Antibiogramas

A investigação da penicilina foi estimulada pelo descobrimento do Prontosil (pelo alemão Gerhard Domagk, em 1932), um análogo químico que, mais tarde, comprovou-se similar da sulfonamida. Em 1939, Florey e Chain desenvolveram uma prática pela qual se podiam obter extratos antimicrobianos do fungo Penicillium em grandes quantidades e com pureza suficiente às que eram utilizadas em seres humanos.

Antibiogramas

Fleming associou suas descobertas e desenvolveu o primeiro método na tentativa de estudar a suscetibilidade microbiana aos antibióticos, dando início à prática do que hoje denominamos antibiograma ou teste de sensibilidade a antimicrobianos (TSA).

Antibiogramas são testes com o objetivo de verificar a sensibilidade de determinado microrganismo a vários antibióticos mediante comparação usando um padrão preestabelecido. Uma das funções mais importantes dos laboratórios de análises clínicas e laboratórios hospitalares é a de detectar, por intermédio desses testes, qual a sensibilidade/resistência do microrganismo que está causando infecção diante de vários antibióticos, de modo a escolher o mais adequado. A informação obtida será usada para determinar qual o antimicrobiano e a quantidade necessária a ser usada na quimioterapia. Basicamente existem dois métodos para determinar a sensibilidade de uma bactéria aos agentes antimicrobianos: método da diluição em tubo e método da difusão em disco.

Existem também testes com o objetivo de medir a atividade antimicrobiana de um agente antimicrobiano ou antibiótico. Neste contexto encontramos a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), que especifica qual a menor quantidade do antibiótico necessária para inibir o crescimento de determinado microrganismo, e a determinação da concentração bactericida mínima (CBM), que é a concentração mínima do antibiótico capaz de eliminar todos os microrganismos.

Métodos para antibiogramas

▶ Método da diluição em tubo

São usadas várias diluições do antimicrobiano; pode ser usado para determinar a concentração inibitória mínima ou a concentração bactericida mínima.

■ Concentração inibitória mínima

Neste método são usadas diluições dos antimicrobianos. O objetivo é verificar qual a mais alta diluição (menor concentração do antibiótico) efetiva para prevenir o crescimento do microrganismo. Esse método é bastante usado para determinar o perfil de sensibilidade de patógenos isolados de pacientes e a concentração apropriada para tratamento. Um inóculo padronizado da bactéria é adicionado em tubos contendo várias diluições do antibiótico. O crescimento do microrganismo é avaliado pela turvação ou turbidez, que revela o índice de crescimento em cada tubo. Em seguida os meios são inoculados em novos meios, sem o antimicrobiano, utilizando-se tubos ou microplacas. A concentração inibitória mínima (CIM) vai ser a menor concentração do antibiótico (em μg/mℓ) capaz de inibir o crescimento das bactérias in vitro. O método pode ser feito também utilizando-se placas de Petri com meio novo sem o antimicrobiano. Conhecendo-se a CIM e o nível em que o antibiótico pode ser encontrado nos fluidos corporais como sangue e urina, pode-se escolher o antibiótico apropriado. Geralmente se usa como margem de segurança uma concentração 10 vezes acima do valor da CIM, visto que outros fatores, como a ligação do antibiótico com proteínas séricas ou a presença de inibidores tissulares, podem reduzir a ação do antibiótico.

■ Concentração bactericida mínima

É a mais baixa concentração do antibiótico capaz de eliminar completamente o microrganismo. O procedimento é semelhante ao realizado para a medida da CIM. A diluição do antibiótico que for capaz de eliminar totalmente os microrganismos e impedir que o microrganismo cresça no meio sem o antimicrobiano é considerada a concentração bactericida mínima (CBM). A CBM é mais utilizada para pacientes imunossuprimidos ou em pacientes acometidos por endocardites.

▶ Método difusão em disco | Método de Kirby-Bauer

Nesta prática usaremos o método de Kirby-Bauer, amplamente empregado como padrão para a realização dos antibiogramas. Esse método padronizado é tipicamente utilizado para medir a eficácia de uma variedade de antibióticos sobre uma espécie de microrganismo, com a finalidade de fornecer orientação para a prescrição, na prática médica, da maioria dos antibióticos usados na terapia das infecções bacterianas. É um método qualitativo que usa concentrações preestabelecidas dos antimicrobianos.

No teste de Kirby-Bauer, uma série de antibióticos impregnados em pequenos discos circulares de papel são colocados sobre uma placa contendo meio de cultura crescido com a bactéria inoculada de forma homogênea, como se fosse um “tapete” sobre a superfície do meio. As placas são incubadas em temperatura e tempo adequados para permitir o crescimento da bactéria e também para que os antibióticos possam difundir-se no interior do ágar. Se um organismo for suscetível a um antibiótico, uma zona clara aparece ao redor do disco, onde o crescimento do organismo foi inibido. O tamanho dessa zona de inibição depende da sensibilidade da bactéria a um antibiótico específico e da habilidade de difusão através do ágar do antibiótico contido no disco.

Todas as características no procedimento do teste de Kirby-Bauer são padronizadas para assegurar resultados confiáveis e seguros. Sendo assim, devemos ter muito cuidado na preparação e na realização do teste para assegurar esses padrões preestabelecidos.

O meio de cultura usado, geralmente o ágar Mueller-Hinton, é formulado para ter um pH em torno de 7,2 a 7,4 e ele é depositado em uma placa de Petri a uma profundidade de 4 mm. A inoculação, utilizando um swab de algodão estéril, é feita com um meio de cultura líquido crescido com a bactéria isolada que será testada diluída até ser obtida uma leitura de turbidez próxima de 0,5 de densidade óptica. Esse valor da densidade óptica é obtido com uma escala de turbidez-padrão conhecida como escala McFarland de turbidez e equivale a uma concentração de aproximadamente 108 células/mℓ. O meio é semeado por toda a sua superfície, de forma que todos os espaços sejam preenchidos e o crescimento ocorra sobre todo o meio de cultura.

■ Limitações da prova de Kirby-Bauer

Embora essa prova seja considerada técnica-padrão para a realização do antibiograma, por proporcionar informações úteis na maioria dos casos, ela apresenta algumas limitações:

■ As técnicas de difusão não são aplicáveis a microrganismos de crescimento lento. Se

for necessária uma incubação prolongada para a obtenção de um crescimento

satisfatório e, assim, constatar-se um halo de inibição detectável, o antibiótico pode

deteriorar-se a ponto de gerar leituras imprecisas

■ Para os antibióticos que se difundem lentamente no ágar, tais como a polimixina B,

pode haver grandes variações nos valores da CIM antes que se possam observar

variações significativas nas medidas das zonas de inibição. Um aumento na

concentração do disco (p. ex., 300 μg/mℓ) poderia corrigir essa dificuldade de difusão.

Entretanto, os resultados podem não ser fidedignos para esses antibióticos de migração

lenta, sendo necessário, portanto, utilizar controles com várias concentrações dos

antibióticos em questão.