Microscópio eletrônico

O sistema de iluminação a laser promove um feixe de iluminação

extremamente fino (Figura 4.41) que vai se deslocando sobre a amostra ponto por ponto, e por este motivo o microscópio confocal é corretamente denominado microscópio confocal de varredura a laser (LSCM – laser

scanning confocal microscopy) (Figura 4.42). Uma das vantagens deste tipo de iluminação é que o feixe de laser percorre somente a região da amostra que está sob observação (o ponto de luz é focado sobre um único ponto do espécime), conservando a fluorescência das outras regiões que não estão sendo observadas. A imagem produzida de cada plano de foco pelo sistema confocal não recebe a influência da marcação de regiões acima ou abaixo deste plano e recebe a denominação de corte óptico.

Os cortes ópticos só são conseguidos com a utilização de um sistema de

aberturas extremamente pequenas denominadas pinholes (ver Figura 4.42). O microscópio confocal foi idealizado, em 1955, por Marvin Minsky, que desejava ver imagens de eventos biológicos que ocorriam no interior de tecidos vivos.

Microscópio eletrônico

O desenvolvimento do microscópio eletrônico tem suas raízes nos trabalhos de Abbe e Helmhotz, que, de maneira independente, em 1873, descobriram que a resolução de um microscópio dependia do comprimento de onda da fonte de energia. Foi uma ideia, sem dúvida, bastante inovadora, considerando que os elétrons ainda não haviam sido descobertos. Mais tarde demonstrou-se (Thompson, em 1897) que partículas carregadas negativamente (elétrons) faziam parte da matéria, que os elétrons tinham propriedades de uma onda (De Broglie, vencedor do Prêmio Nobel de Física em 1929) e que a trajetória de elétrons podia ser desviada por campos magnéticos da mesma maneira que a luz pode ser desviada por lentes (Bush, em 1926). Em 1932, Knoll e Ruska desenvolveram o primeiro microscópio eletrônico que então começou a ser comercializado em 1939. Somente em 1963 os microscópios eletrônicos de transmissão alcançaram o limite de resolução de 0,2 a 0,3 nm e de 10 nm para o microscópio eletrônico de varredura. Atualmente, o limite de resolução de microscópios eletrônicos de transmissão chega a ser inferior a 1 Å (0,1 nm), enquanto atinge valores próximos a 1 nm em microscópios eletrônicos de varredura.

Figura 4.41 Comparação de dois tipos de feixes de iluminação de amostras marcadas com fluorocromos. Em A o feixe é alargado, iluminando várias regiões da amostra ao mesmo tempo. Em B um feixe extremamente fino ilumina uma área muito mais limitada. A vantagem do segundo feixe sobre o primeiro é que regiões ao lado do ponto de iluminação não são mantidas sob excitação, fazendo com que a meia-vida do corante fluorescente se prolongue. 1: lamínula; 2: espécime; 3: lâmina de vidro.

Figura 4.42 A. Esquema básico de um microscópio confocal de varredura a laser. Note que a fonte de iluminação envia o feixe de luz monocromático através de uma abertura extremamente pequena em direção ao espelho dicroico. Note também que foram representados 3 raios mostrando planos de focos diferentes. Cada um dos feixes chega ao espelho dicroico e é defletido em direção à objetiva, que concentra cada um dos feixes em locais diferentes da amostra. Ao excitar a amostra contendo o fluorocromo, gera-se fluorescência. O raio de luz fluorescente retorna para dentro da objetiva e é concentrado sob uma segunda abertura (pinhole) no detector, também denominada abertura confocal (no mesmo foco que a primeira). Somente os raios emitidos da região em foco conseguem passar através da segunda abertura. Os outros são eliminados e, dessa maneira, não interferem na formação da imagem. Os raios que saem da segunda abertura alcançam um detector e fotomultiplicador que gera a imagem que vai ser observada em um monitor de vídeo. B. Imagem em microscopia de fluorescência de uma célula de mamífero infectada com o protozoário parasito Trypanosoma cruzi. Em razão da grande intensidade de fluorescência é impossível observar os parasitos individualmente. Essa grande intensidade de fluorescência é obtida pela captação da luz emitida pelo fluorocromo em toda a espessura da amostra. C. Quando a mesma célula é analisada com o módulo confocal, registrando a fluorescência de apenas um plano focal, podemos observar os parasitos individualmente acompanhando a marcação em seu corpo celular (setas) e flagelo (pontas das setas). (Foto: Tecia Ulysses de Carvalho.)

Existem basicamente dois tipos de microscopia eletrônica: de transmissão e de varredura. Cada uma delas fornece um tipo de visão diferente do material a ser estudado, podendo, no entanto, ser utilizadas de maneira complementar.

Microscopia eletrônica de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é muito semelhante à microscopia de luz no que diz respeito à formação da imagem. Os elétrons, assim como a luz no microscópio óptico, necessitam atravessar a amostra

para gerar uma imagem visível (Figura 4.43). A fonte de elétrons de um microscópio de transmissão é um filamento de metal, geralmente tungstênio, também denominado catodo, o qual é aquecido, fazendo com que seus elétrons se desprendam. Este filamento está posicionado no alto e no centro de uma coluna de metal oca denominada coluna do microscópio. Os elétrons que se desprendem do catodo são acelerados em direção ao anodo, em virtude de uma grande diferença de potencial entre esses dois polos: pode variar de 20 kV a 1.000 kV, dependendo do tipo de microscópio de transmissão. A diferença de potencial confere aos elétrons uma aceleração, e eles então migram pela coluna na forma de um feixe de elétrons, atravessando a amostra e gerando uma imagem visível. Para garantir que o feixe de elétrons não sofra desvios pela interação com moléculas de ar, a coluna dos microscópios eletrônicos está sempre em alto vácuo. Para modificar o caminho dos elétrons, garantindo a formação da imagem com diferentes aumentos e a correção das aberrações que são semelhantes às descritas na microscopia de luz, o microscópio eletrônico possui uma série de “lentes” que, na verdade, são bobinas eletromagnéticas. A amostra a ser analisada no microscópio de transmissão é inserida no interior da coluna no caminho dos elétrons. Três considerações devem ser feitas aqui:

Figura 4.43 A. Comparação entre diferentes microscópios. No esquema podem ser reconhecidas algumas diferenças entre o microscópio de luz e o microscópio eletrônico de transmissão. As lentes do microscópio de luz são feitas de vidro, enquanto as dos microscópios eletrônicos são bobinas eletromagnéticas. As amostras são inseridas no interior dos microscópios eletrônicos, o qual se encontra em vácuo. B. Microscópio eletrônico de transmissão.

■ Não se analisa material vivo ao microscópio eletrônico de transmissão,

pois a coluna está em alto vácuo

■ A imagem é formada pela interação dos elétrons com as diferentes

regiões da amostra a ser analisada. Quanto mais espessa ou mais densa

for uma região de uma amostra, mais elétrons vão ser absorvidos ou

mais desvios o feixe de elétrons deve sofrer. Os elétrons que conseguem

atravessar a amostra chegam a uma tela fosforescente, gerando uma

imagem que varia do branco até o preto, com vários tons de cinza

intermediários. As diferentes tonalidades refletem a capacidade de

bloqueio dos elétrons exercida pelas diferentes regiões da amostra. As

que aparecem escuras na imagem são denominadas regiões

eletrondensas, enquanto as mais claras são chamadas de eletronlucentes.

Vários livros-texto mostram imagens de MET coloridas digitalmente

que têm apenas o intuito de facilitar a identificação de regiões da célula

ou de organelas

■ A passagem dos elétrons pela amostra gera alterações devido ao

aquecimento desta. Por esse motivo, imagens de amostras biológicas

observadas ao microscópio eletrônico de transmissão devem ser

adquiridas o mais rapidamente possível. A aquisição de imagens pode

ser feita por negativos fotográficos ou por câmeras digitais acopladas ao

equipamento.

Para que amostras biológicas sejam analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão é necessário que elas sejam fixadas, desidratadas e incluídas em uma resina plástica que servirá como suporte para a obtenção dos cortes a serem inseridos no microscópio. A função da resina plástica é a mesma atribuída à parafina na microscopia óptica. A fixação e a desidratação são necessárias em virtude de a amostra ser inserida em alto vácuo, como relatado anteriormente. A fixação é feita com glutaraldeído ou mistura de glutaraldeído e formaldeído, que garantem uma boa estabilização das proteínas da amostra e do tetróxido de ósmio que estabiliza os lipídios de membrana assim como as proteínas. As amostras são então desidratadas, incluídas em resinas plásticas que, ao se solidificarem, permitem o corte das amostras em seções ultrafinas de 50 a 100 nm de espessura. Os cortes são colocados sobre grades circulares de metal, geralmente cobre, que são inseridas na coluna do microscópio

eletrônico (Figura 4.44).

Para aumentar o contraste de determinadas áreas da amostra, uma vez que o material biológico é pouco eletrondenso, as seções ultrafinas obtidas são contrastadas com soluções contendo metais pesados como o acetato de uranila, que se deposita preferencialmente sobre DNA e RNA, e o citrato de chumbo, que se deposita sobre membranas. O alto número atômico desses metais garante o desvio dos elétrons do feixe, criando áreas mais escuras na amostra. Por isso, qualquer tipo de reação citoquímica (para detecção de atividade enzimática, localização de diferentes componentes da célula) e marcações imunocitoquímicas devem gerar ou utilizar compostos

eletrondensos que não estão presentes nas amostras-controle. A Figura 4.45 mostra a imagem obtida por MET de uma bactéria após a preparação convencional descrita anteriormente.

Figura 4.44 Processamento básico de amostras biológicas para observação ao microscópio eletrônico de transmissão. A. As amostras são fixadas em fixadores como o glutaraldeído o e formaldeído. B. Incluídas em resinas plásticas do tipo epóxi. C. O bloco de resina plástica, juntamente com as amostras incluídas, sofre um primeiro processamento visando selecionar a área de corte. D. A região selecionada no bloco de resina plástica é então cortada em ultramicrótomo, em seções ultrafinas de 60 a 70 nm de espessura. E. As seções ultrafinas são colocadas sobre grades e levadas ao microscópio eletrônico de transmissão.

Microscopia eletrônica de varredura

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma visão das células completamente diferente da daquela observada na MET. Neste tipo de microscopia os elétrons não atravessam a amostra. A imagem é formada pela interação dos elétrons com a superfície da amostra, gerando uma imagem com aspecto tridimensional indicada para a visualização de células

inteiras e tecidos (Figura 4.46).

Da mesma maneira como visto para a MET, a amostra deve ser fixada e desidratada. A fixação é idêntica à mencionada para a microscopia de transmissão, porém, após a desidratação, a secagem da amostra depende de um método especial denominado ponto crítico. Nele, após a amostra ter sofrido desidratação com o uso de álcool ou acetona, ela é colocada no interior de uma câmara na qual todo o líquido desidratante é substituído por

CO líquido, que, então, a uma temperatura de aproximadamente 31°C e a 2

uma pressão de 73 atmosferas, passa do estado líquido para o gasoso tão rapidamente que a célula é seca, permanecendo com a sua arquitetura original. Após a completa secagem pelo ponto crítico, a amostra recebe sobre toda a sua superfície uma camada de ouro de aproximadamente 20 nm de espessura.

A amostra é então inserida no interior da coluna do microscópio que se encontra em alto vácuo, onde um feixe muito fino de elétrons percorre pontualmente a amostra, ou seja, passa lentamente sobre ponto por ponto da sua superfície. A interação dos elétrons do feixe com a camada de ouro da

superfície da amostra gera dois tipos de elétrons (ver Figura 4.46): (a) elétrons secundários – elétrons dos átomos de ouro que, excitados pelo feixe de elétrons do microscópio, projetam-se para fora da camada e são captados por um coletor; (b) elétrons retroespalhados – elétrons do próprio feixe que, após interagirem com os átomos de ouro da superfície da amostra, sofrem desvios de rota e voltam em direção ao feixe. Da mesma maneira são captados por um coletor especial. Qualquer que seja o tipo de elétron captado, eles excitam um cintilador que gera fótons, os quais são então conduzidos por uma fibra óptica para um fotomultiplicador e daí para uma tela (tubo de raios catódicos). As imagens obtidas no microscópio de

varredura podem ser observadas na Figura 4.47.

Figura 4.45 Imagem em MET da bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus. Notar a espessura da parede celular (ponta da seta), assim como a formação do septo durante a divisão celular (seta).

Figura 4.46 Para observação ao microscópio eletrônico de varredura, o espécime recebe uma camada de metal muito fina e é percorrido ponto a ponto pelo feixe de elétrons do microscópio. Os elétrons do feixe interagem com a amostra, provocando a emissão de elétrons da camada metálica que a recobre (elétrons secundários) ou o desvio de elétrons do próprio feixe (elétrons retroespalhados). Detectores específicos para cada tipo de elétron os recolhem e geram uma imagem no monitor de vídeo acoplado ao microscópio. O microscópio de varredura gera imagens em três dimensões com grande profundidade de foco e com uma resolução que varia de 3 a 20 nm.

Figura 4.47 Imagem em MEV. A. Bactérias multicelulares magnetotáticas não cultivadas isoladas da Lagoa de Araruama, RJ. (Foto: Ulysses G. C. Lins.) B. Leptospira interrogans. (Foto: Gustavo M. Rocha.) C. Associação entre bactérias Streptococcus salivarius (S) e Actinomyces naseslundii (A) em placas bacterianas encontradas em dentes.