por, no mínimo, 48 h.

▶ 2a etapa. Contagem de bactérias pelo método das diluições em placa.

1. A partir da suspensão bacteriana de E. coli a ser contada, realizar as

diluições sucessivas, de 10–1 até 10–7, da seguinte maneira: transferir 1

m ℓ da suspensão original para tubo contendo 9 m ℓ de salina estéril.

Homogeneizar em vórtex. Esta é a diluição de 10–1. A partir deste tubo

repetir o procedimento para obter os tubos com as diluições 10–2, 10–3, e

assim sucessivamente até 10–7.

2. A partir de cada diluição, proceder à inoculação de 0,1 mℓ em cada uma

das três placas-réplica contendo meio de ágar simples.

3. Espalhar o inóculo com o auxílio de uma alça de Drigalsky.

4. Incubar as placas a 37°C durante 24 a 48 h.

 

Interpretação dos resultados

 

▶ 1a etapa. Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido).

1. Observar o aparecimento de colônias isoladas nas placas de ágar

simples semeadas. Notar o aparecimento de dois tipos diferentes de

colônia. Observar cor, forma, tamanho, bordas etc.

2. Para a obtenção da cultura pura, retirar, com a agulha flambada, uma

porção de uma colônia escolhida e transferir assepticamente para um

tubo de ágar simples inclinado, fazendo uma estria na superfície deste.

Incubar a temperatura ambiente, durante, pelo menos, 48 h.

3. Após este tempo, observar a cultura crescida no tubo de ágar simples

inclinado, verificando sua pureza pelo aspecto homogêneo. Confirmar a

pureza, realizando uma coloração de Gram e observando as mesmas

forma e reação ao Gram de todas as células observadas. Um resumo do

procedimento pode ser observado na Figura 5.11.

▶ 2a etapa. Contagem de bactérias pelo método das diluições em placa.

1. Observar as placas correspondentes às diferentes diluições.

2. Selecionar aquelas correspondentes à diluição que tenha fornecido

colônias isoladas, que possam ser contadas, preferencialmente, entre 25

e 250.

Figura 5.11 Resumo do procedimento para a obtenção de uma cultura pura. A. Esgotamento de uma mistura de duas bactérias, uma gram-positiva e outra gram-negativa. B. Passagem da colônia isolada para ágar inclinado com a obtenção de cultura pura. C. Gram do crescimento correspondente às duas bactérias ainda misturadas. D. Gram do material obtido da cultura pura.