Metabolismo microbiano

Os testes bioquímicos para identificação dos microrganismos podem ser divididos em dois grupos principais: tipos de metabolismo e atividade enzimática. Dentre os principais testes realizados para identificação bioquímica de bactérias, e que serão tratados neste capítulo, podem ser citados: fermentação de carboidratos (glicose, lactose e manitol), teste do vermelho de metila (VM) e teste de Voges-Proskauer (VP), teste de oxidação/fermentação (O/F), teste de utilização do citrato, teste de hidrólise do amido, teste da catalase, presença de descarboxilases ou teste de descarboxilações, teste da urease, teste da β-galactosidase (ONPG), produção de H2S (gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio), teste do indol, redução de nitrato e liquefação de gelatina (gelatinase). Outro teste, embora não fundamentado em reações bioquímicas e que também envolve um grande dispêndio de energia, é o teste da motilidade, de grande utilidade na distinção de gêneros e espécies bacterianas, que por isso também está relacionado neste capítulo, juntamente com a prova do gás sulfídrico.

Após a análise de todos os testes bioquímicos, expressados na maioria das vezes como positivo ou negativo, os resultados poderão ser agrupados, e a bactéria identificada de acordo com suas características já preestabelecidas com base em esquemas de identificação.

Metabolismo microbiano

Os organismos vivos realizam inúmeras reações químicas utilizando-se de compostos orgânicos e inorgânicos da natureza com a finalidade primordial de produzir energia para realizar trabalho. Desta forma, poderíamos definir metabolismo como o somatório de todas essas reações químicas celulares, sendo o metabolismo como fonte de obtenção de energia a chave para a manutenção da vida. O metabolismo é a soma dos processos anabólicos (anabolismo), também conhecidos como processos sintéticos, com os processos catabólicos (catabolismo), estes os grandes responsáveis pela geração de energia obtida pela quebra de moléculas doadoras de energia, por exemplo, a metabolização de carboidratos (monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos).

Os microrganismos podem ser classificados em dois grandes grupos, de acordo com a forma como obtêm energia: autotróficos e heterotróficos, sendo os autotróficos aeueles que utilizam apenas CO2 como sua fonte de carbono, e os heterotróficos aqueles que podem requerer um ou mais compostos orgânicos como fonte de carbono.

Dentre os heterotróficos, estão os organismos quimio-organotróficos, que obtêm sua energia pela metabolização de compostos orgânicos, em que se destaca a utilização dos açúcares como moléculas altamente energéticas, e os quimiolitotróficos, que são

capazes de usar a energia contida nos compostos inorgânicos (Figura 6.1).

Os microrganismos podem obter energia a partir dos açúcares (principalmente a glicose) por meio do metabolismo anaeróbico (glicólise e fermentação) e/ou do metabolismo aeróbico (respiração), no qual teremos a oxidação completa do açúcar através do ciclo de Krebs (ciclo dos ácidos tricarboxílicos), envolvendo ainda o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa.

Figura 6.1 Principais tipos de metabolismo capazes de fornecer e captar energia.

É por intermédio deste grande conjunto de reações catabólicas, presente nos processos anteriormente citados, que podem ser feitas classificações e identificações dos microrganismos, sejam elas pela geração de produto a partir de um substrato, seja pelo consumo de determinado substrato, ou, ainda, pela detecção de enzimas específicas necessárias para a realização de reações envolvidas nos processos catabólicos, como veremos mais adiante neste capítulo.

Metabolismo anaeróbico

▶ Glicólise (via Embden-Meyerhof)

A via catabólica de maior utilização pela maioria dos organismos capazes de gerar o seu próprio alimento, como os que utilizam fontes externas prontas visando à obtenção de energia sob a forma de ATP, é a glicólise. Essa via é de extrema importância, pois é realizada tanto por microrganismos aeróbios como por anaeróbios, em virtude de não requerer a presença do oxigênio, e, por isso, ser conhecida como a fase anaeróbica da via glicolítica.

A via completa de utilização da glicose é composta de 10 etapas (Figura 6.2), as quais basicamente podem ser agrupadas em três grandes estágios:

■ Estágio I: reações preparatórias – no qual ocorrem a fosforilação do substrato com

consumo de ATP e a quebra da molécula de seis carbonos em duas de três

carbonos

■ Estágio II: oxidação – no qual se tem a geração de ATP e piruvato ■ Estágio III: síntese dos produtos de fermentação – no caso de processos

fermentativos.

Como podemos observar, a glicólise fornece um saldo positivo de duas moléculas de ATP e duas moléculas de NADH para cada molécula de glicose oxidada. Apesar de a glicose ser a principal fonte de energia de alguns microrganismos, outros açúcares, como lactose, galactose etc., também podem ser utilizados graças à presença de enzimas específicas capazes de transformar esses açúcares em um intermediário da via glicolítica. Desta forma, o açúcar também é metabolizado até ácido pirúvico e, consequentemente, metabolizado aerobicamente ou fermentado pelas mesmas etapas descritas anteriormente.

▶ Fermentação

No caso de microrganismos anaeróbicos ou anaeróbicos facultativos, o ácido pirúvico produzido pela via glicolítica pode continuar o processo metabólico na ausência de oxigênio, processo este conhecido como fermentação. Este processo, através da redução do piruvato, gera moléculas de NAD oxidado, que poderão ser

novamente utilizadas no início da via glicolítica (ver Figura 6.2), proporcionando, então, a metabolização de uma nova molécula de glicose.

Existem vários tipos de fermentação, e estas diferenças são conhecidas pelo nome do produto final da via, a saber:

■ Fermentação ácido-homolática: o ácido pirúvico é convertido exclusivamente em

ácido láctico, utilizando-se dos elétrons fornecidos pela molécula de NADH.

Diferentemente de outros tipos de fermentação, este processo não forma gás. Esse

tipo de fermentação é bastante utilizado na produção de queijos e derivados,

porque ocorre frequentemente em lactobacilos

■ Fermentação alcoólica: o ácido pirúvico é convertido em gás carbônico (CO2) e

acetaldeído, sendo este último reduzido a álcool etílico, também usando a molécula

de NADH. Muito utilizado na produção de bebidas alcoólicas, como vinho e

cerveja, e na panificação

■ Outros tipos de fermentação: ácido-mista (gerando ácido acético, ácido succínico,

álcool etílico e CO ), propiônica (gerando ácido propiônico, ácido acético e CO ), 2 2

butanodiólica (gerando butanodiol e CO2) e butírico-butílica (gerando ácido

butírico, butanol, álcool isopropílico, acetona e CO2).

Figura 6.2 Fase citosólica da glicólise (via Embden-Meyerhof) destacando seus três estágios principais: I – reações preparatórias, II – oxidação e III – redução.

▶ Vias alternativas de utilização da glicose

Além do processo da glicólise, podemos encontrar em muitos microrganismos outros tipos de reações oxidativas para a utilização da glicose. A via alternativa mais comum é a via das pentoses, que pode funcionar concomitantemente com a via glicolítica. Trata-se de uma via importante, pois proporciona a quebra de açúcares não somente de seis carbonos (as hexoses, como a glicose) mas também de cinco carbonos (as pentoses, daí o nome via das pentoses), e também porque gera a produção de pentoses importantes que poderão ser utilizadas posteriormente na síntese de ácidos nucleicos, na formação de glicose a partir de CO 2 nos processos fotossintéticos e também na síntese de alguns aminoácidos.

Outra via também conhecida é a via Entner-Doudoroff. Os microrganismos que possuem o aparato enzimático para realização dessa via também são capazes de metabolizar a glicose até a formação de duas moléculas de NADPH e uma molécula de ATP sem, entretanto, passar por todas as etapas da via glicolítica.

Metabolismo aeróbico (respiração celular)

A maioria dos microrganismos ditos aeróbicos é capaz de obter energia pela fase anaeróbica da glicólise. Entretanto, muitos deles utilizam essa via como um mecanismo preparatório para outro processo que, no final, será mais produtivo e rentável quando relacionamos a quantidade de moléculas de ATP geradas e, consequentemente, um aproveitamento maior da molécula doadora de energia, por exemplo a glicose.

Em razão da presença e da participação da molécula de oxigênio molecular (O2), esse processo é chamado de respiração aeróbica ou respiração celular. Ele ocorre com a utilização do composto intermediário gerado na etapa anaeróbica da metabolização da glicose (piruvato) por meio de dois processos metabólicos adicionais: o ciclo de Krebs e a cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa.

▶ Ciclo de Krebs

O ciclo de Krebs (denominação que homenageia seu descobridor, o bioquímico alemão Hans Krebs), também conhecido como ciclo dos ácidos tricarboxílicos, é formado por uma série de reações que se iniciam com a entrada da molécula de acetil-CoA no ciclo. Essa acetil-CoA é originada da descarboxilação do ácido pirúvico, formando acetil, que reage então com a coenzima A (CoA), formando o intermediário que será utilizado no ciclo de Krebs.

Nas células procarióticas, essas reações acontecem no citosol, de forma rudimentar e simples, enquanto nas células eucaróticas as mesmas reações ocorrem no interior da mitocôndria, mais especificamente na matriz mitocondrial.

A molécula de acetil-CoA entra no ciclo de Krebs reagindo com o oxaloacetato e formando o citrato. A partir de então, uma série de reações ocorre, envolvendo descarboxilações e reações de oxirredução, até que, finalmente, uma nova molécula de

oxaloacetato é formada, reiniciando o ciclo (Figura 6.3). A grande contribuição desse ciclo para o processo de respiração é que a cada volta completa do ciclo teremos a formação de grande potencial energético através da geração de moléculas de NADH, FADH2 e GTP (que posteriormente transferem seus elétrons para o ATP, que será utilizado na fase seguinte do processo).

▶ Cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa

Em sentido figurado, poderíamos comparar a cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa a pequenas quedas-d’água colocadas em série, em que a água, caindo de um ponto mais alto até chegar a seu ponto mais baixo, perderia “força”, a qual, sob a forma de energia liberada, poderia gerar trabalho, tal como a rotação de um moinho.

Na verdade, é exatamente isso que ocorre nesses processos, ou seja, a cadeia transportadora (também conhecida como cadeia respiratória) é composta por uma série de enzimas-proteínas (moléculas transportadoras) que são capazes de realizar reações de oxirredução.

Existem três classes de moléculas capazes de realizar transporte, as quais estão presentes na cadeia transportadora de elétrons: flavoproteínas (como a riboflavina ou vitamina B2), citocromos (que incluem citocromo b, citocromo c1, citocromo c, citocromo a e citocromo a3) e ubiquinonas ou coenzima Q (carreadores não proteicos).

Figura 6.3 Reações do ciclo de Krebs (ciclo dos ácidos tricarboxílicos). Observar a produção de três moléculas de NADH e uma molécula de FADH 2 que serão utilizadas subsequentemente na cadeia transportadora de elétrons. Além disso, há formação de energia (captada em guanosina trifosfato – GTP) na passagem de succinil-CoA para succinato, que posteriormente é transferido para a adenosina trifosfato (ATP).

Os elétrons carregados pelas coenzimas NADH e FADH2 (provenientes da via glicolítica e do ciclo de Krebs), ao entrarem na cadeia transportadora, vão gradativamente liberando energia ao passarem de um nível de maior energia para um de menor energia. Essa energia liberada é então utilizada para a síntese de ATP a partir da junção de ADP + Pi (fosforilação oxidativa) pela enzima ATP-sintase ou F 1F0-

ATPase (Figura 6.4). Como aceptor final dos elétrons, temos o oxigênio molecular, que se torna reduzido formando água; portanto, todo o processo é dito aeróbico.

A respiração aeróbica, em células eucarióticas, é um processo altamente rentável, pois a metabolização completa de uma molécula de glicose seria capaz de gerar um ganho final de 30 a 32 moléculas ATP, ao passo que, no processo fermentativo teríamos a produção de apenas 2 moléculas de ATP, já que grande parte da energia original da molécula do açúcar permanece nas ligações químicas dos produtos orgânicos finais, como o ácido láctico ou o etanol.